CN105440092A

CN105440092A - 一种油茶粕中黄酮苷的快速制备方法

Info

Publication number: CN105440092A
Application number: CN201610027047.6A
Authority: CN
Inventors: 高进勇; 余炎炎; 臧明丽; 党占国; 高永平; 李欢; 鲁有强
Original assignee: Xinyang Normal University Huarui College
Current assignee: Xinyang Normal University Huarui College
Priority date: 2016-01-18
Filing date: 2016-01-18
Publication date: 2016-03-30
Anticipated expiration: 2036-01-18
Also published as: CN105440092B

Abstract

本发明首先通过乙醇提取获得油茶粕总黄酮粗提物，再经过大孔吸附树脂富集纯化、低压柱层析精制，就能分离到油茶粕黄酮苷单体。不需要大型精密设备，操作步骤简单，易掌握，尤其方法简单稳定性重复性强，且得率高，有效成分损失小，能有效的对油茶粕中活性成分黄酮单体进行分离，将为进一步放大实验和工业化生产提供了重要依据。为油茶饼粕中黄酮苷药物和保健功能产品开发提供了优质原料。

Description

一种油茶粕中黄酮苷的快速制备方法

技术领域

本发明属于功能成分提取技术领域，具体涉及一种油茶粕中黄酮苷的快速制备方法。

背景技术

黄酮类化合物广泛存在于植物界，是一类重要的多酚类天然产物，是植物代谢过程中产生的一类重要天然有机化合物。黄酮类化合物在人体中具有多种生物活性，包括抗氧化、清除自由基、抗病毒、抗发炎、血管舒张和抗菌等作用，多年来一直是国内外研究开发的热点。油茶籽榨油后的渣滓（俗称油茶粕）中含有丰富的三萜类植物皂苷-茶皂素，还含有其他黄酮、鞣质等生物活性物质。对于废弃物油茶粕中提取纯化黄酮的研究还比较少，经初步分析，油茶粕中黄酮主要为山奈酚糖苷类黄酮。

对于油茶粕黄酮的分离纯化多采用反复硅胶柱层析法，中压柱层析法，制备型高效液相色谱，高速逆流色谱分离纯化等进行分离纯化;陈虹霞等（陈虹霞,王成章,叶建中,周昊.油茶饼粕中黄酮苷类化合物的分离与结构鉴定[J].林产化学与工业，2011年2月，第31卷第1期）采用茶籽饼粕经过乙醇水溶液提取，浸膏采用甲醇溶解并冷冻后去除不溶物，通过中低压色谱制备得到黄酮苷类化合物，再进一步通过高效液相制备得到黄酮苷化合物Ⅰ和Ⅱ；专利CN201010229218.6公开了一种中压柱快速分离油茶饼粕中黄酮苷的制备方法，其采用中压柱层析加高效液相色谱制备得到纯度95%以上的黄酮苷单体两个；然而以上方法具有得率低，溶剂用量大，需反复进行和使用专业设备如中压柱，制备型高效液相色谱法，条件局限，步骤繁多，专业性强，技术难于掌握，分离量小等问题。

发明内容

本发明的目的就在于为解决现有技术的不足而提供一种操作步骤简单、不需要大型精密仪器的油茶粕中黄酮苷的快速制备方法。

本发明的目的是以下述技术方案实现的:

一种油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，包括以下步骤：

（1）采用乙醇提取油茶粕总黄酮；得到油茶粕总黄酮提取物；

（2）大孔吸附树脂纯化：采用弱极性大孔吸附树脂动态吸附富集，15-45%乙醇动态洗脱；洗脱液浓缩后得到纯度大于85%的总黄酮；

（3）低压柱精制：采用低压硅胶层析柱，常压条件下，以乙酸乙酯:甲醇:水为洗脱液，乙酸乙酯:甲醇:水(V:V:V)=(170-230):(25-45):(8-12)；得到纯度大于89.3%的化合物I和纯度大于92.5%的化合物II；化合物I为山奈酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷（Ⅰ）；化合物II为山奈酚3-O-[2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷（Ⅱ）。

步骤（3）得到的化合物I经重复步骤（3），纯度达到95%以上。

步骤（3）得到的化合物II经在甲醇中结晶，纯度达到98%以上。

步骤（1）具体为：采用体积比例为50-95%乙醇，提取温度40-70℃，提取液固比为(5-15):1（ml:g），提取次数1-4次，每次提取1-3h，提取液减压浓缩回收乙醇，得到油茶粕黄酮粗提物。

