CN107698510B - 从青竹标中提取的生物碱类化合物及提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了从青竹标中提取的生物碱类化合物及提取方法，提取方法，包括如下步骤：（1）将青竹标粗提取物分散至水中，依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，再将萃取后的乙酸乙酯有机相去除溶剂获得乙酸乙酯萃取物；（2）将乙酸乙酯萃取物溶解于甲醇中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱液为CH2Cl2‑MeOH，梯度洗脱5000 ml，每500 ml为1个接收体积；（3）将步骤（2）中15:1梯度洗脱部位的前5个接收体积合浓缩并通过C18吸附树脂色谱，依次用不同浓度的MeOH进行洗脱；（4）将步骤（3）中特定浓度MeOH的洗脱部分通过C18吸附树脂色谱柱，依次用不同浓度的MeOH进行洗脱；（5）将步骤（4）中特定浓度MeOH的洗脱部分用CH3CN‑H2O流动相进行制备。

Description

从青竹标中提取的生物碱类化合物及提取方法
技术领域
本发明涉及生物碱类化合物及其制备方法技术领域，具体涉及从青竹标中提取的生物碱类化合物及提取方法。
技术背景
青竹标(Scindapsus officinalis Schott)别名密腺崖角藤、水蜈蚣、爬树龙、金竹标，天南星科岩角藤的全株，主要分布于云南、贵州、广西，是一种在当地应用广泛的珍稀民族药。《云南中草药选》记载其具有祛瘀镇痛、润肺止咳的功效，可治跌打损伤、骨折、风湿麻木、支气管炎、百日咳；《广西药植名录》记载其“消肿，止痛，治跌打，风湿，痈疮”；《贵州药植目录》记载其“去瘀生新，镇痛”。关于从青竹标中分离纯化的新生物碱类化合物及提取方法，尚未见研究报道，更未有对青竹标中的新生物碱类化合物的性质和用途进行的研究。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供从青竹标中提取的生物碱类化合物及提取方法。
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
从青竹标中分离纯化的生物碱类化合物，包括化合物Ⅰ、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ、化合物Ⅳ、化合物Ⅴ和化合物Ⅵ；其化学结构式如下：
Figure GDA0002141475200000011
上述生物碱类化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)将青竹标粗提取物分散至水中，依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，再将萃取后的乙酸乙酯有机相去除溶剂获得乙酸乙酯萃取物；
(2)将乙酸乙酯萃取物溶解于甲醇中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱液为CH2Cl2-MeOH，梯度洗脱5000ml，每500ml为1个接收体积；
(3)将步骤(2)中15:1梯度洗脱部位的前5个接收体积合浓缩并通过C18吸附树脂色谱，依次用不同浓度的MeOH进行洗脱；
(4)将步骤(3)中特定浓度MeOH的洗脱部分通过C18吸附树脂色谱柱，依次用不同浓度的MeOH进行洗脱；
(5)将步骤(4)中特定浓度MeOH的洗脱部分用CH3CN-H2O流动相进行制备。
优选的，化合物Ⅰ的制备方法，步骤(2)中，梯度洗脱以CH2Cl2-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，15:1的梯度洗脱5000ml，每500ml为1个接收体积；
步骤(3)中，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH、80±1％MeOH进行洗脱；
步骤(4)中，将步骤(3)30±1％MeOH洗脱部位通过C18吸附树脂色谱，依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH进行洗脱，每个梯度洗脱2500ml，每500ml为1个接收体积；
步骤(5)中，将步骤(4)60±1％MeOH洗脱部位的第4个接收体积用CH3CN与H2O的体积比为30:70的流动相进行制备。
进一步优选的，化合物Ⅰ的制备条件为流速为3mL/min，检测波长为210nm。
优选的，化合物Ⅱ的制备方法，步骤(2)中，梯度洗脱以CH2Cl2-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，15:1的梯度洗脱5000ml，每500ml为1个接收体积；
步骤(3)中，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH、80±1％MeOH进行洗脱；
步骤(4)中，将步骤(3)30±1％MeOH洗脱部位通过C18吸附树脂色谱，依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH进行洗脱，每个梯度洗脱2500ml，每500ml为1个接收体积；
步骤(5)中，将步骤(4)60±1％MeOH洗脱部位的第1个接收体积用CH3CN与H2O的体积比为23:77的流动相进行制备。
