CN114874098B - 一种从宿萼木中提取分离的化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种从宿萼木中提取分离的化合物及其制备方法和应用，化合物分子式为C20H24O4，命名为strophiofimbrin A，是一个具有新型5/6/7环系统的降二萜结构。首先将宿萼木干燥药材用95％乙醇提取后，过滤，合并滤液，再减压浓缩干燥，获得95％乙醇提取物；然后将95％乙醇提取物加水分散，并以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位；最后将乙酸乙酯部位进行色谱分离纯化，得到从宿萼木中提取分离的化合物。经研究发现本发明的新化合物对HeLa、HepG2、HCT116肿瘤细胞具有潜在的细胞毒活性。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域，尤其涉及从宿萼木药材中提取、分离和鉴定出的新化合物及其分离方法，具体为一种从宿萼木中提取分离的化合物及其制备方法和应用。
背景技术
宿萼木(Strophioblachia fimbricalyx Boerl.)为大戟科宿萼木属多年生灌木植物。主要分布于中国海南，云南，广西以及泰国。泰国民间用于治疗癌症，发烧，偏头痛等。
然而国内外关于宿萼木的化学成分的报道较少。目前，主要报道从中分离得到变形菲、萜类，黄酮苷等三十多个化合物，物质基础尚不明确。因此亟待对宿萼木的化学成分进行深入研究，发现结构新颖的活性成分，以明确药效基础或拓展相关应用。
发明内容
本发明目的在于针对上述问题，提供一种从宿萼木中提取分离的化合物及其制备方法和应用，经研究发现本发明的新化合物对HeLa、HepG2、HCT116细胞具有潜在的细胞毒活性。同时提供一种针对本发明新化合物的简便、快速、纯度高的提取分离方法。
本发明的目的是这样实现的：一种从宿萼木中提取分离的化合物，所述化合物的分子式为C20H24O4，其化学结构式如下：
从宿萼木中提取分离的化合物的制备方法，包括以下步骤：
A)、将宿萼木干燥药材用95％乙醇提取后，过滤，合并滤液，再减压浓缩干燥，获得95％乙醇提取物；
B)、将95％乙醇提取物加水分散，并以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位；
C)、将乙酸乙酯部位进行色谱分离纯化，得到从宿萼木中提取分离的化合物。
所述乙酸乙酯部位进行色谱分离纯化的步骤为：
1)、将乙酸乙酯部位在硅胶上进行柱层析，用体积比为30∶1～0∶1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，获得石油醚-乙酸乙酯洗脱物；
2)、取石油醚-乙酸乙酯洗脱物再进行硅胶柱层析，用体积比为1∶0～0∶1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得二氯甲烷-甲醇洗脱物；
3)、取二氯甲烷-甲醇洗脱物进行MCI柱色谱分离，用体积比为2∶8～0∶1的甲醇-水梯度洗脱，得到甲醇-水洗脱物；
4)、取甲醇-水洗脱物经半制备高效液相色谱纯化，用60％甲醇洗脱，从甲醇-水洗脱液中得到纯的化合物。
步骤C)中，乙酸乙酯部位进行色谱分离纯化的具体步骤为：
用体积比为30∶1～0∶1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，合并后得11个流份；流份11经硅胶柱层析，用体积比为1∶0～0∶1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，合并后得9个流份；流份1经MCI柱层析，用体积比为2∶8～0∶1的甲醇-水梯度洗脱，合并后得10个流份；流份10经半制备高效液相色谱纯化，用甲醇洗脱，收集主峰，得到从宿萼木中提取分离的化合物。
步骤1)中，体积比为30∶1、15∶1、8∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、0∶1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱。
步骤2)中，体积比为1∶0、50∶1、30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱。
步骤3)中，体积比为2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、1∶0的甲醇-水梯度洗脱。
从宿萼木中提取分离的化合物或其互变异构体、区域异构体、立体异构体、对映异构体、非对映异构体或药学上可接受的盐在制备用于抗肿瘤药物中的应用。
本发明方法先进科学，通过本发明，提供一种从宿萼木中提取分离的化合物及其制备方法和应用，化合物分子式为C20H24O4，命名为strophiofimbrin A。经研究发现本发明的新化合物对HeLa、HepG2、HCT116肿瘤细胞具有潜在的细胞毒活性。
与现有技术相比，本发明具备以下优点：
本发明中所述宿萼木中新化合物的分离纯化和生物活性研究未被现有论文期刊所报道；本发明提供来源于宿萼木的新化合物及一种针对本发明新化合物的提取分离纯化方法，采用醇提取、硅胶柱层析、MCI柱层析及半制备HPLC进行分离纯化，成功获得新的化合物，操作方法简便及快速，且经该方法分离得到的化合物纯度较高，均大于95％，此外经研究表明以上化合物具有潜在的肿瘤细胞毒活性，可用于制备抗肿瘤药物。
附图说明
图1为新化合物strophiofimbrin A的1H-NMR谱图；
