CN113666816B - 具有抗肿瘤活性的京大戟二萜类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了具有抗肿瘤活性的京大戟二萜类新化合物及其制备方法。体外抗肿瘤活性研究表明，本发明提供的京大戟二萜类化合物对多种肿瘤细胞，包括淋巴瘤、结肠癌或白血病等均具有很强的抗肿瘤活性，可开发成新的抗肿瘤药物。本发明提供的制备方法工艺设计合理。

Description

具有抗肿瘤活性的京大戟二萜类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及具有抗肿瘤活性的化合物，具体涉及从中药京大戟中提取的得到的具有抗肿瘤活性的京大戟二萜类化合物新化合物，属于医药技术领域。
背景技术
京大戟(Euphorbia pekinensis Radix)为大戟科多年生草本植物大戟(Euphorbia pekinensisRupr.)的干燥根，具有泻水逐饮，消肿散结之功效。主要用于水肿胀满，胸腹积水，痰饮积聚，气逆咳喘，二便不利，痈肿疮毒，瘰疬痰核。研究表明，京大戟主要生物活性成分为二萜类成分，另外该属植物中还含有三萜、黄酮、鞣质和酸类化合物等成分。本发明对京大戟中的有效成分深入研究，分离纯化得到新的具有抗肿瘤活性的二萜类成分。
发明内容
发明目的：本发明的目的是对京大戟中的有效成分进行深入研究，分离纯化得到新的具有抗肿瘤活性的二萜类成分。本发明另外一个目的是提供其制备方法。
技术方案：为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：
具有抗肿瘤活性的京大戟二萜类化合物，其结构式如下：
Figure BDA0003238538470000011
作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤活性的京大戟二萜类化合物，其包括如下结构式的化合物：
Figure BDA0003238538470000021
本发明所述的具有抗肿瘤活性的京大戟二萜类化合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)提取：
取京大戟药材，加入乙醇回流提取，得到乙醇提取液；
(2)萃取：
将步骤(1)京大戟乙醇提取液浓缩至无醇味，用水混悬，加入等体积乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，得浸膏；
(3)分离
取浸膏经中压硅胶柱色谱分离，石油醚-乙酸乙酯体系梯度洗脱，得到馏分JDJ-EA-11和JDJ-EA-20；
取馏分JDJ-EA-11经Sephadex LH-20分离，二氯甲烷-甲醇洗脱，得到馏分JDJ-EA-11S3；将该馏分经Pre-HPLC分离，得到馏分JDJ-EA-11S3P4、JDJ-EA-11S3P5、JDJ-EA-11S3P9、JDJ-EA-11S3P11、JDJ-HEN-EA-10S9；
取馏分JDJ-EA-11S3P4经Semi-pre-HPLC和SFC手性分离，得到化合物(1)；
馏分JDJ-EA-11S3P5经Semi-pre-HPLC和SFC手性分离，得到化合物(2)；
馏分JDJ-HEN-EA-10S9经Semi-pre-HPLC和SFC手性分离，得到化合物(3)。
作为更加优选的方案，以上所述的具有抗肿瘤活性的京大戟二萜类化合物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)提取：
取京大戟药材，加入4～12倍量体积浓度80～95％乙醇回流提取1～3次，每次1～2h，得乙醇提取液。
(2)萃取
将步骤(1)乙醇提取液浓缩至无醇味，加水混悬，加入等体积乙酸乙酯萃取2～4次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，得浸膏；
(3)分离
取步骤(2)浸膏，经中压硅胶柱色谱分离，用体积比100:0-0:100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到馏分JDJ-EA-11和JDJ-EA-20；
取馏分JDJ-EA-11经Sephadex LH-20分离，用体积比1:1的二氯甲烷-甲醇体系洗脱，得到馏分JDJ-EA-11S3；将该馏分经Pre-HPLC分离，得到馏分JDJ-EA-11S3P4、JDJ-EA-11S3P5、JDJ-EA-11S3P9、JDJ-EA-11S3P11、JDJ-HEN-EA-10S9；
取馏分JDJ-EA-11S3P4经Semi-pre-HPLC和SFC手性分离，得到化合物(1)：
