CN105372377B

CN105372377B - 一种原料药连翘苷的质量检测方法

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Publication number: CN105372377B
Application number: CN201410386728.2A
Authority: CN
Inventors: 鲁明明; 王硕; 付强; 王凯乾; 惠敏; 富力; 曲洪颖; 刘正贤; 盖鑫
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Current assignee: Individual
Priority date: 2014-08-07
Filing date: 2014-08-07
Publication date: 2017-09-29
Anticipated expiration: 2034-08-07
Also published as: CN105372377A; WO2016019685A1

Abstract

本发明公开了一种原料药连翘苷的质量检测方法，包括1)鉴别连翘苷、2)测定连翘苷含量、3)有关物质检测。本发明方法主要用于连翘苷原料药及其制剂的质量控制，具有简便、稳定、重复性好的特点，有利于提高检验效率，确保了连翘苷原料药和制剂的治疗效果。

Description

一种原料药连翘苷的质量检测方法

技术领域

本发明涉及一种中草药的检测方法，尤其涉及一种连翘苷药材的质量检测方法。

背景技术

感冒是一种常见病、多发病，临床可分为流行性感冒(即流感)和普通感冒两种，其病因80％以上是由于上呼吸道病毒感染引起。普通感冒症状较轻，一般不会引起其他疾病，且有自愈性；流感则容易引起病毒变异，并可能导致病毒性肺炎、病毒性心肌炎等疾病。流感严重时，可致人昏迷、抽搐、甚至死亡，故流感对人体的危害较大。因此，对流感的治疗亟待解决。

中草药具有抑制流感病毒复制、阻止病毒致细胞病变、调节免疫功能、改善肺循环、镇痛抗炎等综合功效，可使流感痊愈。因此，中药及天然药物在防治流感方面具有独特的优势和广阔的发展前景。中药因具有广泛的药理作用，且毒副作用小，愈来愈引起国内外药理学家、生物学家和化学家们的兴趣，成为研究热点。美国学者从150余种植物水或醇提取物中,发现20余种植物含有显著抗流感病毒的物质。保加利亚学者发现红花老鹤草甲醇提取物中多酚复合物可抑制流感病毒。俄罗斯学者从伞形科独活属植物果实挥发油中发现有抗甲型和乙型流感病毒的有效成分。日本学者从黄芩的根和叶的黄酮类提取物中、从日本五针松多酚类提取物中,以及从鱼腥草的蒸馏液中皆提取到流感病毒抑制物。但目前这些物质皆尚处于未纯化状态。我国学者在80年代大规模普查中,筛选出一批对流感病毒有明显抑制作用的中草药:如金银花、连翘、板蓝根、大青叶、黄芪、黄芩、柴胡、鱼腥草、鹅不食草、葛根、防风等50余种。近年来我国学者用现代科技方法先后对其中一些中草药进行了深入研究，发现许多中草药不仅对流感病毒的增殖有明显抑制作用,而且有些能促进机体的免疫功能。但中药复方制剂，因创新性和市场竞争力弱，难以在世界医药市场流通。中药中天然活性成分具有许多中药复方制剂所不具备的优点，天然活性成分的抗病毒作用，已在抗病毒新药研究领域的中受到了高度重视。明确天然抗病毒成分的结构，研究其结构与药理作用及机制的关联性，是抗病毒新药研发的重要趋势。因此，积极寻求防治流感病毒的有效中药和天然药物制剂，阻止流行性感冒病情的传播和蔓延一直是当前卫生工作的重要课题之一，这也正是我们注重这方面科研课题的主要原因。