进一步优选的，化合物Ⅱ的制备条件为流速为3mL/min，检测波长为260nm。
优选的，化合物Ⅲ的制备方法，步骤(2)中，梯度洗脱以CH2Cl2-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，15:1的梯度洗脱5000ml，每500ml为1个接收体积；
步骤(3)中，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH进行洗脱；
步骤(4)中，将步骤(3)12±1％MeOH洗脱部位通过C18吸附树脂色谱，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH进行洗脱；
步骤(5)中，将步骤(4)45±1％MeOH洗脱部位用CH3CN与H2O的体积比为20:80的流动相进行制备。
进一步优选的，化合物Ⅲ的制备条件为流速为3mL/min，检测波长为210nm。
优选的，化合物Ⅳ的制备方法，步骤(2)中，梯度洗脱以CH2Cl2-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，15:1的梯度洗脱5000ml，每500ml为1个接收体积；
步骤(3)中，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH、80±1％MeOH进行洗脱；
步骤(4)中，将步骤(3)12±1％MeOH洗脱部位通过C18吸附树脂色谱，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH进行洗脱；
步骤(5)中，将步骤(4)30±1％MeOH洗脱部位用CH3CN与H2O的体积比为30:70的流动相进行制备。
进一步优选的，化合物Ⅳ的制备条件为流速为3mL/min，检测波长为210nm。
优选的，化合物Ⅴ的制备方法，步骤(2)中，梯度洗脱以CH2Cl2-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1→10:1进行，10:1的梯度洗脱5000ml，每500ml为1个接收体积；
步骤(3)中，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、40±1％MeOH、60±1％MeOH、80±1％MeOH进行洗脱；
步骤(4)中，将步骤(3)12±1％MeOH洗脱部位通过Sepadex LH-20凝胶柱色谱，MeOH进行洗脱；
步骤(5)中，将步骤(4)MeOH洗脱的第1洗脱部位用CH3CN与H2O的体积比为13:87的流动相进行制备。
进一步优选的，化合物Ⅴ的制备条件为流速为3mL/min，检测波长为210nm。
优选的，化合物Ⅵ的制备方法，步骤(2)中，梯度洗脱以CH2Cl2-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1→10:1进行，10:1的梯度洗脱5000ml，每500ml为1个接收体积；
步骤(3)中，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、40±1％MeOH、60±1％MeOH、80±1％MeOH进行洗脱；
步骤(4)中，将步骤(3)45±1％MeOH洗脱部位通过Sepadex LH-20凝胶柱色谱，MeOH进行洗脱；
步骤(5)中，将步骤(4)MeOH洗脱的第4洗脱部位用CH3CN与H2O的体积比为20:80的流动相进行制备。
进一步优选的，化合物Ⅵ的制备条件为流速为3mL/min，检测波长为315nm。
优选的，步骤(1)中，所述青竹标粗提取物采用95％乙醇进行加热回流提取。
进一步优选的，所述青竹标粗提物的提取过程为：取青竹标药材，粉碎，95％乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2h、1h、1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得青竹标粗提物。
优选的，制备化合物Ⅰ～Ⅵ采用的仪器为半制备高效液相色谱仪。
所述生物碱类化合物在制备抗乳腺癌药物中的应用，尤其是化合物Ⅴ和化合物Ⅵ在制备抗乳腺癌药物中的应用。
本发明的有益效果：
上述从青竹标中分离纯化的新生物碱类化合物及其制备方法，以青竹标为原料，来源广泛，制备工艺简单，经济、安全，得率高，所得的6个新化合物中的化合物都具有一定的抗乳腺癌活性，其中，Ⅴ具有较好的抗乳腺癌活性，化合物Ⅵ具有中等的抗乳腺癌活性，具有良好的药用前景。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1为Scinamide A4-O-β-D-glucopyranoside的1H NMR；
图2为Scinamide A4-O-β-D-glucopyranoside的13C NMR；
图3为Scinamide B 8-O-β-D-glucopyranoside的1H NMR；
图4为Scinamide B 8-O-β-D-glucopyranoside的13C NMR；
图5为Scinamide C的1H NMR；
图6为Scinamide C的13C NMR；
图7为Scinamide D的1H NMR；
图8为Scinamide D的13C NMR；
图9为Scinamide E的1H NMR；
图10为Scinamide E的13C NMR；
图11为Scinamide F的1H NMR；