取馏分JDJ-EA-11S3P5经Semi-pre-HPLC和SFC手性分离，得到化合物(2)；
取馏分JDJ-HEN-EA-10S9经Semi-pre-HPLC分离，得到化合物(3)。
作为优选方案，以上所述的具有抗肿瘤活性的京大戟二萜类化合物的制备方法，
化合物(1)SFC手性分离条件：
仪器：Waters SFC80 preparative SFC；色谱柱：DAICEL CHIRALPAK IG，规格250mm*30mm,10um；流动相：A相为CO2，B相为MeOH，流速：60g/min；检测波长：210nm；梯度方式：30％-30％A，柱温：40℃；
化合物(2)Semi-pre-HPLC分离的条件为：
仪器：Gilson GX-281Semi-prep-HPLC System，色谱柱：Phenomenex luna C18(2)，规格250×21.2mm,5μm；流动相：A相为水，B相为甲醇；流速：15ml/min；检测波长：210nm和285nm；梯度洗脱方式：70％-100％A 12min；100％-100％A 9min；柱温为室温；
化合物(2)SFC手性分离条件：
仪器：Waters SFC80 preparative SFC；色谱柱：DAICEL CHIRALPAK IG，规格250mm*30mm,10um；流动相：A相为CO2，B相为MeOH，流速：70g/min；检测波长：210nm；梯度方式：40％-40％A，柱温：40℃；
化合物(3)Pre-HPLC分离的条件为：
仪器：Shimadzu LC-20AP Large Scale Preparative System，色谱柱：DaisoODS-C18300(50mm,10um；流动相：A相为水，B相为乙腈；流速：80ml/min；检测波长：220nm和285nm；梯度洗脱方式：40％-40％A 5min、40％-80％A 30min、80％-80％A 10min；柱温为室温。
本发明采用CCK8方法检测分离得到的3个新的二萜类化合物，显示出对淋巴瘤、结肠癌或白血病等肿瘤细胞就有较好的抑制作用，可开发为抗肿瘤的药物。
本发明可将大戟二萜类化合物和药学上可接受的载体制备成片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、滴丸、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。
有益效果：本发明提供的具有抗肿瘤活性的京大戟二萜类化合物和现有技术相比具有以下优点：
本发明通过对京大戟化学成分进行系统深入研究，经过波谱和质谱数据分析表明从京大戟根中分离得到3个新的京大戟二萜类化合物。且经过体外抗肿瘤活性研究表明，本发明提供的京大戟二萜类化合物对多种肿瘤细胞，包括淋巴瘤、结肠癌或白血病等恶性肿瘤均具有很强的抗肿瘤活性，可开发成新的抗肿瘤药物。
附图说明
图1为化合物1的关键HMBC相关性示意图；
图2为化合物2的关键HMBC相关性示意图；
图3为化合物3的关键HMBC相关性示意图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1
具有抗肿瘤活性的京大戟二萜类化合物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)提取：
取京大戟药材14kg，加入4倍量体积浓度95％乙醇回流提取2次，每次2h，得乙醇提取液。
(2)萃取
将步骤(1)乙醇提取液浓缩至无醇味，加3.0L水混悬，加入等体积乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯层，45℃减压浓缩，得浸膏330g；
(3)分离
取步骤(2)浸膏，经中压硅胶柱色谱分离，用体积比100:0-0:100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到馏分JDJ-EA-11和JDJ-EA-20；
取馏分JDJ-EA-11经Sephadex LH-20分离，用体积比1:1的二氯甲烷-甲醇体系洗脱，得到馏分JDJ-EA-11S3；将该馏分经Pre-HPLC分离，得到馏分JDJ-EA-11S3P4、JDJ-EA-11S3P5、JDJ-EA-11S3P9、JDJ-EA-11S3P11、JDJ-HEN-EA-10S9；
取馏分JDJ-EA-11S3P4经Semi-pre-HPLC和SFC手性分离，得到化合物(1)，纯度：98.17％)；化合物(1)的结构解析为：白色粉末，HR-ESIMS(positive)给出准分子离子峰m/z:[M+H-H2O]+287.2352，(Calcd.287.2375)，确定分子式C20H32O2。