步骤（2）大孔吸附树脂型号HZ816，颗粒度0.3-1.2。

步骤（2）具体为：将步骤（1）得到的油茶粕黄酮粗提物加水配制成浓度为3-8mg/mL的油茶粕黄酮粗提液，上柱量为6-11BV（柱体积），上柱流速为0.8-1.5BV/h；洗脱流速为0.8-1.5BV/h，洗脱液体积为3-5BV；洗脱液减压浓缩，采用冷冻干燥得到样品纯度大于85%的总黄酮。

步骤（3）硅胶目数为100-300目。

步骤（3）具体为：将步骤（2）得到的经大孔吸附树脂纯化后的总黄酮加甲醇溶解，上样量为总黄酮:硅胶(g/g)=(0.8-1.2):4，洗脱液流速为0.6~1.0BV/h。

大孔树脂是一类具有大孔结构的高分子吸附剂，理化性质稳定。它具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附及离子交换吸附从溶液中有选择地吸附有机物。油茶粕醇提液中含有多糖、鞣质。蛋白质等杂质，必须对其进行分离纯化。油茶粕中黄酮属于极性化合物，且具有较好的水溶性，而且容易和大孔树脂形成氢键，有利于树脂的吸附。为了达到既能除掉杂质又能提高黄酮纯度的目的选择大孔吸附树脂进行富集纯化。

经大孔吸附树脂富集纯化后的油茶粕黄酮主要是黄酮类化合物的混合物，为探索油茶粕中的化学成分，进一步研究油茶粕中黄酮类化合物的生物活性成分，开拓其医药方面的应用范围，提高油茶的综合开发利用价值，有必要对其进行进一步的精制。

硅胶柱层析采用硅胶为介质，利用样品中各组分与硅胶间吸附力的不同，对组分进行分离。对于分离到的黄酮单体借助于红外、质谱、核磁共振等仪器进行结构鉴定，为其在医药方面的进一步应用提供依据。

本发明首先通过乙醇提取获得油茶粕总黄酮粗提物，再经过大孔吸附树脂富集纯化、低压柱层析精制，就能分离到油茶粕黄酮单体。不需要大型精密设备，操作步骤简单，易掌握，尤其方法简单稳定性重复性强，且得率高，有效成分损失小，能有效的对油茶粕中活性成分黄酮单体进行分离，将为进一步放大实验和工业化生产提供了重要依据。为油茶饼粕中黄酮苷药物和保健功能产品开发提供了优质原料。

附图说明

图1是油茶粕中乙醇提取液HPLC图谱；

图2是大孔吸附树脂纯化后黄酮HPLC图谱；

图3是化合物ⅠHPLC图谱；

图4是化合物ⅡHPLC图谱；

图5是化合物Ⅰ的红外光谱图；

图6是化合物Ⅰ的质谱图；

图7是化合物Ⅰ的1H-NMR（DMSO-d6中）；

图8是化合物Ⅰ的1C-NMR（DMSO-d6中）；

图9是化合物Ⅱ红外光谱图；

图10是化合物Ⅱ质谱图；

图11是化合物ⅡH-NMR（DMSO-d6中）；

图12是化合物ⅡH-NMR（D₂O中）；

图13是化合物Ⅱ¹³C-NMR（D₂O中）。

具体实施方式

实施例1

一种油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，包括以下步骤：

（1）采用乙醇提取油茶粕总黄酮；采用体积比例为50-95%乙醇，提取温度40-70℃、提取液固比为(5-15):1（ml:g），提取次数1-4次，每次提取1-3h，提取在搅拌条件下进行，搅拌速率为100转每分钟，提取液减压浓缩回收乙醇，得到油茶粕黄酮粗提物；

（2）大孔吸附树纯化：将步骤（1）得到的油茶粕黄酮粗提物加水配制成浓度为3-8mg/mL的油茶粕黄酮粗提液，采用弱极性大孔吸附树脂型号HZ816，颗粒度0.3-1.2，进行动态吸附富集纯化，玻璃层析柱规格Φ1.0×50cm，15-45%乙醇动态洗脱；上柱量为6-11BV（柱体积），流速为0.8-1.5BV/h；洗脱流速为0.8-1.5BV/h，洗脱液体积为3-5BV；洗脱液减压脱醇浓缩，采用冷冻干燥得到样品纯度大于85%的总黄酮；