图2为新化合物strophiofimbrin A的13C-NMR谱图；
图3为新化合物strophiofimbrin A的HMBC谱图；
图4为新化合物strophiofimbrin A的HSQC谱图；
图5为新化合物strophiofimbrin A的1H-1H COSY谱图；
图6为新化合物strophiofimbrin A的NOESY谱图；
图7为新化合物strophiofimbrin A的高分辨质谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步说明。
实施例1新化合物的制备；
材料来源宿萼木药材于2017年2月采于海南三亚，标本保存于扬州大学医学院药学系中药标本馆。
提取分离：将宿萼木药材18kg，剪碎，95％乙醇85℃回流提取4次，合并提取液，减压浓缩干燥，得到总浸膏(472g)。将总浸膏用10倍量的蒸馏水分散，依次用等体积石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位(123g)、乙酸乙酯部位(55g)和正丁醇部位(130g)。将乙酸乙酯部位浸膏进行硅胶柱层析，用体积比为(30∶1)～(0∶1)的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，合并后得11个流份；流份11经硅胶柱层析，用体积比为(1∶0)～(0∶1)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，合并后得9个流份；流份1经MCI柱层析，用体积比为(2∶8)～(0∶1)的甲醇-水梯度洗脱，合并后得10个流份；流份10经半制备高效液相色谱纯化，用60％甲醇洗脱，收集主峰，得到该化合物。
实施例2新化合物的结构鉴定；
本发明实施例1制备的新化合物为白色固体。高分辨质谱给出准分子离子峰m/z351.1572[M+Na]+(计算值351.1567)，结合1H-NMR和13C-NMR确定该化合物的分子式为C20H24O4，计算不饱和度为9。1H、13C-NMR和HSQC显示四个甲基(两个甲氧基)、四个亚甲基(其中一个为烯)、四个次甲基(其中两个为烯)和八个季碳(两个羰基和五个为烯)。根据分析，从Me-18(δH 1.87)到C-4(δC147.1)、C-19(δC 114.2)和C-5(δC 51.8)，从末端烯烃亚甲基H-19到Me-18、C-4(δC147.1)、C-19(δC 114.2)和C-5(δC 51.8)，及从OMe-3(δH 3.70,3H,s)到C-3(δC177.4)的HMBC相关数据，可以证实存在典型的异丙烯基(δH 4.85,5.00，2H，s；δC114.2,147.1；δH 1.87，3H，s；δC 24.2)和甲基酯羰基(δC 177.4,52.5)。其余五个烯烃季碳(δC 177.5、164.3、160.8、146.5和138.4)和两个烯烃次甲基(δH 7.05和7.23，2H、d、J＝10.2Hz)构成另外三对双键和一个共轭羰基(δC177.5)。上述官能团占9个不饱和度中的6个。因此，剩余的3个不饱和度要求是分子中的三环系统。
在HMBC谱中，相关性起源于Me-20(δH 1.11)到C-5、C-9，从典型异丙烯基的Me-18和H-19到C-5，从H-5(δH 2.44)到C-4、C-10和C-20，从H-7(δH 3.11,2.92)到C-5、C-6、C-8和C-9，以及连续相关性1H-1H COSY谱中的H-5/H-6α/H-7α/H-7β(图2)，建立了由C-10处的甲基和典型的异丙烯基取代的六元碳环B的片段C-5，它是三环结构的部分链段。1H-1H COSY谱还显示存在一个自旋系统H-2/H-1α/H-1β，以及从H-2(δH 4.15)到C-1、C-11和甲酸甲酯基团C-3的HMBC相关性3个，从Me-20到C-1和C-9，从H-1(δH 2.25,2.01)到C-20、C-9、C-11和C-3，构建了一个五元环A，在C-2处被甲基酯羰基取代，它与环B在共同的C-9和C-10处结合。然后，通过对α，β不饱和酮基团(δC 160.8，C-9；δC 146.5，C-11；δC 177.5，C-17或δC 115.1，C-13；δC 164.3,C-12；δC 177.5,C-17)和从其他OMe-12到C-12(δC 164.3)，从两个烯属次甲基H-13(δH 7.05)到C-8,C-12和C-17，以及H-14(δH 7.23)到C-9和C-12，以及一个自旋系统H-13/H-14的HMBC相关性的综合分析，构建了七元环C。H-14/C-7、H-7/C-14和H-2/C-17的HMBC交叉峰进一步表明环C与环B共享C-8和C-9，与环A共享C-9和C-11。
其相对构型由ROESY谱推断。H-2化学位移较大的质子(δH 4.15)被随机分配为α方向。H-2/H-1α和H-2/Me-20具有较强的ROESY相关性，且均为α取向。H-5/H-1β的ROESY相关性表明H-5的取向为β取向。Me-20/H-1α和Me-20/H-19的ROESY交叉峰进一步表明，H-2和Me-20为α取向，H-5为β取向。
综上，确定了该化合物的平面结构和相对构型，并命名为strophiofimbrin A，是一个具有新型5/6/7环系统的降二萜结构。表1为该新化合物的1H-NMR与13C-NMR数据。
结构相关信号解析：
表1：本发明新化合物strophiofimbrin A的1H-NMR(600MHz,MeOD)和13C-NMR(150MHz，MeOD)数据
实施例3新化合物的抗肿瘤活性测试
