从连翘叶中复合提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的方法
技术领域
本发明涉及一种属于连翘叶分离技术领域,特别是一种从天然植物连翘叶中连续提取有效成分连翘酯苷A、连翘苷和芦丁的方法。
背景技术
连翘为木犀科连翘属落叶灌木,是常用药材,传统以果实入药,但民间调查显示,连翘叶有消除便秘,预防感冒,降血脂,降血压等作用。国内己有研究者对连翘叶的化学成分进行了初步分析,并利用连翘叶制成茶叶作为滋补调理饮料应用。连翘叶常作为保健茶使用,化学研究证明,连翘叶与常用药材连翘果实的化学成分有较好一致性,主要含有木质素类、苯丙素苷类、三萜酸类、黄酮类和挥发油类等,并且叶子中的有效生物活性成分如连翘苷、连翘酯苷的含量远高于连翘果实。
连翘苷和连翘酯苷A是国家药典2010年版规定的连翘质量控制指标成分。连翘苷有较好的抗菌、降血脂和减肥作用;连翘酯苷有较好的抗病毒和抗氧化作用,对金黄色葡萄球菌等多种致病菌具有抑制作用,还能抑制磷酸二酯酶、真菌以及活性氧;芦丁具有抗炎、抗病毒、抗氧化、降低毛细血管脆性和通透性等作用。三者在医药和食品领域作为天然药物、天然防腐剂、天然抗氧化剂均具有很广泛的应用前景。
目前各种文献资料中,从连翘果实或连翘叶中只单独提取一种活性成分或者两种,没有合理利用连翘资源,造成资源的严重浪费。如中国专利200610148179.0,200810176773.X,201010235729.9等都是针对一种活性成分进行工艺研究,中国专利201110209731.3公开了一种从连翘叶提取连翘苷和连翘酯苷A的方法,其先通过热水提取,沉淀分离,再用有机溶剂萃取,乙醇重结晶等制备连翘苷和连翘酯苷A,但耗时太长,得率比较低,而且大量芦丁被丢弃。现有技术采用的方法直接水提或水提后有机溶剂萃取,或碱水提取,或酸水提取,没有综合考虑其他活性物质的活性,而且操作复杂,成本较高。目前尚未见到从连翘叶中同时提取分离连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的相关报道。
发明内容
为了解决现有技术中提取分离连翘苷、连翘酯苷A所存在的技术问题,本发明提供了一种方法简单,原料利用率高、可从连翘叶中连续提取分离出连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的方法。
解决上述技术问题所采用的技术方案是由以下步骤组成:
(1)提取
将连翘叶粉碎至40~60目,60~75℃用体积浓度为55%的乙醇浸提40~60分钟,每1g连翘叶对应添加15~40mL的乙醇,优选20~30mL,提取2~3次,合并浸提液,静置,过滤,50~60℃减压浓缩回收乙醇,按照每100mL浓缩液中添加3~6mL的量向浓缩液中添加无水乙醇,优选4~5mL,室温静置,过滤,得到连翘叶提取液;
(2)树脂分离
将连翘叶提取液用大孔吸附树脂吸附,连翘叶与大孔吸附树脂的质量比为1:1.6~2,优选1:1.8,水洗杂质,用体积浓度为30%的乙醇洗脱,洗脱流速为1~3BV/h,洗脱体积为5~8BV,得到馏分Ⅰ,用浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱流速为1~3BV/h,洗脱体积为5~8BV,得到馏分Ⅱ;
(3)沉淀分离
将馏分Ⅰ减压浓缩回收乙醇,室温静置至沉淀物与水分离,得到沉淀物为芦丁粗品,水层为连翘酯苷A粗提液,用水饱和的正丁醇萃取1~3次,回收正丁醇,余液干燥,得到连翘酯苷A粗品;将馏分Ⅱ减压浓缩回收乙醇,室温静置,分离沉淀,得到连翘苷粗品;
(4)纯化
将步骤(3)中所得的连翘苷粗品和芦丁粗品分别用无水乙醇重结晶2~4次,干燥,分别得到连翘苷和芦丁;将连翘酯苷A粗品用体积浓度为30%的甲醇溶解,用C18反相硅胶柱层析分离,体积浓度为30%的甲醇平衡,体积浓度为40%的甲醇洗脱,35~40℃减压浓缩回收甲醇,余液冷冻干燥,得连翘酯苷A。
上述大孔吸附树脂的型号是AB-8或D101。