1HNMR(CDCl3,400MHz)中，δH0.74(3H,s)，δH1.04(3H,s)，和δH1.28(3H,s)是3个角甲基氢信号，δH5.06(1H,dd,J＝10.8Hz，1.2Hz)，δH5.22(1H,dd,J＝17.2Hz，1.2Hz)，δH5.93(1H,J＝17.2Hz,10.8Hz)是末端双键亚甲基和次甲基氢信号，δH4.57(1H,d,J＝1.2Hz)和δH4.85(1H,d,J＝0.8Hz)为末端双键氢信号，推测为半日花烷类二萜。13CNMR(CDCl3,400MHz)中，其中δC206.5是羰基碳信号，δC147.5，δC145.2，δC111.6和δC107.6是四个双键碳信号，δC73.5是连氧碳信号。分析化合物数据与化合物12数据的相似，化合物11在1HNMR中多了1个δH9.23(1H，s)醛基氢信号，少1个亚甲基氢信号。
在HMBC谱(如图1)中，19-CH3(δH1.04)与C-18(δC206.5)，C-3(δC32.4)，C-5(δC47.6)相关，17-CH2(δH4.57，4.85)与C-7(δC37.7)，C-9(δC57.1)相关，16-CH3(δH1.29)与C-12(δC41.1)，C-14(δC145.2)相关，20-CH3(δH0.75)与C-1(δC38.0)，C-5(δC47.6)，C-9(δC57.1)相关确定化合物11的平面结构。结合2DNMR，对化合物的氢、碳信号进行了全归属(如表1)。
表1化合物1的1H和13C-NMR数据(CDCl3-d,400MHz)
Figure BDA0003238538470000051
Figure BDA0003238538470000061
取馏分JDJ-EA-11S3P5经Semi-pre-HPLC和SFC手性分离，得到化合物(2)；
化合物2的结构解析为：白色粉末，
Figure BDA0003238538470000062
(氯仿，c＝0.616g/100ml)；HR-ESIMS(negative)给出准分子离子峰m/z:[M-H]-347.2608，(Calcd.347.2586)，确定分子式C22H36O3。
1HNMR(CDCl3,400MHz)中，δH0.72(3H,s)，δH0.82(3H,s)和δH1.28(3H,s)是3个角甲基氢信号，δH2.07(3H,s)是乙酰基中的甲基氢信号，δH5.06(1H,d,J＝10.6Hz)，δH5.21(1H,d,J＝17.2Hz)，δH5.92(1H,J＝17.2Hz,10.8Hz)是末端双键亚甲基和次甲基氢信号，δH4.55(1H,s)和δH4.85(1H,s)为末端双键氢信号，推测为半日花烷类二萜。13CNMR(CDCl3,400MHz)中，其中δC171.2是乙酰基碳信号，δC148.0，δC145.3，δC111.5和δC106.8是四个双键碳信号，δC20.9是乙酰基中的甲基碳信号。
在HMBC谱(如图2)中，2'-CH3(δH2.07)氢信号与C-18(δC72.9)相关，18-CH2(δH3.65)氢信号与C-5(δC49.5)相关，20-CH3(δH0.72)氢信号与C-1(δC38.5)，C-5(δC49.5)相关，7-CH2(δH1.95)氢信号与C-5(δC49.5)，C-9(δC57.3)，C-17(δC106.8)相关，15-CH2(δH5.06,5.21)氢信号与C-14(δC41.3)，C-16(δC27.7)相关，确定化合物2的平面结构。结合2DNMR谱，对化合物的氢、碳信号进行了全归属(表2)。
表2化合物2的1H和13C-NMR数据(CDCl3-d,400MHz)
Figure BDA0003238538470000071
Figure BDA0003238538470000081
取馏分JDJ-HEN-EA-10S9经Semi-pre-HPLC分离，得到化合物(3)。
化合物(3)的结构解析为：白色固体，HR-ESIMS(negative)给出准分子离子峰m/z:[M-H]-457.2601，(Calcd.457.2590)，确定分子式C27H38O6。
1HNMR(MEOD,400MHz)中，δH0.77(3H,s)，δH0.91(3H,s)，和δH1.24(3H,s)是3个角甲基氢信号，δH5.03(1H,dd,J＝10.8Hz，1.2Hz)，δH5.19(1H,dd,J＝17.6Hz,1.6Hz)，δH5.90(1H,dd,J＝10.8Hz,17.2Hz)是末端双键的亚甲基和次甲基氢信号，δH4.56(1H,s)和δH4.82(1H,s)为末端双键氢信号，推测化合物为半日花烷类二萜。进一步分析氢谱和碳谱数据，δH7.08(1H,s)，δC168.6，δC110.1，δC120.5，δC139.9,δC146.7和δC146.8提示化合物含有没食子酸基团。