图12为Scinamide F的13C NMR；
图13为化合物Ⅳ的IC50曲线；
图14为化合物Ⅵ的IC50曲线。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明中的百分含量若未作具体说明，均为体积百分含量。
本发明中的洗脱程序采用了大孔树脂柱为开放式，流速不固定，时间不固定。
正如背景技术所介绍的，现有技术中存在没有从青竹标中分离纯化的生物碱类化合物及提取方法的记载，为了解决如上的技术问题，本申请提出了一种从青竹标中分离纯化的生物碱类化合物及提取方法。
本申请的一种典型实施方式，提供了一种从青竹标中分离纯化的生物碱类化合物，为化合物Ⅰ、化合物Ⅱ、化合物Ⅲ、化合物Ⅳ、化合物Ⅴ、化合物Ⅵ；其中，
化合物Ⅰ的结构式为
Figure GDA0002141475200000051
命名为Scinamide A 4-O-β-D-glucopyranoside；
化合物Ⅱ的结构式为
Figure GDA0002141475200000061
命名为Scinamide B 8-O-β-D-glucopyranoside；
化合物Ⅲ的结构式为
Figure GDA0002141475200000062
命名为Scinamide C；
化合物Ⅳ的结构式为，
Figure GDA0002141475200000063
命名为Scinamide D；
化合物Ⅴ的结构式为
Figure GDA0002141475200000064
命名为Scinamide E；
化合物Ⅵ的结构式为
Figure GDA0002141475200000065
命名为Scinamide F。
本发明的第二种典型实施方式，提供了一种上述生物碱类化合物的提取方法，提取化合物Ⅰ的步骤为：
(1)将青竹标粗提取物分散至水中，依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，再将萃取后的乙酸乙酯有机相去除溶剂获得乙酸乙酯萃取物；
(2)将乙酸乙酯萃取物溶解与甲醇中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱以CH2Cl2-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，15:1的梯度洗脱5000ml，每500ml为1个接收体积；
(3)将步骤(2)中15:1梯度洗脱部位的后5个接收体积合并浓缩并通过C18吸附树脂色谱，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH、80±1％MeOH进行洗脱；
(4)将步骤(3)30±1％MeOH洗脱部位通过C18吸附树脂色谱，依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH进行洗脱，每个梯度洗脱2500ml，每500ml为1个接收体积；
(5)将步骤(4)60±1％MeOH洗脱部位的第4个接收体积用CH3CN与H2O的体积比为30:70的流动相进行制备得到化合物Ⅰ，制备条件为流速为3mL/min，检测波长为210nm。
本发明的第三种典型实施方式，提供了一种上述生物碱类化合物的提取方法，提取化合物Ⅱ的步骤为：
(1)将青竹标粗提取物分散至水中，依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，再将萃取后的乙酸乙酯有机相去除溶剂获得乙酸乙酯萃取物；
(2)将乙酸乙酯萃取物溶解与甲醇中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱以CH2Cl2-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，15:1的梯度洗脱5000ml，每500ml为1个接收体积；
(3)将步骤(2)中15:1梯度洗脱部位的后5个接收体积合浓缩并通过C18吸附树脂色谱，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH、80±1％MeOH进行洗脱；
(4)将步骤(3)30±1％MeOH洗脱部位通过C18吸附树脂色谱，依次用12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH进行洗脱，每个梯度洗脱2500ml，每500ml为1个接收体积；
(5)将步骤(4)60±1％MeOH洗脱部位的第1个接收体积用CH3CN与H2O的体积比为23:77的流动相进行制备得到化合物Ⅱ，制备条件为流速为3mL/min，检测波长为260nm。
本发明的第四种典型实施方式，提供了一种上述生物碱类化合物的提取方法，提取化合物Ⅲ的步骤为：
(1)将青竹标粗提取物分散至水中，依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，再将萃取后的乙酸乙酯有机相去除溶剂获得乙酸乙酯萃取物；
(2)将乙酸乙酯萃取物溶解于甲醇中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱以CH2Cl2-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，15:1的梯度洗脱5000ml，每500ml为1个接收体积；