上述步骤(4)中将连翘苷粗品和芦丁粗品分别用无水乙醇重结晶2~4次,干燥,分别得到连翘苷和芦丁;将连翘酯苷A粗品用体积浓度为30%的甲醇溶解,用C18反相硅胶柱层析分离,3倍柱床体积的浓度为30%的甲醇平衡,体积浓度为40%的甲醇洗脱,35~40℃减压浓缩回收甲醇,冷冻干燥,得连翘酯苷A。
本发明从连翘叶中复合提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的方法是利用连翘叶中的连翘苷为非极性化合物,易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂,难溶于水,连翘酯苷A为极性化合物,易溶于水、甲醇、乙醇等,芦丁易溶于甲醇、热乙醇,不易溶于水的特性,综合考虑,通过乙醇浸提、大孔吸附树脂分离、反相硅胶柱层析连续提取工艺,从连翘叶中复合提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁,能把连翘叶的有效活性成分提取完全,合理利用了连翘叶资源;同时,本发明使用大孔吸附树脂的吸附和解吸附,可分离连翘苷、连翘酯苷A和芦丁,用反相硅胶纯化连翘酯苷A,分离完全,而且纯度较高,工艺条件简单,适合工业化生产。
附图说明
图1为连翘酯苷A、芦丁和连翘苷的标准品混合样与实施例1提取的连翘酯苷A、芦丁和连翘苷制品的高效液相色谱图。
图2为实施例1提取的连翘酯苷A与标准品的紫外扫描对比图。
图3为实施例1提取的芦丁与标准品的紫外扫描对比图。
图4为实施例1提取的连翘苷与标准品的紫外扫描对比图。
具体实施方式
现结合具体的实施例对本发明进行进一步的说明,但本发明的不仅限于下属的实施例。
实施例1
以原料连翘叶40g为例,从连翘叶中连续提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的方法,由以下步骤组成:
(1)提取
将40g连翘叶粉碎至50目,用1000mL体积浓度为55%的乙醇70℃浸提50分钟,连翘叶与乙醇的料液比为1:25g/mL,过滤,滤渣再加入800mL体积浓度为55%的乙醇70℃浸提50分钟,合并2次的浸提液,静置12小时,过滤,55℃减压浓缩回收乙醇,得浓缩液665mL,按照每100mL浓缩液中添加5mL无水乙醇的量向浓缩液中加入33.25mL无水乙醇,室温静置12小时,过滤,得到连翘叶提取液。
(2)树脂分离
将连翘叶提取液通过72g体积为2.6cm(直径)×25cm(柱高)的AB-8大孔吸附树脂柱吸附,连翘叶与AB-8大孔吸附树脂的质量比为1﹕1.8,用1000mL水洗杂质,用725mL体积浓度为30%的乙醇洗脱,洗脱流速为2BV/h,得到馏分Ⅰ,用700mL体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱流速为2BV/h,得到馏分Ⅱ。
(3)沉淀分离
将馏分Ⅰ50℃减压浓缩回收乙醇,得馏分Ⅰ浓缩液70mL,室温静置至沉淀物与水层分离,沉淀物为0.282g芦丁粗品,水层为70mL连翘酯苷A粗提液,用水饱和的正丁醇萃取2次,回收正丁醇,余液在50℃烘箱干燥,得到4.76g连翘酯苷A粗品;将馏分Ⅱ50℃减压浓缩回收乙醇,得馏分Ⅱ浓缩液70mL,室温静置,分离沉淀得到0.735g连翘苷粗品。
(4)纯化
将0.735g连翘苷粗品和0.282g芦丁粗品分别用无水乙醇重结晶3次,干燥,得到纯度95%的0.128g连翘苷和94%的0.149g芦丁;将4.76g连翘酯苷A粗品用8cm(直径)×50cm(柱高)的C18反相硅胶柱层析分离,用体积浓度为30%的甲醇溶解粗品,用3倍反相硅胶柱柱床体积的浓度为30%的甲醇平衡,用体积浓度为40%的甲醇洗脱,经薄层层析法确定,当洗脱到7000mL时开始收集连翘酯苷A洗脱峰,收集体积为3360mL,38℃减压浓缩回收甲醇,余液冷冻干燥,得2.557g纯度为93%的连翘酯苷A。
实施例2