在HMBC谱(如图3)中，18-CH2(δH3.78，δH4.04)与C-1”(δC168.6)，C-3(δC37.5)，C-5(δC51.1)相关，16-CH3(δH1.24)与C-12(δC42.6)，C-14(δC146.7)相关，17-CH2(δH4.56，δH4.82)与C-9(δC58.9)，C-7(δC39.2)相关，20-CH3(δH0.77)与C-9(δC58.9)，C-5(δC51.1)相关，进而确定了化合物3的平面结构，结合2DNMR谱，对化合物的氢、碳信号进行了全归属(表3)。在NOESY谱中，19-CH3(δH0.91)与H-5(δH1.60)，16-CH3(δH1.24)与H-14(δH5.90)，20-CH3(δH0.77)与H-11(δH1.42)存在NOE效应。
通过X-ray单晶衍射确认绝对构型为4S5S9R10S13R，经Scifinder数据库检索，该化合物为新化合物。
表3.化合物3的1H和13C-NMR数据(MeOD-d4,400MHz)
Figure BDA0003238538470000082
Figure BDA0003238538470000091
以上所述的化合物(1)SFC手性分离条件：
仪器：Waters SFC80 preparative SFC；色谱柱：DAICEL CHIRALPAK IG，规格250mm*30mm,10um；流动相：A相为CO2，B相为MeOH，流速：60g/min；检测波长：210nm；梯度方式：30％-30％A，柱温：40℃；
化合物(2)Semi-pre-HPLC分离的条件为：
仪器：Gilson GX-281Semi-prep-HPLC System，色谱柱：Phenomenex luna C18(2)，规格250×21.2mm,5μm；流动相：A相为水，B相为甲醇；流速：15ml/min；检测波长：210nm和285nm；梯度洗脱方式：70％-100％A 12min；100％-100％A 9min；柱温为室温；
化合物(2)SFC手性分离条件：
仪器：Waters SFC80 preparative SFC；色谱柱：DAICEL CHIRALPAK IG，规格250mm*30mm,10um；流动相：A相为CO2，B相为MeOH，流速：70g/min；检测波长：210nm；梯度方式：40％-40％A，柱温：40℃；
化合物(3)Pre-HPLC分离的条件为：
仪器：Shimadzu LC-20AP Large Scale Preparative System，色谱柱：DaisoODS-C18300(50mm,10um；流动相：A相为水，B相为乙腈；流速：80ml/min；检测波长：220nm和285nm；梯度洗脱方式：40％-40％A 5min、40％-80％A 30min、80％-80％A 10min；柱温为室温。
实施例2体外抗肿瘤试验
1、实验材料
RPMI1640(Biological Industries，货号：01-100-1ACS)，IMDM(BiologicalIndustries，货号：01-058-1ACS)，DMEM(Biological Industries，货号：06-1055-57-1ACS)，Fetal Bovine Serum(Biosera，货号；FB-1058/500)，CCK8(陶素，货号：C0005)，胰酶EDTA溶液0.25％(源培，货号：S310KJ)，DMSO(国药，货号：30072418)，Staurosporine(陶素，货号：T6680)，紫杉醇(鼎科医疗)，384孔细胞培养板(BIOFIL，货号：TCP-011-384)，EnVision，PerkinElmer
2、实验方法
2.1细胞及传代
慢性粒细胞白血病K562(细胞培养基，IMDM+10％FBS+1％P/S)，组织细胞淋巴瘤U-937(RPMI1640+10％FBS+1％P/S)，结直肠癌LOVO(DMEM+10％FBS+1％P/S)。
细胞传代：当细胞长满培养皿80～90％，用0.25％胰酶消化细胞，然后用新的培养基将细胞重悬，将细胞按适当比例传代。
2.2细胞接种及药物处理
化合物工作液浓度的配制