(3)将步骤(2)中15:1梯度洗脱部位的前5个接收体积合浓缩并通过C18吸附树脂色谱，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH进行洗脱；
(4)将步骤(3)12±1％MeOH洗脱部位通过C18吸附树脂色谱，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH进行洗脱；
(5)将步骤(4)45±1％MeOH洗脱部位用CH3CN与H2O的体积比为20:80的流动相进行制备得到化合物Ⅲ，制备条件为流速为3mL/min，检测波长为210nm。
本发明的第五种典型实施方式，提供了一种上述生物碱类化合物的提取方法，提取化合物Ⅳ的步骤为：
(1)将青竹标粗提取物分散至水中，依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，再将萃取后的乙酸乙酯有机相去除溶剂获得乙酸乙酯萃取物；
(2)将乙酸乙酯萃取物溶解与甲醇中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱以CH2Cl2-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，15:1的梯度洗脱5000ml，每500ml为1个接收体积；
(3)将步骤(2)中15:1梯度洗脱部位的后5个接收体积合浓缩并通过C18吸附树脂色谱，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH、80±1％MeOH进行洗脱；
(4)将步骤(3)12±1％MeOH洗脱部位通过C18吸附树脂色谱，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH进行洗脱；
(5)将步骤(4)30±1％MeOH洗脱部位用CH3CN与H2O的体积比为30:70的流动相进行制备得到化合物Ⅳ，制备条件为流速为3mL/min，检测波长为210nm。
本发明的第六种典型实施方式，提供了一种上述生物碱类化合物的提取方法，提取化合物Ⅴ的步骤为：
(1)将青竹标粗提取物分散至水中，依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，再将萃取后的乙酸乙酯有机相去除溶剂获得乙酸乙酯萃取物；
(2)将乙酸乙酯萃取物溶解与甲醇中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱以CH2Cl2-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1→10:1进行，10:1的梯度洗脱5000ml，每500ml为1个接收体积；
(3)将步骤(2)中10:1梯度洗脱部位的后5个接收体积合浓缩并通过C18吸附树脂色谱，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、40±1％MeOH、60±1％MeOH、80±1％MeOH进行洗脱；
(4)将步骤(3)12±1％MeOH洗脱部位通过Sepadex LH-20凝胶柱色谱，MeOH进行洗脱；
(5)将步骤(4)MeOH洗脱的第1洗脱部位用CH3CN与H2O的体积比为13:87的流动相进行制备得到化合物Ⅴ，制备条件为流速为3mL/min，检测波长为210nm。
本发明的第七种典型实施方式，提供了一种上述生物碱类化合物的提取方法，提取化合物Ⅵ的步骤为：
(1)将青竹标粗提取物分散至水中，依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，再将萃取后的乙酸乙酯有机相去除溶剂获得乙酸乙酯萃取物；
(2)将乙酸乙酯萃取物溶解与甲醇中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱以CH2Cl2-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1→10:1进行，10:1的梯度洗脱5000ml，每500ml为1个接收体积；
(3)将步骤(2)中10:1梯度洗脱部位的后5个接收体积合浓缩并通过C18吸附树脂色谱，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、40±1％MeOH、60±1％MeOH、80±1％MeOH进行洗脱；
(4)将步骤(3)45±1％MeOH洗脱部位通过Sepadex LH-20凝胶柱色谱，MeOH进行洗脱；
(5)将步骤(4)MeOH洗脱的第4洗脱部位用CH3CN与H2O的体积比为20:80的流动相进行制备得到化合物Ⅵ，制备条件为流速为3mL/min，检测波长为315nm。
为了更好得到青竹标的粗提物，本申请优选的，步骤(1)中所述的青竹标粗提取物采用95％乙醇进行加热回流提取。
进一步优选的，所述青竹标粗提物的提取过程为，取青竹标药材，粉碎，95％乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2h、1h、1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得青竹标粗提物。
为了将青竹标粗提取物更均匀的分散至水中，本申请优选的，步骤(1)所述青竹标粗提取物加入水中进行超声分散。
本申请上述步骤(5)制备化合物Ⅰ～Ⅵ采用的仪器为半制备高效液相色谱仪。
实施例1
化合物Ⅰ-Ⅵ的制备方法，步骤如下：