以原料连翘叶40g为例,从连翘叶中连续提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的方法,由以下步骤组成:
(1)提取
将40g连翘叶粉碎至50目,用1200mL体积浓度为55%的乙醇70℃浸提50分钟,连翘叶与乙醇的料液比为1﹕30g/mL,过滤,滤渣再加入800mL体积浓度为55%的乙醇70℃浸提50分钟,合并2次的浸提液,静置12小时,过滤,55℃减压浓缩回收乙醇,得浓缩液,按照每100mL浓缩液中添加5mL无水乙醇的量向浓缩液中加入无水乙醇,室温静置12小时,过滤,得到连翘叶提取液。
(2)树脂分离
将连翘叶提取液通过2.6cm(直径)×25cm(柱高)的AB-8大孔吸附树脂柱吸附,连翘叶与大孔吸附树脂的质量比为1:1.6,用1000mL水洗杂质,用765mL体积浓度为30%的乙醇洗脱,洗脱流速为1BV/h,得到馏分Ⅰ,用700mL体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱流速为1BV/h,得到馏分Ⅱ。
(3)沉淀分离
将馏分Ⅰ50℃减压浓缩回收乙醇,得馏分Ⅰ浓缩液60mL,室温静置至沉淀物与水层分离,沉淀物为0.295g芦丁粗品,水层为70mL连翘酯苷A粗提液,用水饱和的正丁醇萃取2次,回收正丁醇,余液在50℃烘箱干燥,得到4.453g连翘酯苷A粗品;将馏分Ⅱ50℃减压浓缩回收乙醇,得馏分Ⅱ浓缩液100mL,室温静置,分离沉淀得到0.919g连翘苷粗品。
(4)纯化
将0.919g连翘苷粗品和0.295g芦丁粗品分别用无水乙醇重结晶3次,干燥,得到纯度95%的0.160g连翘苷和93%的0.182g芦丁;将4.453g连翘酯苷A粗品用8cm(直径)×50cm(柱高)的C18反相硅胶柱层析分离,用体积浓度为30%的甲醇溶解粗品,用3倍反相硅胶柱柱床体积的浓度为30%的甲醇平衡,用体积浓度为40%的甲醇洗脱,经薄层层析法确定,当洗脱到7000mL时开始收集连翘酯苷A洗脱峰,收集体积为3145mL,38℃减压浓缩回收甲醇,余液冷冻干燥,得2.261g纯度为93%的连翘酯苷A。
实施例3
以原料连翘叶40g为例,从连翘叶中连续提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的方法,由以下步骤组成:
(1)提取
将40g连翘叶粉碎至50目,用1600mL体积浓度为55%的乙醇70℃浸提50分钟,连翘叶与乙醇的料液比为1﹕40g/mL,过滤,滤渣再加入600mL体积浓度为55%的乙醇70℃浸提50分钟,合并2次的浸提液,静置12小时,过滤,55℃减压浓缩回收乙醇,得浓缩液,按照每100mL浓缩液中添加5mL无水乙醇的量向浓缩液中加入无水乙醇,室温静置12小时,过滤,得到连翘叶提取液。
(2)树脂分离
将连翘叶提取液通过2.6cm(直径)×25cm(柱高)的AB-8大孔吸附树脂柱吸附,连翘叶与大孔吸附树脂的质量比为1﹕2,用1000mL水洗杂质,用780mL体积浓度为30%的乙醇洗脱,洗脱流速为3BV/h,得到馏分Ⅰ,用780mL体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱流速为3BV/h,得到馏分Ⅱ。
(3)沉淀分离
将馏分Ⅰ50℃减压浓缩回收乙醇,得馏分Ⅰ浓缩液70mL,室温静置至沉淀物与水层分离,沉淀物为0.319g芦丁粗品,水层为70mL连翘酯苷A粗提液,用水饱和的正丁醇萃取2次,回收正丁醇,余液在50℃烘箱干燥,得到4.528g连翘酯苷A粗品;将馏分Ⅱ50℃减压浓缩回收乙醇,得馏分Ⅱ浓缩液70mL,室温静置,分离沉淀得到0.984g连翘苷粗品。
(4)纯化
将0.984g连翘苷粗品和0.319g芦丁粗品分别用无水乙醇重结晶3次,干燥,得到纯度95%的0.168g连翘苷和93%的0.181g芦丁;将4.528g连翘酯苷A粗品用8cm(直径)×50cm(柱高)的C18反相硅胶柱层析分离,用体积浓度为30%的甲醇溶解粗品,用3倍反相硅胶柱柱床体积的浓度为30%的甲醇平衡,用体积浓度为40%的甲醇洗脱,经薄层层析法确定,当洗脱到7000mL时开始收集连翘酯苷A洗脱峰,收集体积为3280mL,38℃减压浓缩回收甲醇,余液冷冻干燥,得2.304g纯度为92%的连翘酯苷A。