（3）低压柱精制：将步骤（2）得到的经大孔吸附树脂纯化后的总黄酮，加入少量甲醇溶解进行低压硅胶层析柱，以100-300目的硅胶湿法装柱分离纯化，以乙酸乙酯:甲醇:水为洗脱液，分部收集洗脱液，化合物Ⅰ先流出，化合物Ⅱ后流出，合并相同流分；采用低压玻璃层析柱（Φ1.6×50cm），上样量为总黄酮:硅胶（g/g）=(0.8-1.2):4，常压条件下，乙酸乙酯:甲醇:水(V:V:V)=(170-230):(25-45):(8-12)，洗脱液流速为0.6~1.0BV/h；按此条件精制的黄酮中化合物Ⅰ和化合物Ⅱ产品，纯度分别达89.3%和92.5%以上，化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的回收率分别达到73.5%和73.1%。化合物Ⅰ经重复硅胶柱层析，纯度达到95%以上，化合物Ⅱ在甲醇中结晶纯度达到98%以上，此纯度样品进行后续的结构鉴定。化合物Ⅰ为山奈酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷和化合物Ⅱ为山奈酚3-O-[2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷。

实施例2

一种油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，包括以下步骤：

（1）采用乙醇提取油茶粕总黄酮；采用体积比例为95%乙醇，提取温度60℃、提取液固比为10:1，提取次数2次，每次提取2h，提取在搅拌条件下进行，搅拌速率为100转每分钟，提取液减压浓缩回收乙醇，得到油茶粕黄酮粗提物；

（2）大孔吸附树纯化：将步骤（1）得到的油茶粕黄酮粗提物加水配制成浓度为5mg/mL的油茶粕黄酮粗提液，采用大孔吸附树脂型号HZ816，颗粒度0.3-1.2，进行动态吸附富集纯化，玻璃层析柱规格Φ1.0×50cm，25-35%乙醇动态洗脱；上柱量为10.5BV（柱体积），流速为1.0BV/h；洗脱流速为1.0BV/h，洗脱液体积为4BV；洗脱液减压脱醇浓缩，采用冷冻干燥得到样品纯度大于85%的总黄酮；

（3）低压柱精制：将步骤（2）得到的经大孔吸附树脂纯化后的总黄酮，加入少量甲醇溶解进行低压硅胶柱层析，以100-300目的硅胶湿法装柱分离纯化，常压条件下，以乙酸乙酯:甲醇:水为洗脱液，分部收集洗脱液；采用低压玻璃层析柱（Φ1.6×50cm），上样量为1g总黄酮/45g硅胶，乙酸乙酯:甲醇:水(V:V:V)=200:35:10，洗脱液流速为0.8BV/h；按此条件精制的黄酮中化合物Ⅰ和化合物Ⅱ产品，纯度分别达89.3%和92.5%以上，化合物Ⅰ和化合物Ⅱ的回收率分别达到73.5%和73.1%。化合物Ⅰ经重复硅胶柱层析，纯度达到95%以上，化合物Ⅱ在甲醇中结晶纯度达到98%以上，此纯度样品进行后续的结构鉴定。化合物Ⅰ为山奈酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷和化合物Ⅱ为山奈酚3-O-[2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷。

实施例3

一种油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，包括以下步骤：

（1）采用乙醇提取油茶粕总黄酮；采用体积比例为95%乙醇，提取温度60℃、提取液固比为10:1，提取次数2次，每次提取1h，提取在搅拌条件下进行，搅拌速率为100转每分钟，提取液减压浓缩回收乙醇，得到油茶粕黄酮粗提物；

（2）大孔吸附树纯化：将步骤（1）得到的油茶粕黄酮粗提物加水配制成浓度为5mg/mL的油茶粕黄酮粗提液，采用大孔吸附树脂动态吸附富集纯化，25%乙醇动态洗脱；上柱量为8BV（柱体积），流速为1.0BV/h；洗脱流速为1.5BV/h，洗脱液体积为5BV；洗脱液减压脱醇浓缩，采用冷冻干燥得到样品纯度大于85%的总黄酮；