(1)取青竹标药材5kg，粉碎，95％乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2h，1h，1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得青竹标粗提物1kg；
(2)将总粗提物加入适量水超声打散，分别用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，萃取液过滤，减压浓缩分别得到石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水萃取部位；
(3)将所得的乙酸乙酯部位180g溶解于甲醇中，加入200～300目硅胶300g拌样，挥干溶剂，以体积比CH2Cl2-MeOH(100:1→50:1→25:1→15:1→10:1→5:1→1:1→0:1)进行梯度洗脱，得到各洗脱部位，浓缩，每个梯度冲洗5000mL，每500mL为一个接收体积。
(4)将CH2Cl2-MeOH(15:1)梯度洗脱部位的前5个接收体积合浓缩通过C18吸附树脂色谱，依次用5％、12％、30％MeOH进行洗脱，得到各洗脱部位。将C18柱的12％MeOH部位再通过C18吸附树脂色谱，依次用5％、12％、30％、45％MeOH进行洗脱，得到各洗脱部位。将C18柱的45％MeOH部位使用普原L-3000半制备高效液相色谱仪进行制备，AB两流动相分别设定为CH3CN和H2O，CH3CN和H2O的体积比为20:80(v/v)，流速为3mL min-1，检测波长为210nm，每次进样50μL，得到化合物Ⅲ5mg。
(5)将CH2Cl2-MeOH(15:1)梯度洗脱部位的后5个接收体积合浓缩再通过C18吸附树脂色谱，依次用5％、12％、30％、45％、60％、80％MeOH进行洗脱，得到各洗脱部位。将C18柱的12％MeOH部位再通过C18吸附树脂色谱，依次用5％、12％、30％、45％MeOH进行洗脱，得到各洗脱部位。将C18柱的30％MeOH部位用CH3CN/H2O(30:70,v/v)进行制备(制备仪器为普原L-3000半制备高效液相色谱仪；流速：3mL min-1；检测波长：210nm)得到化合物Ⅳ6mg；将第一次C18柱的30％MeOH部位再通过C18吸附树脂色谱，依次用5％、12％、30％、45％、60％MeOH进行洗脱，每个梯度洗脱2500ml，每500ml为1个接收体积，得到各洗脱部位。将C18柱的60％MeOH洗脱部位的第1个接收体积用CH3CN/H2O(23:77,v/v)进行制备(制备仪器为普原L-3000半制备高效液相色谱仪；流速：3mL min-1；检测波长：260nm)得到化合物Ⅱ20mg。
(6)将CH2Cl2-MeOH(15:1)梯度洗脱部位的后5个接收体积合浓缩再通过C18吸附树脂色谱，依次用5％、12％、30％、45％、60％、80％MeOH进行洗脱，得到各洗脱部位。将C18柱的30％MeOH部位再通过C18吸附树脂色谱，依次用12％MeOH、30％MeOH、45％MeOH、60％MeOH进行洗脱，每个梯度洗脱2500ml，每500ml为1个接收体积。将C18柱的60％MeOH洗脱部位的第4个接收体积用CH3CN/H2O(30:70,v/v)进行制备(制备仪器为普原L-3000半制备高效液相色谱仪；流速：3mL min-1；检测波长：210nm)得到化合物Ⅰ5mg。
(7)将CH2Cl2-MeOH(10:1)梯度洗脱部位的后5个接收体积合并浓缩再通过C18吸附树脂色谱，依次用5％、12％、30％、40％、60％、80％MeOH进行洗脱，得到各洗脱部位。将C18柱的12％MeOH部位再通过Sepadex LH-20凝胶柱色谱，用MeOH进行洗脱，得到5个洗脱部位。将第1个洗脱部位用CH3CN/H2O(13:87,v/v)进行制备(制备仪器为普原L-3000半制备高效液相色谱仪；流速：3mL min-1；检测波长：210nm)得到化合物Ⅴ5mg；将C18柱的45％MeOH部位再通过Sepadex LH-20凝胶柱色谱，用MeOH进行洗脱，得到6个洗脱部位。将第4个洗脱部位用CH3CN/H2O(20:80,v/v)进行制备(制备仪器为普原L-3000半制备高效液相色谱仪；流速：3mLmin-1；检测波长：315nm)得到化合物Ⅵ15mg。
结构鉴定：对分离得到的单体成分应用Agilent 5973N质谱仪和Burker 400MHz核磁共振波谱仪分别进行MS，NMR谱的测定，所得核磁数据见表1-2，鉴定6个新生物碱类化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ的结构。
化合物Ⅰ：Scinamide A4-O-β-D-glucopyranoside，黄色粉末，其化学结构表征如图1～2所示，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z 414.2130[M+H]+(calcd for C20H32NO8，414.2122),结合1H NMR和13C NMR谱推测化合物Ⅳ的分子式为C20H31NO8。1H NMR谱显示2个甲基单峰信号：δH 1.06(3H,s,Me-13)，1.16(3H,s,Me-14)，1个甲基双峰信号：δH 0.90(3H,d,J＝6.6Hz,Me-15)，1个烯氢信号：δH 5.75(1H,m,H-9)，1个醛氢信号：δH 9.26(1H,s,H-12)，2个连氧氢信号：δH 4.22(1H,m,H-3)，3.85(1H,dd,J＝1.8,8.7Hz,H-4)，1个糖的端基氢信号：δH 4.43(1H,d,J＝7.8Hz,H-1')。