实施例4
以原料连翘叶40g为例,从连翘叶中连续提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的方法,由以下步骤组成:
(1)提取
将40g连翘叶粉碎至50目,用800mL体积浓度为55%的乙醇70℃浸提50分钟,连翘叶与乙醇的料液比为1﹕20g/mL,过滤,滤渣再加入800mL体积浓度为55%的乙醇70℃浸提50分钟,合并2次的浸提液,静置12小时,过滤,55℃减压浓缩回收乙醇,得浓缩液,按照每100mL浓缩液中添加5mL无水乙醇的量向浓缩液中加入无水乙醇,室温静置12小时,过滤,得到连翘叶提取液。
其它的步骤与实施例1相同,连续提取出连翘苷、芦丁、连翘酯苷A。
实施例5
以原料连翘叶40g为例,从连翘叶中连续提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的方法,由以下步骤组成:
(1)提取
将40g连翘叶粉碎至50目,用600mL体积浓度为55%的乙醇70℃浸提50分钟,连翘叶与乙醇的料液比为1﹕15g/mL,过滤,滤渣再加入600mL体积浓度为55%的乙醇70℃浸提50分钟,合并2次的浸提液,静置12小时,过滤,55℃减压浓缩回收乙醇,得浓缩液,按照每100mL浓缩液中添加5mL无水乙醇的量向浓缩液中加入无水乙醇,室温静置12小时,过滤,得到连翘叶提取液。
其它的步骤与实施例1相同,连续提取出连翘苷、芦丁、连翘酯苷A。
实施例6
在上述实施例1~5的从连翘叶中连续提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的方法中,在步骤(1)中,将连翘叶粉碎至40目,60℃用体积浓度为55%的乙醇浸提60分钟,提取3次,合并浸提液,静置,过滤,50℃减压浓缩回收乙醇,按照每100mL浓缩液中添加4mL的量向浓缩液中添加无水乙醇,室温静置,过滤,得到连翘叶提取液。在步骤(2)中,将连翘叶提取液用大孔吸附树脂吸附,水洗杂质,用体积浓度为30%的乙醇洗脱,洗脱流速为3BV/h,得到馏分Ⅰ,用体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱流速为3BV/h,得到馏分Ⅱ。在步骤(3)中,将馏分Ⅰ减压浓缩回收乙醇,室温静置至沉淀物与水分离,得到沉淀物为芦丁粗品,水层为连翘酯苷A粗提液,用水饱和的正丁醇萃取1次,回收正丁醇,余液干燥,得到连翘酯苷A粗品;将馏分Ⅱ减压浓缩回收乙醇,室温静置,分离沉淀,得到连翘苷粗品。在步骤(4)中,将连翘苷粗品和芦丁粗品分别用无水乙醇重结晶2次,干燥,分别得到连翘苷和芦丁;将连翘酯苷A粗品用体积浓度为30%的甲醇溶解,用C18反相硅胶柱层析分离,3倍反相硅胶柱柱床体积的浓度为30%的甲醇平衡,体积浓度为40%的甲醇洗脱,35℃减压浓缩回收甲醇,余液冷冻干燥,得连翘酯苷A。其它的操作与相应的实施例相同。
实施例7
在上述实施例1~5的从连翘叶中连续提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的方法中,在步骤(1)中,将连翘叶粉碎至60目,75℃用体积浓度为55%的乙醇浸提40分钟,提取3次,合并浸提液,静置,过滤,60℃减压浓缩回收乙醇,按照每100mL浓缩液中添加4mL的量向浓缩液中添加无水乙醇,室温静置,过滤,得到连翘叶提取液。在步骤(2)中,将连翘叶提取液用大孔吸附树脂吸附,水洗杂质,用体积浓度为30%的乙醇洗脱,洗脱流速为3BV/h,得到馏分Ⅰ,用体积浓度为50%的乙醇洗脱,洗脱流速为3BV/h,得到馏分Ⅱ。在步骤(3)中,将馏分Ⅰ减压浓缩回收乙醇,室温静置至沉淀物与水分离,得到沉淀物为芦丁粗品,水层为连翘酯苷A粗提液,用水饱和的正丁醇萃取3次,回收正丁醇,余液干燥,得到连翘酯苷A粗品;将馏分Ⅱ减压浓缩回收乙醇,室温静置,分离沉淀,得到连翘苷粗品。在步骤(4)中,将连翘苷粗品和芦丁粗品分别用无水乙醇重结晶4次,干燥,分别得到连翘苷和芦丁;将连翘酯苷A粗品用体积浓度为30%的甲醇溶解,用C18反相硅胶柱层析分离,3倍反相硅胶柱柱床体积的浓度为30%的甲醇平衡,体积浓度为40%的甲醇洗脱,40℃减压浓缩回收甲醇,余液冷冻干燥,得连翘酯苷A。其它的操作与相应的实施例相同。