（3）低压柱精制：将步骤（2）得到的经大孔吸附树脂纯化后的总黄酮，加入少量甲醇溶解进行低压硅胶柱层析，以100-300目的硅胶湿法装柱分离纯化，常压条件下，以乙酸乙酯:甲醇:水为洗脱液，分部收集洗脱液；上样量为1g总黄酮/45g硅胶，乙酸乙酯:甲醇:水(V:V:V)=200:30:10，洗脱液流速为0.8BV/h；其余同实施例2。

实施例4

一种油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，包括以下步骤：

（1）采用乙醇提取油茶粕总黄酮；采用体积比例为60%乙醇，提取温度40℃、提取液固比为8:1，提取次数3次，每次提取2h，提取在搅拌条件下进行，搅拌速率为100转每分钟，提取液减压浓缩回收乙醇，得到油茶粕黄酮粗提物；

（2）大孔吸附树纯化：将步骤（1）得到的油茶粕黄酮粗提物加水配制成浓度为5mg/mL的油茶粕黄酮粗提液，采用大孔吸附树脂动态吸附富集纯化，30%乙醇动态洗脱；上柱量为9BV（柱体积），流速为0.8BV/h；洗脱流速为1BV/h，洗脱液体积为4BV；洗脱液减压脱醇浓缩，采用冷冻干燥得到样品纯度大于85%的总黄酮；

（3）低压柱精制：将步骤（2）得到的经大孔吸附树脂纯化后的总黄酮，加入少量甲醇溶解进行低压硅胶柱层析，以100-300目的硅胶湿法装柱分离纯化，常压条件下，以乙酸乙酯:甲醇:水为洗脱液，分部收集洗脱液；上样量为0.8g总黄酮/45g硅胶，乙酸乙酯:甲醇:水(V:V:V)=170:35:12，洗脱液流速为0.6BV/h；其余同实施例2。

实施例5

一种油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，包括以下步骤：

（1）采用乙醇提取油茶粕总黄酮；采用体积比例为80%乙醇，提取温度50℃、提取液固比为12:1，提取次数4次，每次提取2h，提取在搅拌条件下进行，搅拌速率为100转每分钟，提取液减压浓缩回收乙醇，得到油茶粕黄酮粗提物；

（2）大孔吸附树纯化：将步骤（1）得到的油茶粕黄酮粗提物加水配制成浓度为3mg/mL的油茶粕黄酮粗提液，采用大孔吸附树脂动态吸附富集纯化，35%乙醇动态洗脱；上柱量为11BV（柱体积），流速为1.5BV/h；洗脱流速为0.8BV/h，洗脱液体积为3BV；洗脱液减压脱醇浓缩，采用冷冻干燥得到样品纯度大于85%的总黄酮；

（3）低压柱精制：将步骤（2）得到的经大孔吸附树脂纯化后的总黄酮，加入少量甲醇溶解进行低压硅胶柱层析，以100-300目的硅胶湿法装柱分离纯化，常压条件下，以乙酸乙酯:甲醇:水为洗脱液，分部收集洗脱液；上样量为1.2g总黄酮/45g硅胶，乙酸乙酯:甲醇:水(V:V:V)=210:25:10，洗脱液流速为1.0BV/h；其余同实施例2。

实施例6

一种油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，包括以下步骤：

（1）采用乙醇提取油茶粕总黄酮；采用体积比例为50%乙醇，提取温度50℃、提取液固比为5:1，提取次数1次，每次提取3h，提取在搅拌条件下进行，搅拌速率为100转每分钟，提取液减压浓缩回收乙醇，得到油茶粕黄酮粗提物；

（2）大孔吸附树纯化：将步骤（1）得到的油茶粕黄酮粗提物加水配制成浓度为3mg/mL的油茶粕黄酮粗提液，采用大孔吸附树脂动态吸附富集纯化，15%乙醇动态洗脱；上柱量为10BV（柱体积），流速为1BV/h；洗脱流速为1BV/h，洗脱液体积为3BV；洗脱液减压脱醇浓缩，采用冷冻干燥得到样品纯度大于85%的总黄酮；

（3）低压柱精制：将步骤（2）得到的经大孔吸附树脂纯化后的总黄酮，加入少量甲醇溶解进行低压硅胶柱层析，以100-300目的硅胶湿法装柱分离纯化，常压条件下，以乙酸乙酯:甲醇:水为洗脱液，分部收集洗脱液；上样量为1g总黄酮/45g硅胶，乙酸乙酯:甲醇:水(V:V:V)=230:45:8，洗脱液流速为1.0BV/h；其余同实施例2。