连翘[Forsythia suspensa(Thunb.)Vahl]为木犀科连翘属落叶灌木植物,常以果实入药。连翘主产于我国山西、河南、陕西、山东等地。连翘是中药中最常见的药材之一，自1963年以来一直被中国药典收录。其性微寒,味苦,归肺、心、小肠经,具有清热解毒、消肿散结、疏散风热等药理作用，用于风热感冒，温病初起，温热入营，高热烦渴，神昏发斑，热淋涩痛等症。临床常用于急性风热感冒、痈肿疮毒、淋巴结核、尿路感染等症,中医素有“疮家圣药”之称。连翘中的化学成分主要包括萜类、苯乙醇苷类、木脂素类、黄酮类、天然醇类、香豆素、挥发性成分和一些醇、酯、酸、醛、酮等化合物。其中木脂素类化合物连翘苷含量较大且抗菌、抗病毒活性很强。连翘苷是双木脂素类化合物的葡萄糖苷，难溶于水，溶于乙醇、甲醇等有机溶剂，是连翘药材的主要成分之一，中国药典2010年版中将连翘苷作为控制连翘质量的重要指标,规定按干燥品计算,含连翘苷不得低于0.15％。有文献报道，连翘属植物叶子与果实的成分有较好的一致性，连翘叶中的有效成分如连翘苷、连翘酯苷、齐墩果酸等的含量高于果实；连翘叶在我国民间药用已有较长历史，在我国河北、陕西等地有将连翘叶制成珠茶作为保健饮料饮用的习惯，认为连翘叶有清热等作用。李发荣等在对连翘叶中苷类成分的提取工艺的研究中发现，连翘叶中连翘苷的含量是老翘的40倍左右，青翘的3～4倍。大连富生天然药物开发有限公司根据现代医药学理论，采用以正交法确定的最佳提取方案，对连翘叶中连翘苷进行提取，以特制工业柱层析分离和整合重结晶精制工艺，制备出了纯度在90％以上的连翘苷。所以把连翘苷开发成为一种天然药物，用于甲型和乙型流感病毒的预防和治疗，能更加符合目前广大流行性感冒和病毒性感冒患者临床治疗的需要。

为了保证连翘苷药物的质量和疗效，需要建立连翘苷原料药或制剂的质量标准，本发明在大量的实验基础上，公开了一种连翘苷的质量检测方法，为质量控制提供依据。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的问题，提供一种原料药连翘苷的质量检测方法，方法主要用于连翘苷原料药及其制剂的质量控制，具有简便、稳定、重复性好的特点，有利于提高检验效率，确保了连翘苷原料药和制剂的治疗效果。

为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种原料药连翘苷的质量检测方法，包括1)鉴别连翘苷；2)测定连翘苷的含量和3)检测相关物质。

其中，所述鉴别连翘苷包括如下顺序进行的步骤：

1A)将精密称定的连翘苷标准品溶于无水甲醇中，配制成连翘苷对照品溶液；

1B)将精密称定的原料药连翘苷溶于无水甲醇中，配制成连翘苷供试品溶液；

1C)吸取连翘苷对照品溶液、连翘苷供试品溶液、无水甲醇，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇混合溶液为展开剂，展开后，晾干，再喷以显色剂，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品溶液所显主斑点的位置和颜色应与对照品溶液主斑点的位置和颜色相同，且与其它成分的斑点是否得到很好的分离；无水甲醇则在相应位置无斑点，其中所述三氯甲烷-甲醇混合溶液中三氯甲烷与甲醇的体积之比为8.5:1.5；所述显色剂为质量百分比浓度为10％硫酸乙醇溶液。

特别是，步骤1A)中所述连翘苷对照品溶液的浓度为0.1-5mg/ml；步骤1B)中所述连翘苷供试品溶液的浓度为0.1-5mg/ml。

其中，所述测定连翘苷含量包括如下顺序进行的步骤：

2A)将精密称定的连翘苷标准品溶于质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液，超声溶解，配制成连翘苷对照品母液，然后用质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液稀释成每1ml含连翘苷0.1-0.5mg的连翘苷对照品溶液；

2B)将精密称定的原料药连翘苷溶于质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液中，超声溶解，配制成原料药连翘苷供试品母液，然后用质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液稀释成每1ml含原料药连翘苷0.1-0.5mg的原料药连翘苷供试品溶液；

2C)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10-50μl，注入液相色谱仪，测定连翘苷峰面积，按照外标法计算，即得。

特别是，步骤2A)中所述连翘苷对照品溶液的浓度为0.2mg/ml；步骤2B)中所述原料药连翘苷供试品溶液的浓度为0.2mg/ml。

尤其是，步骤2C)中精密吸取的对照品溶液、供试品溶液的体积分别为10μl。

特别是，步骤2C)中所述液相色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，ODS2，5μm)；乙腈(A)-水(B)为流动相；梯度洗脱[0min(25％A)→12min(25％A)→15min(65％A)→20min(65％A)→25min(25％A)→30min(25％A)；流速为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为277nm；理论板数按连翘苷峰计算应不低于4000。