人宫颈癌HeLa、人肝癌HepG2和人结肠癌HCT116细胞购自中科院上海细胞库，用含10％胎牛血清、1％青霉素和链霉素的DMEM完全培养液，于37℃，5％CO2培养箱中培养传代。取对数生长期的HeLa、HepG2、HCT116细胞接种于96孔板，每孔约5×104个细胞，培养24h后加药，实验组每孔分别加入1μL浓浓度分别为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL和4mg/mL的样品，阳性对照组加入对应浓度的顺铂，阴性对照组同样加入1μL的DMSO，每组设3个复孔，放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。作用24小时后，每孔加入10μL的CCK-8溶液，放入培养箱中孵育2h，在酶标仪450nm波长处测吸光度(OD值)。试验重复三次，并进一步计算其IC50值。以顺铂为阳性对照药物。
抑制率＝[1-(OD给药组/OD对照组)]×100％。其中OD给药组为加strophiofimbrin A的给药组OD值，OD对照组为不加strophiofimbrin A的对照组OD值。
实验结果显示本发明新化合物对HeLa、HepG2、HCT116细胞的IC50值分别为45.38±0.20μM、85.96±4.37μM、71.65±0.51μM，阳性对照药顺铂对Hela、HepG-2、HCT116细胞的IC50值分别为37.60±1.90μM、44.66±1.13μM、49.93±3.51μM，具体见表2。说明strophiofimbrin A对上述两种肿瘤细胞具有细胞毒活性，可用于制备抗结肠癌、宫颈癌和肝癌的药物。
表2.化合物strophiofimbrin A的肿瘤抑制率(IC50，μM)
Data are presened as Mean±SD，n＝3.*p<0.05，**p<0.01，compared withCisplatin control。
Claims (7)
1.一种从宿萼木中提取分离的化合物，其特征在于，所述化合物的分子式为C20H24O4，其化学结构式如下：
2.权利要求1所述从宿萼木中提取分离的化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)、将宿萼木干燥药材用95％乙醇提取后，过滤，合并滤液，再减压浓缩干燥，获得95％乙醇提取物；
B)、将95％乙醇提取物加水分散，并以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到石油醚部位、乙酸乙酯部位和正丁醇部位；
C)、将乙酸乙酯部位进行色谱分离纯化，得到从宿萼木中提取分离的化合物；
步骤C)中，所述乙酸乙酯部位进行色谱分离纯化的步骤为：
1)、将乙酸乙酯部位在硅胶上进行柱层析，用体积比为30∶1～0∶1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，获得石油醚-乙酸乙酯洗脱物；
2)、取石油醚-乙酸乙酯洗脱物再进行硅胶柱层析，用体积比为1∶0～0∶1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得二氯甲烷-甲醇洗脱物；
3)、取二氯甲烷-甲醇洗脱物进行MCI柱色谱分离，用体积比为2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、1∶0的甲醇-水梯度洗脱，得到甲醇-水洗脱物；
4)、取甲醇-水洗脱物经半制备高效液相色谱纯化，用60％甲醇洗脱，从甲醇-水洗脱液中得到纯的化合物。
3.根据权利要求2所述化合物的制备方法，其特征在于：步骤C)中，乙酸乙酯部位进行色谱分离纯化的具体步骤为：
用体积比为30∶1～0∶1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，合并后得11个流份；流份11经硅胶柱层析，用体积比为1∶0～0∶1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，合并后得9个流份；流份1经MCI柱层析，用体积比为2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、1∶0的甲醇-水梯度洗脱，合并后得10个流份；流份10经半制备高效液相色谱纯化，用60％的甲醇洗脱，收集主峰，得到从宿萼木中提取分离的化合物。
4.根据权利要求2所述化合物的制备方法，其特征在于：步骤1)中，用体积比为30∶1、15∶1、8∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5、0∶1的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱。
5.根据权利要求2所述化合物的制备方法，其特征在于：步骤2)中，用体积比为1∶0、50∶1、30∶1、20∶1、15∶1、10∶1、5∶1、1∶1、0∶1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱。
6.根据权利要求2所述化合物的制备方法，其特征在于：步骤3)中，用体积比为2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1、1∶0的甲醇-水梯度洗脱。
7.权利要求1所述的化合物在制备用于抗结肠癌、宫颈癌和肝癌的药物中的应用。
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