实施例7

一种油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，包括以下步骤：

（1）采用乙醇提取油茶粕总黄酮；采用体积比例为70%乙醇，提取温度70℃、提取液固比为10:1，提取次数2次，每次提取2h，提取在搅拌条件下进行，搅拌速率为100转每分钟，提取液减压浓缩回收乙醇，得到油茶粕黄酮粗提物；

（2）大孔吸附树纯化：将步骤（1）得到的油茶粕黄酮粗提物加水配制成浓度为8mg/mL的油茶粕黄酮粗提液，采用大孔吸附树脂动态吸附富集纯化，45%乙醇动态洗脱；上柱量为6BV（柱体积），流速为1.2BV/h；洗脱流速为1BV/h，洗脱液体积为4BV；洗脱液减压脱醇浓缩，采用冷冻干燥得到样品纯度大于85%的总黄酮；

（3）低压柱精制：将步骤（2）得到的经大孔吸附树脂纯化后的总黄酮，加入少量甲醇溶解进行低压硅胶柱层析，以100-300目的硅胶湿法装柱分离纯化，常压条件下，以乙酸乙酯:甲醇:水为洗脱液，分部收集洗脱液；上样量为1g总黄酮/45g硅胶，乙酸乙酯:甲醇:水(V:V:V)=200:40:10，洗脱液流速为0.6BV/h；其余同实施例2。

实施例8

一种油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，包括以下步骤：

（1）采用乙醇提取油茶粕总黄酮；采用体积比例为90%乙醇，提取温度40℃、提取液固比为10:1，提取次数2次，每次提取1h，提取在搅拌条件下进行，搅拌速率为100转每分钟，提取液减压浓缩回收乙醇，得到油茶粕黄酮粗提物；

（2）大孔吸附树纯化：将步骤（1）得到的油茶粕黄酮粗提物加水配制成浓度为8mg/mL的油茶粕黄酮粗提液，采用大孔吸附树脂动态吸附富集纯化，40%乙醇动态洗脱；上柱量为7BV（柱体积），流速为1.5BV/h；洗脱流速为1.5BV/h，洗脱液体积为4BV；洗脱液减压脱醇浓缩，采用冷冻干燥得到样品纯度大于85%的总黄酮；

（3）低压柱精制：将步骤（2）得到的经大孔吸附树脂纯化后的总黄酮，加入少量甲醇溶解进行低压硅胶柱层析，以100-300目的硅胶湿法装柱分离纯化，常压条件下，以乙酸乙酯:甲醇:水为洗脱液，分部收集洗脱液；上样量为1g总黄酮/45g硅胶，乙酸乙酯:甲醇:水(V:V:V)=200:30:8，洗脱液流速为0.8BV/h；其余同实施例2。

实施例9

一种油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，包括以下步骤：

（1）采用乙醇提取油茶粕总黄酮；采用体积比例为95%乙醇，提取温度70℃、提取液固比为10:1，提取次数3次，每次提取3h，提取在搅拌条件下进行，搅拌速率为100转每分钟，提取液减压浓缩回收乙醇，得到油茶粕黄酮粗提物；

（2）大孔吸附树纯化：将步骤（1）得到的油茶粕黄酮粗提物加水配制成浓度为6mg/mL的油茶粕黄酮粗提液，采用大孔吸附树脂动态吸附富集纯化，20%乙醇动态洗脱；上柱量为10BV（柱体积），流速为0.8BV/h；洗脱流速为1.2BV/h，洗脱液体积为5BV；洗脱液减压脱醇浓缩，采用冷冻干燥得到样品纯度大于85%的总黄酮；

（3）低压柱精制：将步骤（2）得到的经大孔吸附树脂纯化后的总黄酮，加入少量甲醇溶解进行低压硅胶柱层析，以100-300目的硅胶湿法装柱分离纯化，常压条件下，以乙酸乙酯:甲醇:水为洗脱液，分部收集洗脱液；上样量为0.8g总黄酮/45g硅胶，乙酸乙酯:甲醇:水(V:V:V)=190:25:10，洗脱液流速为0.8BV/h；其余同实施例2。