其中，所述检测相关物质包括如下顺序进行的步骤：

3A)将精密称定原料药连翘苷与质量百分比浓度为25％乙腈水溶液混合后，超声溶解，摇匀，制成每1ml含原料药连翘苷1-5mg的原料药连翘苷供试品储备液；接着精密量取供试品储备液适量，用质量百分比浓度为25％乙腈水溶液定量稀释，配制成每1ml中含原料药连翘苷20-100μg的原料药连翘苷溶液；

3B)将精密称定的连翘脂素标准品加入到质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液中，超声溶解，配制成每1ml含连翘脂素标准品50-250μg的连翘脂素对照品溶液；

3C)精密量取连翘脂素对照品溶液10-50μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分连翘苷的色谱峰的峰高为满量程的10-30％，再精密量取连翘苷供试品储备液与连翘苷溶液各10μl，分别注入液相色谱仪。供试品储备液色谱中如果有与连翘脂素保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得大于8.0％；其他单个杂质峰面积，不得大于连翘脂素对照品溶液中的主峰面积的1.0％；其他各杂质峰面积的和不得大于连翘脂素对照品溶液中的主峰面积2.0％；供试品储备液色谱图中任何小于连翘脂素对照品溶液主峰面积0.05倍的峰可忽略不计。

特别是，步骤3A)中所述原料药连翘苷溶液的浓度为20μg/ml；步骤3B)中所述连翘脂素对照品溶液的浓度为50μg/ml。

尤其是，步骤3C)中所述液相色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm)；乙腈(A)-水(B)为流动相；梯度洗脱[0min(12％A)→5min(15％A)→15min(20％A)→30min(20％A)→60min(25％A)→70min(38％A)→85min(38％A)→90min(12％A)→105min(12％A)]；流速为1.0ml/min；柱温30℃；检测波长为277nm；理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000，主峰及各杂质峰分离度不得低于1.5。

其中，所述原料药连翘苷按照如下步骤制备而成：

A)采用溶剂对连翘叶或连翘果实进行加热回流提取2～3次，每次2～4小时；B)提取液浓缩后静置，析出沉淀，获得连翘苷沉淀；C)将连翘苷沉淀采用溶剂溶解后，静置，析出结晶，获得连翘苷粗品；D)用溶剂对连翘苷粗品进行重结晶处理，即得原料药翘苷。

特别是，步骤A)、C)、D)中所述溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、含水甲醇或含水乙醇。

特别是，所述含水甲醇的质量百分比浓度为70-95％；所述含水乙醇的质量百分比浓度为70-95％。

其中，步骤B)中静置的温度为室温，优选为10-35℃，进一步优选为20-25℃；静置时间为1-48h；步骤B)中提取液浓缩后的体积与原提取液的体积之比为0.1-0.5：1。

特别是，步骤D)中所述重结晶处理的温度为室温，优选为10-35℃，进一步优选为20-25℃。

特别是，所述原料药连翘苷的质量检测方法还包括步骤4)检测溶剂残留，所述溶剂残留检测包括如下步骤：

4A)将精密称取原料药连翘苷置于10ml顶空瓶中，精密量取水5.0ml，加入顶空瓶中，溶解，密封振摇，制成每1ml含原料药连翘苷0.1mg的原料药连翘苷供试品溶液；

4B)精密称取甲醇适量，加水溶解并稀释，制成每1ml中含300μg甲醇溶液，然后精密量取5ml密封作为甲醇对照品溶液；

4C)分别精密量取原料药连翘苷供试品溶液、甲醇对照品溶液各1ml，顶空进样，注入气相相色谱仪，测定，测定的色谱条件如下：

气相色谱柱：用ZB-WAXplus石英毛细管柱；载气：氮气；升温程序：起始温度为35℃，维持13分钟，以每分种30℃的速率升温至230℃，维持10分钟，进样口温度为250℃，检测器温度为270℃，顶空瓶瓶口温度为80℃，平衡时间为10分钟。

尤其是，步骤4A)中所述原料药连翘苷供试品溶液的浓度为0.1mg/ml；步骤4B)中所述甲醇溶液的浓度为300μg/ml。

特别是，所述原料药连翘苷的质量检测方法还包括步骤5)干燥失重检测，所述干燥失重检测包括：精密称定原料药连翘苷1.0-5.0g，置于五氧化二磷干燥器中，在真空状态下进行干燥直至连续2次精密承重至衡重，减失的重量不得过5.0％。