实施例8
在上述的实施例1~7的从连翘叶中连续提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的方法中,在步骤(1)中,按照每100mL浓缩液中添加3mL的量向浓缩液中添加无水乙醇,室温静置,过滤,其它的操作与相应的实施例相同,得到连翘叶提取液。其它的步骤与相应的实施例相同,分别提取出连翘苷、连翘酯苷A和芦丁。
实施例9
在上述的实施例1~7的从连翘叶中连续提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的方法中,在步骤(1)中,按照每100mL浓缩液中添加6mL的量向浓缩液中添加无水乙醇,室温静置,过滤,其它的操作与相应的实施例相同,得到连翘叶提取液。其它的步骤与相应的实施例相同,分别提取出连翘苷、连翘酯苷A和芦丁。
实施例10
在上述的实施例1~7的从连翘叶中连续提取连翘苷、连翘酯苷A和芦丁的方法中,在步骤(2)中所用的AB-8大孔吸附树脂可以用型号为D101的大孔吸附树脂来替换。其它的操作与相应的实施例相同。
为了进一步确定本发明所提取分离的产物就是连翘酯苷A、连翘苷和芦丁,发明人将实施例1所提取的产物与标准制品通过高效液相色谱法(HPLC)进行检测,具体结果如下:
1、色谱条件:大连依利特色谱柱Hypersil BDS C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流动相为甲醇(A)-水(含0.2%冰醋酸)(B),梯度洗脱:0~3分钟,32%A;3~25分钟,32%~55%A;25~30分钟,55%A,测定波长235nm,流速lmL/min,柱温30℃,进样量10μl。
2、标准对照品溶液的制备:精密称取连翘酯苷A标准品、芦丁标准品和连翘苷标准品,适量,加适量50%甲醇,分别制成每1mL含连翘酯苷A0.2mg、芦丁0.1mg和连翘苷0.24mg的溶液。
3、发明产物溶液的制备:精密吸取一定量制备所得的最终产物的置于容量瓶中,用50%甲醇定容,再经0.45μm微孔滤膜过滤,滤液待用。
先将制备好的连翘酯苷A、芦丁和连翘苷标准对照品溶液取等量混合后通过色谱分析,再将各个发明产物溶液分别通过色谱分析,色谱峰的理论板数按连翘酯苷峰计算在5000以上,结果见色谱图1。
由图1可知,按照本实验的色谱条件,标准品混合样中的连翘酯苷A、芦丁和连翘苷能够得到很好的分离,见洗脱曲线1。与洗脱曲线1相比较,实施例1所提取的连翘酯苷A(洗脱曲线2)、芦丁(洗脱曲线3)和连翘苷(洗脱曲线4)的纯度很高,连翘酯苷A的相对含量为93%,芦丁的相对含量为94%,连翘苷的相对含量为95%。
再将制备好的连翘酯苷A、芦丁和连翘苷标准对照品溶液与实施例1提取的连翘酯苷A、芦丁和连翘苷分别通过紫外扫描进行比对,扫描结果分别见图2、图3和图4。
由图2可见,连翘酯苷A标准对照品的紫外扫描图曲线(曲线1)和实施例1的连翘酯苷A制品的紫外扫描图曲线(曲线2)峰形和吸收峰波长完全吻合,进一步说明发明制品确为连翘酯苷A。由图3可见,芦丁的标准对照品紫外扫描图曲线(曲线1)和实施例1提取的芦丁制品的紫外扫描图曲线(曲线2)峰形和吸收峰波长完全吻合,进一步说明发明制品确为芦丁。由图4可见,连翘苷标准对照品的紫外扫描图曲线(曲线1)和实施例1提取的连翘苷制品的紫外扫描图曲线(曲线2)峰形和吸收峰波长完全吻合,进一步说明发明制品确为连翘苷。