13C和HSQC、HMBC谱显示化合物Ⅳ共有20个碳原子，包括3个甲基，2个亚甲基，12个次甲基(其中δC 120.3与烯碳一致)和3个季碳，其中季碳信号δC201.9与-CHO一致，δC 141.4与取代烯碳一致。苷元部分的鉴定：在1H 1H-COSY谱中，0.90(Me-15)与1.19(H-7)相关，1.19(H-7)与1.39(H-8)相关，1.39(H-8)与5.75(H-9)相关，2.08(H-2)与4.22(H-3)相关，4.22(H-3)与3.85(H-4)相关，3.85(H-4)与1.57(H-5)相关，且在HMBC谱中，3.85(H-4)与C-3、C-5、C-11、C-1'相关，1.19(H-7)与C-9、C-10相关，1.39(H-8)与C-9、Me-15相关，5.75(H-9)与C-6、C-8相关，确定环戊烯与环己亚胺两环通过C-6/C-10键并连；在HMBC谱中，2.08(H-2)与C-3、C-4、C-5、C-10、C-11、CHO、Me-13相关，1.57(H-5)与C-4、C-10、C-11、CHO、Me-14相关，确定环己亚胺上存在1个桥环C-2/C-11/C-5；在HMBC谱中，9.26(CHO-12)与C-11、Me-13相关，1.06(Me-13)与C-2、C-5、CHO相关，1.16(Me-14)与C-5、C-6相关，0.90(Me-15)与C-6、C-8相关，确定CHO和Me-13连在C-11位，Me-14连在C-6位，Me-15连在C-7位。通过H-2、H-4和H-5的耦合常数确定H-2与H-3为反式关系，H-3与H-4为顺式关系，H-4与H-5为反式关系，且在NOESY谱中，CHO-12与H-3相关，Me-14与H-4的相关，Me-15与H-5的相关，确定化合物Ⅰ的相对构型，苷元部分命名为：Scinamide A。糖结构的鉴定：将化合物Ⅰ进行酸水解，经GC检测出含有1个D-glucose。糖链的连接位置由HMBC谱确定：δH 4.43(H-1'ofβ-D-glucose)与δC 81.2(C-4)相关。综上所述，化合物Ⅰ的结构确定为：Scinamide A 4-O-β-D-glucopyranoside。
Figure GDA0002141475200000121
化合物Ⅱ中C-7的构型
化合物Ⅱ：Scinamide B 8-O-β-D-glucopyranoside，黄色粉末，其化学结构表征如图3～4所示，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z 412.2335[M+H]+(calcd for C21H34NO7，412.2330),结合1H NMR和13C NMR谱推测化合物Ⅲ的分子式为C21H33NO7。1H NMR谱显示4个甲基单峰信号：δH 1.94(3H,s,Me-13)，0.89(3H,s,Me-14)，1.06(3H,s,Me-15)，1.07(3H,s,Me-16)，1个糖的端基氢信号：4.12(1H,d,J＝7.6Hz,H-1')。13C和HSQC、HMBC谱显示化合物Ⅲ共有21个碳原子，包括4个甲基，4个亚甲基，8个次甲基和5个季碳，其中季碳信号δC 196.5与羰基一致，δC 143.3和151.0与取代烯碳一致。苷元部分的鉴定：在1H 1H-COSY谱中，2.52(H-6)和1.89(H-6)与2.32(H-7)相关，2.32(H-7)与3.32(H-8)和2.15(H-11)相关，2.15(H-11)与1.50(H-10)和1.40(H-10)相关，且在HMBC谱中，2.52(H-6)和1.89(H-6)与C-4、C-5、Me-13相关，2.32(H-7)与C-9、C-10、C-12相关，3.32(H-8)与C-10、C-1'相关，1.50(H-10)与C-7、C-8、C-9、C-12、Me-14、Me-15相关，确定环己烯与环戊烷两环通过C-7/C-11键并连；在HMBC谱中，2.71(H-2)和2.57(H-2)与C-3、C-4、C-12相关，确定3-羰基吡咯烷与环己烯通过C-4/C-12键并连；在HMBC谱中，1.94(Me-13)与C-4、C-5、C-6相关，0.89(Me-14)与C-8、C-9、C-10、Me-15相关，1.06(Me-15)与C-8、C-9、C-10、Me-14相关，1.07(Me-16)与C-11、C-12相关，确定Me-13连在C-5位，Me-14连在C-9位，Me-15连在C-9位，Me-16连在C-12位。通过H-6a和H-6b的耦合常数确定H-6b与H-7为反式双直立关系，确定C-7为R构型，且在NOESY谱中，H-7与H-8、H-11相关，确定C-8为S构型，C-11为R构型，未观察到Me-16与H-7、H-8、H-11的相关，确定C-12位Me为α构型，苷元部分命名为：Scinamide B。糖结构的鉴定：将化合物Ⅱ进行酸水解，经GC检测出含有1个D-glucose。糖链的连接位置由HMBC谱确定：δH 4.12(H-1'ofβ-D-glucose)与δC 94.6(C-8)相关。综上所述，化合物Ⅱ的结构确定为：Scinamide B 8-O-β-D-glucopyranoside。