特别是，所述原料药连翘苷的质量检测方法还包括步骤6)炽灼残渣检测，所述干炽灼残渣检测包括：

6-1)精密称定原料药连翘苷1.0g，置于已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定原料药与坩埚的总重量；

6-2)置于炭化炉内，缓缓炽灼至原料药完全炭化，放冷至室温；

6-3)加硫酸0.5～1ml使湿润，小火下加热至硫酸蒸气除尽后，在500～600℃炽灼，使完全灰化；

6-4)将灰化后的残渣移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500～600℃炽灼至恒重，计算即得，炽灼残渣不得过0.1％。

尤其是，步骤6-3)中所述小火的温度为350-450℃；所述硫酸的质量百分比浓度为98％(m/m)。

特别是，所述原料药连翘苷的质量检测方法还包括步骤7)重金属检测，所述重金属检测包括：

7-1)精密称定原料药连翘苷1.0g，置于已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定原料药与坩埚的总重量；

7-2)置于炭化炉内，缓缓炽灼至原料药完全炭化，放冷至室温；

7-3)加硫酸0.5～1ml使湿润，小火下加热至硫酸蒸气除尽后，在500～600℃炽灼，使完全灰化；

7-4)将灰化后的残渣移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500～600℃炽灼至恒重；

7-5)加硝酸0.5ml，蒸干,至氧化氮蒸气除尽后，放冷，加盐酸2ml，置水浴上蒸干后加水15ml，滴加氨试液至对酚酞指示液显中性，再加醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml，混匀后，移置纳氏比色管中，加水稀释成25ml，制得原料药连翘苷供试品溶液；

7-6)取硝酸0.5ml，蒸干,至氧化氮蒸气除尽后，放冷，加盐酸2ml，置水浴上蒸干后加水15ml，滴加氨试液至对酚酞指示液显中性，再加醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml，混匀后，移置纳氏比色管中，加标准铅溶液1ml，加水稀释成25ml，制得重金属对照品溶液；

7-7)将纳氏比色管同置白纸上，自上向下透视，样品管中显出的颜色与标准铅溶液管比较,不得深于标准铅溶液管的颜色(即样品管中重金属含量小于10μg/g)。

尤其是，步骤7-3)中所述小火的温度为350-450℃；步骤7-5)中所述氨试液按照如下方法配制而成：取浓氨水(27％(m/m))400ml，加水稀释到1000ml，即得。

其中，步骤7-5)、7-6)中所述醋酸盐缓冲液按照如下方法配制而成：取醋酸铵25g，加水25ml溶解后，加7mol/L盐酸溶液38ml，用2mol/L盐酸溶液准确调节PH值至3.5(电位滴定法)，用水稀释至100ml，即得。

特别是，步骤7-3)中所述硫酸的质量百分比浓度为98％(m/m)；步骤7-5)中所述硝酸的质量百分比浓度为90％(m/m)；所述盐酸的质量百分比浓度为37％(m/m)。

其中，步骤7-6)中所述标准铅溶液按照如下方法配制而成：精密称取硝酸铅0.160g，置于1000ml量瓶中,加硝酸(90％，m/m)5ml与水50ml溶解后，用水稀释至刻度，摇匀，作为标准铅溶液贮备液；临用前，精密量取贮备液10ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

特别是，所述原料药连翘苷的质量检测方法还包括步骤8)砷盐检测，所述砷盐按照砷盐检查法(中国药典2010年版一部附录ⅨF第一法)测定。

本发明的有益效果体现在以下方面：

1、本发明方法操作简便、操作过程稳定、重复性较好，有利于提高检验效率，降低了检测成本，提高经济效益。

2、本发明方法提高了连翘苷原料药及制剂的质量的可控性，可以检测规模性生产，确保了连翘苷原料药和制剂的质量及疗效。

附图说明

图1是本发明连翘苷鉴别的薄层色谱显色图；

图2是本发明原料药连翘苷含量测定的标准曲线图；

图3是本发明原料药连翘苷中相关物质连翘脂素含量测定的标准曲线图；

图4是本发明原料药连翘苷中砷含量测定的装置示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步描述本发明所述连翘苷的质量检测方法，以下实施例包括了本发明的连翘苷的鉴别方法和含量测定方法。这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。