结构表征

油茶粕乙醇提取液HPLC图谱见图1所示；液相条件：流动相甲醇-水，流动相甲醇在5min内从20%变化到45%，然后45%保持10min，柱温：30℃,流速1.0mL/min，进样量10μL,检测波长266nm；保留时间10.5min为化合物Ⅱ,保留时间11.5min为化合物Ⅰ；大孔吸附树脂纯化后黄酮HPLC图谱见图2所示。化合物Ⅰ经重复硅胶柱层析HPLC图谱见图3所示；化合物Ⅱ经甲醇结晶HPLC图谱见图4所示。

附图5-8是化合物I的结构鉴定图

化合物Ⅰ：淡黄色粉末，mp：183～186。易溶于甲醇，乙醇等极性溶剂，不溶于乙醚，氯仿等极性较小溶剂。三氯化铝反应呈黄色，盐酸-镁粉反应呈红色。UVλmax：351nm，266nm（MeOH）；398nm，325，275nm（NaOH）；390nm，275nm（NaOAc）；396，275nm（AlCl₃/HCl）；396，275nm（AlCl₃/HCl）；351nm，266nm（NaOAc/H₃BO₄）。IR（KBr）νmax：3400.19有强吸收说明存在-OH，2971.01为苯环上C-H振动，1656.18为C=O振动，1608.53，1505.20，1450.22cm^-1为苯环骨架伸缩振动信号，与黄酮的特征吸收一致。ESI-MSm/z：765.3,749.3[M+Na]，725.3[M-H]，证明化合物Ⅰ的分子量为726。1H-NMR（TMS，DMSO-d6，400MHz）图谱在低场区出现了三个活泼酚羟基质子信号δ12.647（1H,s）；δ10.812（1H,s），δ10.172（1H,s），分别归属为5-OH，7-OH，4ˊ-OH。1H-NMR还显示δ8.03和δ6.88（各2H，d，J=7.2Hz），分别归属于B环的2ˊ、6ˊ与3ˊ、5ˊ信号，δ6.19和δ6.4（d，1H，J=1.8Hz）分别归属与A环的H-6和H-8。¹³C-NMR（TMS，DMSO-d6,400MHz）谱给出了30个碳信号，δppm115.61和δppm131.42的峰均比其他峰高，显示这两个峰分别可能是两个位移相同的C信号叠加而得到的，所以推测化合物Ⅰ有32个碳。其中有3个位移为δ100ppm左右的碳信号，提示化合物可能含有两个六碳糖和一个五碳糖，苷元为15个碳信号。δppm115.61和δ131.42这两个峰的C信号归属于B环的C-3ˊ、5ˊ和C-2ˊ、6ˊ。δppm177.84为典型的羰基C-4信号。δppm164.39，161.69，160.32，156.83，156.33，131.42，121.36，104.37，99.09和94.09分别归属于C-7，C-5，C-4ˊ，C-9，C-3，C-2，C-1ˊ，C-10，C-6，C-8信号。综上所述，苷元的化学位移值及特征与文献报导山奈酚基本一致，只是C-2向低场位移了10.1ppm，C-3和C-4向高场移动了3.25ppm和1.3ppm，由此可见山奈酚C-3位-OH可能与糖相连，且木糖等的苷化使C-2信号移动约10ppm。¹³C-NMR给出了δppm98.60，100.86和104.86三个糖的端基C原子信号。1H-NMR给出了三个端基糖质子信号δ5.57ppm，5.20和4.58。化合物Ⅰ经水解后检测有鼠李糖，葡萄糖。根据ESI-MS给出的分子量显示另外一个糖应为五碳糖-木糖。δppm104.86，74.22，76.52，70.75，66.11分别归属于木糖的C-6，C-5，C-4，C-3，C-2，C-1；δppm100.86，69.96，71.02，68.64，72.61，65.38分别归属鼠李糖的C-6，C-5，C-4，C-3，C-2，C-1；δppm98.60，82.05，77.15，69.85，76.21，65.38分别归属葡萄糖的C-6，C-5，C-4，C-3，C-2，C-1。综合以上结果显示,故鉴定化合物Ⅰ结构为：山奈酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷。