化合物Ⅲ：Scinamide C，黄色粉末，其化学结构表征如图5～6所示，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z 332.1487[M+H]+(calcd for C18H22NO5，332.1293),结合1H NMR和13C NMR谱推测化合物Ⅰ的分子式为C18H21NO5。1H NMR谱显示1,2,4,5-取代苯环的特征性信号：δH 6.39(1H,s,H-7)，6.75(1H,s,H-10)；1个烯氢信号：δH 5.96(1H,m,H-13)；1个OMe信号：δH 3.61(3H,s,OMe-17)；1个甲基单峰信号：δH 1.53(3H,s,Me-18)。13C和HSQC、HMBC谱显示化合物Ⅰ共有18个碳原子，包括2个甲基，4个亚甲基，4个次甲基和8个季碳，其中季碳信号δC 170.6与环内CONH基团一致，δC 171.4与酯羰基基团一致。在1H 1H-COSY谱中，4.02(H-4)与2.44(H-5)和2.64(H-5)相关，且在HMBC谱中，4.02(H-4)与C-3、C-5、C-6相关，2.44(H-5)与C-3、C-4、C-6、C-7、C-11相关，6.39(H-7)与C-5、C-9、C-11相关，6.75(H-10)与C-1、C-6、C-8相关，确定1,2,4,5-取代苯环与七元内酰胺环两环并连，且环内CONH为C-3；在HMBC谱中1.53(Me-18)与C-1、C-11、C-12相关，确定Me-18连在C-1位；在1H 1H-COSY谱中，5.96(H-13)与3.13(H-14)和2.82(H-15)相关，2.82(H-15)与3.13(H-14,H-16)相关，且在HMBC谱中，5.96(H-13)与C-1、C-15相关，3.13(H-14,H-16)与C-12、C-13、C-17相关，确定环戊烯基团存在，且通过C-1/C-12键与七元内酰胺环相连，-COOMe通过C-15/C-17键与环戊烯基团相连。综上所述，化合物Ⅲ的结构确定为Scinamide C。
化合物Ⅳ：Scinamide D，黄色粉末，其化学结构表征如图7～8所示，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z 276.1234[M+H]+(calcd for C15H18NO4，276.1230),结合1H NMR和13C NMR谱推测化合物Ⅱ的分子式为C15H17NO4。比较化合物Ⅳ和pyrrolezanthine-6-methyl ether的1H NMR和13C NMR谱数据，发现两者结构类似，主要的区别在于化合物Ⅳ的苯环被2个OH取代。通过1H NMR中的ABX耦合系统信号：6.57(1H,d,J＝1.8Hz,H-11),6.23(1H,d,J＝7.8Hz,H-14),6.38(1H,dd,J＝1.8,7.8Hz,H-15)进一步确证这一区别。综上所述，化合物Ⅳ的结构确定为Scinamide D。
化合物Ⅴ：Scinamide E，黄色粉末，其化学结构表征如图9～10所示，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z 222.1495[M+H]+(calcd for C13H20NO2，222.1489),结合1H NMR和13C NMR谱推测化合物Ⅴ的分子式为C13H19NO2。1H NMR谱显示1,2,4,5-取代苯环的特征性信号：δH6.50(1H,s,H-7)，6.54(1H,s,H-10)；2个甲基信号：δH 1.27(3H,m Me-12)，0.86(3H,m,Me-2')。化合物Ⅴ与salsolinol的1H NMR和13C NMR谱数据，两者结构类似，主要的区别在于前者为环己亚胺，N上有乙基取代。在1H 1H-COSY谱中，3.22(H-3)，3.05(H-3)/1.38(H-4)/1.77(H-5)相关，2.74(H-1')，2.65(H-1')/0.86(H-2')相关，且在HMBC谱中，0.86(H-2')与C-1'相关，进一步确证了上述区别。综上所述，化合物Ⅴ的结构确定为Scinamide E。
化合物Ⅵ：Scinamide F，黄色粉末，其化学结构表征如图11～12所示，HR-ESIMS给出分子离子峰m/z 358.1280[M+H]+(calcd for C19H20NO6，358.1285),结合1H NMR和13C NMR谱推测化合物Ⅵ的分子式为C19H19NO6。化合物Ⅵ与2-[3-(3,4-Dihydroxy-phenyl)-acryloylamino]-3-(4-hydroxy-phenyl)-propionic acid的1H NMR和13C NMR谱数据相似，表明两者结构类似，主要的区别在于3-(3,4-Dihydroxy-phenyl)-acryloylamino基团酰胺处所连基团不同，化合物Ⅵ是通过(4-hydroxy-phenyl)-丙酸甲酯的3位与之相连。在HMBC谱中，5.23(H-11)与C-9、C-12、C-13、C-17、C-18、C-19相关，7.14(H-13,17)与C-11、C-12、C-15相关，2.77(H-18)与C-11、C-12、C-19相关，3.54(OMe)与C-19相关，进一步确证了上述区别。综上所述，化合物Ⅵ的结构确定为Scinamide F。
表1.化合物Ⅰ～Ⅵ的1H NMR光谱数据(400MHz,DMSO-d6,δppm,J,Hz)
Figure GDA0002141475200000141
Figure GDA0002141475200000151