本发明实施例如下，其中所使用的仪器与试药为：

超声波清洗机(型号：LTA-1000S；佛山市林泰超声清洗设备科技有限公司)；

岛津色谱仪(LC-10AT输液泵；SPD-10Avp检测器)；

色谱柱(型号：Hypersil ODS24.6mm×250mm×5μm，广州市自力色谱科仪有限公司)；

薄层板(青岛海洋化工厂)；

气相色谱仪：安捷伦气相7890A GC；FID检测器；

气相色谱柱：用ZB-WAXplus石英毛细管柱；

供试品：连翘苷原料药样品3批(采用实施例1的方法制备，批号：20140301、20140302、20140303；白色固体，大连富生天然药物开发有限公司生产)，其中，批号：20140301的连翘苷原料药的含水率为2.4％；

连翘苷标准品(纯度＞98％，购自中国药品生物制品检定所，批号：110821-201112)；连翘脂素标准品(大连富生天然药物开发有限公司生产，经高效液相色谱两种检测器紫外检测器和蒸发光散射检测器面积归一化法测定，其纯度为99.1％)；

乙腈(色谱纯，Fisher公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；其他试药均为分析纯。

试验例1 连翘苷的鉴别

1、制备供试品溶液

分别取批号为20140301、20140302、20140303的原料药连翘苷样品适量，研细后分别称取连翘苷样品(55.2mg、55.4mg、54.7mg)，置于50mL的容量瓶中，加入无水甲醇适量，摇匀，溶解后置于超声仪进行超声处理60min，接着冷却至室温(15-35℃)，然后加入甲醇至容量瓶刻度线，摇匀，得到3个原料药连翘苷供试品溶液(标记为20140301供试品溶液、20140302供试品溶液、20140303供试品溶液)。

2、制备对照品溶液

取连翘苷标准品适量，研细后，精密称定连翘苷标准品(10mg)，加入无水甲醇，配制成每1ml含0.4mg连翘苷的连翘苷对照品溶液。

3、薄层色谱法鉴别

吸取上述3个供试品溶液、对照品溶液、无水甲醇各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为8.5:1.5的三氯甲烷-甲醇混合溶液为展开剂，置于层析展开缸(北京化工厂)中展开，取出硅胶G薄层板，晾干，喷以显色剂(10％硫酸乙醇溶液)，在105℃加热至斑点显色清晰。

3个供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显示相同颜色斑点，Rf值为0.51，与其它成分的斑点得到很好的分离；阴性样品(即无水甲醇)在相应位置无斑点，如图1所示。

试验例2 连翘苷含量测定

1、色谱条件及系统适用性

1-1)取连翘苷标准品适量，研细后，精密称定连翘苷标准品(10.87mg)，置100ml量瓶中，加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液溶解，定容至刻度，作为对照品储备液；

1-2)分5次精密吸取连翘苷对照品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，进行测定，记录连翘苷峰面积(A)，测定的色谱条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，ODS2，5μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱[0min(25％A)→12min(25％A)→15min(65％A)→20min(65％A)→25min(25％A)→30min(25％A)]，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为277nm。理论板数按连翘苷峰计算应不低于4000；连翘苷与杂质的分离度>1.5，并且杂质尽快出峰，杂质出峰时间短，缩短检测时间，表明本发明是系统适用性好。

2、线性范围

2-1)精密称取连翘苷对照品19.77mg至25ml量瓶中，加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液适量，超声溶解后再加入加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液稀释，定容至刻度，制得连翘苷对照品储备液；

2-2)分别6次精密吸取步骤3-1)制备的连翘苷对照品储备液适量，分别置于6个10ml的容量瓶中，精密加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液，稀释至刻度，摇匀，制成浓度为38.3μg/ml、76.5μg/ml、153.1μg/ml、229.7μg/ml、306.2μg/ml、382.7μg/ml的连翘苷对照品溶液；

2-3)分别精密吸取上述连翘苷对照品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，进行测定，记录色谱峰，计算连翘苷峰面积(A)，测定的色谱条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，ODS2，5μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱[0min(25％A)→12min(25％A)→15min(65％A)→20min(65％A)→25min(25％A)→30min(25％A)]，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为277nm。理论板数按连翘苷峰计算应不低于4000；