附图9-13是化合物II的结构鉴定图

化合物Ⅱ：淡黄色针状晶体，mp：192～194，易溶于甲醇，乙醇等极性溶剂，不溶于乙醚，氯仿等极性较小溶剂。三氯化铝反应呈黄色，盐酸-镁粉反应呈红色，UVλmax：349nm，267nm（MeOH）；399nm，275nm（NaOH）；388nm，275nm（NaOAc）；398，275nm（AlCl₃/HCl）；398，275nm（AlCl₃/HCl）；351nm，266nm（NaOAc/H₃BO₄）。IR（KBr）cm^-1：3386.05有强吸收说明存在-OH，2926.40为苯环上C-H振动，1661.55为C=O振动，1609.88，1499.02和1449.65为苯环骨架伸缩振动信号，与黄酮的特征吸收一致。ESI-MSm/z：795.3[M+K]，779.3[M+Na]，755.3[M-H]，证明化合物Ⅱ的分子量为756。¹H-NMR(TMS，DMSO-d6,400MHz)图谱低场区出现了三个活泼酚羟基质子信号δ12.639（1H，s），ε10.796（1H，s），ε12.639（1H，s），分别归属为5-OH,7-OH，4ˊ-OH，验证与紫外推断结果一致。这些信号在向样品中加重水(D₂O）后即消失。¹H-NMR还显示δ8.0和δ6.9（各2H，d，J=7.2Hz），分别归属于B环的2ˊ、6ˊ与3ˊ、5ˊ信号，δ6.19和δ6.4（d，1H，J=1.8Hz）分别归属与A环的H-6和H-8。¹³C-NMR(，TMS，DMSO-d6,400MHz)谱给出了31个碳信号，δppm115.08和δppm131.05的峰均比其他峰高，显示这两个峰分别可能是两个位移相同的C信号叠加而得到的，所以推测化合物Ⅰ有33个碳。其中有3个位移为δ100ppm左右的碳信号，提示化合物可能含有三个个六碳糖，苷元为15个碳信号。δppm115.08和δ131.05这两个峰的C信号归属于B环的C-3ˊ、5ˊ和C-2ˊ、6ˊ。δppm177.68为典型的羰基C-4信号。δppm162.84，159.85，158.47，156.16，133.31，157.90，121.43，102.09，98.72，和99.85分别归属于C-7，C-5，C-4ˊ，C-9，C-3，C-2，C-1ˊ，C-10，C-6，C-8信号。综上所述，苷元的化学位移值及特征与文献报导山奈酚基本一致，只是C-2向低场位移了11ppm，C-3和C-4向高场移动了3.29ppm和1.18ppm，由此可见山奈酚C-3位-OH可能与糖相连。化合物Ⅱ经水解后检测有半乳糖、鼠李糖和葡萄糖。综合紫外，红外，及其核磁共振显示故鉴定化合物Ⅱ结构为：山奈酚3-O-[2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷。

Claims

1.一种油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，其特征在于步骤（3）得到的化合物I经重复步骤（3），纯度达到95%以上。

3.如权利要求1所述的油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，其特征在于步骤（3）得到的化合物II经在甲醇中结晶，纯度达到98%以上。

4.如权利要求1所述的油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，其特征在于步骤（1）具体为：采用体积比例为50-95%乙醇，提取温度40-70℃，提取液固比为(5-15):1（ml:g），提取次数1-4次，每次提取1-3h，提取液减压浓缩回收乙醇，得到油茶粕黄酮粗提物。

5.如权利要求1所述的油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，其特征在于步骤（2）大孔吸附树脂型号HZ816，颗粒度0.3-1.2。

6.如权利要求1所述的油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，其特征在于步骤（2）具体为：将步骤（1）得到的油茶粕黄酮粗提物加水配制成浓度为3-8mg/mL的油茶粕黄酮粗提液，上柱量为6-11BV（柱体积），上柱流速为0.8-1.5BV/h；洗脱流速为0.8-1.5BV/h，洗脱液体积为3-5BV；洗脱液减压浓缩，采用冷冻干燥得到样品纯度大于85%的总黄酮。

7.如权利要求1所述的油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，其特征在于步骤（3）硅胶目数为100-300目。

8.如权利要求1所述的油茶粕中黄酮苷的快速制备方法，其特征在于步骤（3）具体为：将步骤（2）得到的经大孔吸附树脂纯化后的总黄酮加甲醇溶解，上样量为总黄酮：硅胶（g/g）=（0.8-1.2）:45，洗脱液流速为0.6~1.0BV/h。