表2.化合物Ⅰ～Ⅵ的13C NMR光谱数据(400MHz,DMSO-d6,δppm)
Figure GDA0002141475200000152
Figure GDA0002141475200000161
药理学实验：
1、实验材料
细胞株：人乳腺癌细胞MCF-7购自中国科学院上海生命科学院细胞库。
试剂与仪器：化合物1-23均由本课题组从思茅山橙中分离得到；DMEM培养基(美国Thermo Scientific公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；0.25％胰蛋白酶消化液(北京索莱宝科技有限公司)；MTT(美国Sigma公司)；青链霉素混合液(100×)(北京索莱宝科技有限公司)；三氯乙酸(TCA)(美国Sigma公司)。
细胞培养箱(美国Thermo scientific)；超净工作台(苏州净化设备有限公司)；倒置显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司)；多功能酶标仪(法国Tecan公司)。
2、试验方法
MCF-7细胞株的培养：
细胞复苏：采用快融法复苏细胞。取出液氮中冻存的细胞后，立即置37℃水浴中快速融化，避免冰晶缓慢损伤细胞。待融解后迅速转入到完全培养基(含10％FBS及1％双抗)中培养，次日换液。
细胞培养：DEME完全培养基(含10％FBS及1％双抗)中培养MCF-7乳腺癌细胞，在培养箱(37℃，5％CO2)培养至细胞覆盖率达90％以上时传代，生长状态良好的细胞用于实验研究。
MTT实验：将MCF-7细胞接种于96孔板中，接种密度为10000个/孔，接种悬液体积为100μL，37℃，5％CO2培养箱中贴壁培养24h后，同时加入不同浓度的受试药物(溶解在含0.3％DMSO的培养基中)200μL/孔，设置复孔以减小误差。正常对照组加入等量含0.3％DMSO的培养基(C0)，同时设顺铂阳性对照组(DDP)和阴性对照组(只加培养基)，37℃，5％CO2培养箱中培养24h。样品浓度设置为五个浓度梯度，分别为：90、60、30、15、7.5μM。吸弃培养基，沿孔壁慢慢加入MTT(5mg/mL)溶液50μL，置37℃环境中固定4h，弃掉上清液溶液，然后加入200μL的DMSO溶液，振摇至进入细胞的MTT试剂完全溶解，用酶标仪在波长540nm处测定各化合物的OD值，重复测定3次，计算相应的抑制率和IC50值。
3、实验结果
从上述实验结果可以看知，化合物Ⅳ和Ⅵ具细胞毒活性，其IC50分别为11.6μM和25.3μM(IC50曲线如图13和图14)。根据《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》对“体外抗肿瘤试验”的规定，抗肿瘤效果评价以体外肿瘤半数抑制浓度(IC50)，中药提取物IC50≤30μg·mL-1有生物学意义。从以上数据看，化合物IV和Ⅵ对人乳腺癌细胞MCF-7的IC50值等于或小于该水平，具有明显的生物学意义。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (6)

1.从青竹标中分离纯化的生物碱类化合物，其特征在于：其化学结构式如下：
Figure FDA0002273122610000011
2.权利要求1所述生物碱类化合物的提取方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将青竹标粗提取物分散至水中，依次采用石油醚、乙酸乙酯萃取，再将萃取后的乙酸乙酯有机相去除溶剂获得乙酸乙酯萃取物；
(2)将乙酸乙酯萃取物溶解于甲醇中，通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱液为CH2Cl2-MeOH，梯度洗脱以CH2Cl2-MeOH体积比为100:1→50:1→25:1→15:1进行，15:1的梯度洗脱5000ml，每500ml为1个接收体积；
(3)将步骤(2)中15:1梯度洗脱部位的后5个接收体积合浓缩并通过C18吸附树脂色谱，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH、60±1％MeOH、80±1％MeOH进行洗脱；
(4)将步骤(3)中12±1％MeOH洗脱部位通过C18吸附树脂色谱，依次用5±1％MeOH、12±1％MeOH、30±1％MeOH、45±1％MeOH进行洗脱；
(5)将步骤(4)中30±1％MeOH洗脱部位用CH3CN与H2O的体积比为30:70的流动相进行制备。
3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于：化合物的制备条件为流速为3mL/min，检测波长为210nm。
4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述青竹标粗提取物采用95％乙醇进行加热回流提取。
5.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于：步骤(1)中，所述青竹标粗提物的提取过程为：取青竹标药材，粉碎，95％乙醇加热回流提取，固液比为1:3，提取三次，时间分别为2h、1h、1h，合并滤液，减压旋蒸，冷冻干燥，得青竹标粗提物。
6.权利要求1所述的生物碱类化合物在制备抗乳腺癌药物中的应用。
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