根据检测要求，将实施例1三个化合物储存液用100％DMSO进行2倍梯度稀释，即取20uL 20mM化合物加到20uL100％DMSO中，2倍稀释，稀释10个点，用培养基稀释成5倍工作液备用；紫杉醇用100％DMSO稀释至20mM，然后用100％DMSO进行5倍梯度稀释，稀释10个点，用培养基稀释成5倍工作液备用。
2.3细胞接种及药物处理
检测前1天，将K562细胞按4000细胞/孔，接种于384孔细胞板中，每孔接种40uL细胞悬液，细胞板置于37℃，5％CO2培养箱，孵育过夜。
检测前1天，将U-937细胞按2000细胞/孔，接种于384孔细胞板中，每孔接种40uL细胞悬液，细胞板置于37℃，5％CO2培养箱，孵育过夜。
检测前1天，将LOVO细胞按500细胞/孔，接种于384孔细胞板中，每孔接种40uL细胞悬液，细胞板置于37℃，5％CO2培养箱，孵育过夜。
实验当天，根据实验要求，每孔分别加入10uL化合物工作液，37℃，5％CO2培养箱，避光孵育72小时。
结束孵育后，细胞加入CCK8，5uL/孔，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育4小时。在EnVision上测定450nm波长处的吸光度，计算抑制率。
3、计算方法
％抑制率＝(ODs-ODNC)/(ODSTSP-ODNC)×100％
其中：
ODS：样品孔的吸光值(待测化合物)
ODNC：阴性孔吸光值(细胞+培养基+DMSO)
ODSTSP:STSP孔吸光值(细胞+培养基+10uM STSP)。
4、实验结果
本发明采用CCK8方法检测以上3个二萜类化合物在白血病K562、淋巴瘤U-937、结肠该LOVO细胞上的活性测试，获得化合物的IC50值。3个化合物均检测初始浓度为100uM，往下2倍梯度稀释，测10个浓度，双复孔测试；阳性对照孔紫杉醇梯度组，检测初始浓度为100uM，往下5倍梯度稀释，测10个浓度，双复孔测试；STSP对照、DMSO溶剂对照和培养基空白对照孔，各10个。结果显示3个化合物在K562、U-937、LOVO细胞上均有较好的抑制作用。如下表4所示。
表4 3个化合物对K562、U-937、LOVO细胞的抑制作用
Figure BDA0003238538470000121
以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种具有抗肿瘤活性的京大戟二萜类化合物，其特征在于，其结构式如下：
Figure FDA0004242813580000011
2.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的京大戟二萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取：
取京大戟药材，加入4～12倍量体积浓度80～95％乙醇回流提取1～3次，每次1～2h，得乙醇提取液；
(2)萃取
将步骤(1)乙醇提取液浓缩至无醇味，加水混悬，加入等体积乙酸乙酯萃取2～4次，合并乙酸乙酯层，减压浓缩，得浸膏；
(3)分离
取步骤(2)浸膏，经中压硅胶柱色谱分离，用体积比100:0-0:100的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得到馏分JDJ-EA-11和JDJ-EA-20；
取馏分JDJ-EA-11经Sephadex LH-20分离，用体积比1:1的二氯甲烷-甲醇体系洗脱，得到馏分JDJ-EA-11S3；将该馏分经Pre-HPLC分离，得到馏分JDJ-EA-11S3P4、JDJ-EA-11S3P5、JDJ-EA-11S3P9、JDJ-EA-11S3P11、JDJ-HEN-EA-10S9；
取馏分JDJ-HEN-EA-10S9经Semi-pre-HPLC分离得到化合物(3)；所述的Pre-HPLC分离的条件为：
仪器：Shimadzu LC-20AP Large Scale Preparative System，色谱柱：Daiso ODS-C18300×50mm,10um；流动相：A相为水，B相为乙腈；流速：80ml/min；检测波长：220nm和285nm；梯度洗脱方式：40％-40％A 5min、40％-80％A 30min、80％-80％A 10min；柱温为室温。
3.权利要求1所述的具有抗肿瘤活性的京大戟二萜类化合物在制备抗淋巴瘤、结肠癌或白血病的药物中的应用。
4.根据权利要求3的应用，将京大戟二萜类化合物和药学上可接受的载体制备成片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、滴丸、软膏剂或透皮控释贴剂剂型的药物。
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