以样品浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为Y＝6424X+11647，R²＝0.9998，N＝6，连翘苷浓度在38.3-382.7μg/ml范围内呈良好的线性关系，如图2所示。

3、稳定性试验

取步骤3-2)制备的浓度为153.1μg/ml的连翘苷对照品溶液并于0，4，8，12，18，24小时间隔分别精密吸取10μl，分别注入高效液相色谱仪中，按照步骤2的色谱条件进行测定，记录色谱峰，计算连翘苷峰面积(A)，连翘苷峰面积值的RSD为0.39％，表明连翘苷对照品溶液在24小时内稳定，结果见表1。

表8 稳定性试验结果

4、精密度试验

精密吸取步骤3-2)制备的连翘苷对照品溶液(浓度为153.1μg/ml)10μl，注入高效液相色谱仪中，重复进样6次，按照步骤2的色谱条件进行测定，记录连翘苷峰面积(A)，连翘苷峰面积值的RSD为0.05％，表明本发明方法的仪器精密度高，结果见表2。

表2 精密度试验结果

5、重复性试验

5-1)按照表3分别精密称取实施例1方法制备的批号为20140301的原料药连翘苷6份至50ml量瓶中，加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液适量，超声溶解后再加入加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液稀释，定容至刻度，制成原料药连翘苷供试品液；

5-2)分别精密吸取上述原料药连翘苷供试品液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，测定并记录色谱峰，计算原料药连翘苷峰含量，测定的色谱条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，ODS2，5μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱[0min(25％A)→12min(25％A)→15min(65％A)→20min(65％A)→25min(25％A)→30min(25％A)]，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为277nm。理论板数按连翘苷峰计算应不低于4000；测定结果如表3所示。

表3 HPLC方法学重复性试验结果

本发明方法测定的原料药连翘苷的平均含量为90.3％，RSD＝0.16％，重复性良好。

6、加样回收率试验

6-1)取实施例1方法制备的批号为20140301、含量为90.3％的原料药连翘苷研细混匀，按照表4精密称定后置于100ml容量瓶中，加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液适量，超声溶解后再加入加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液稀释，定容至刻度，制成原料药连翘苷供试品液；

6-2)分别精密吸取上述原料药连翘苷供试品液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，测定并记录色谱峰，计算回收率，测定的色谱条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，ODS2，5μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱[0min(25％A)→12min(25％A)→15min(65％A)→20min(65％A)→25min(25％A)→30min(25％A)]，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为277nm。理论板数按连翘苷峰计算应不低于4000；测定结果如表4所示。

表4 HPLC方法学回收率测定试验结果

7、方法耐用性试验

7-1)精密称取实施例1方法制备的批号为20140301的原料药连翘苷(22.4mg)至100ml量瓶中，加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液适量，超声溶解后再加入加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液稀释，定容至刻度，制成浓度为0.2mg/ml的原料药连翘苷供试品液；

7-2)分别精密吸取上述原料药连翘苷供试品液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，并按照表5的系统条件参数测定并记录色谱峰，计算原料药连翘苷峰含量，测定的色谱条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，ODS2，5μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱[0min(25％A)→12min(25％A)→15min(65％A)→20min(65％A)→25min(25％A)→30min(25％A)]，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为277nm。理论板数按连翘苷峰计算应不低于4000；测定结果如表5所示。

表5 耐用性考察表

试验例3 相关物质测定

1、连翘脂素检出限

1-1)精密称取连翘脂素对照品(10.87mg)置于100ml的容量瓶中，加入质量百分比浓度为25％乙腈适量，超声溶解后再加入25％(m/m)的乙腈水溶液逐级稀释，定容至刻度，制得浓度为0.22ng/μl的连翘脂素对照品溶液；

1-2)精密吸取该对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，计算信噪比(S/N)。测定的色谱条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm)；乙腈(A)-水(B)为流动相；梯度洗脱[0min(12％A)→5min(15％A)→15min(20％A)→30min(20％A)→60min(25％A)→70min(38％A)→85min(38％A)→90min(12％A)→105min(12％A)]；流速为1.0ml/min；柱温30℃；检测波长为277nm。

连翘脂素检出限测定结果如下：本发明方法的信噪比(S/N)≥3，测定结果表明本方法的连翘脂素检出限为2.2ng(0.22ng/μl*10μl)。

2、连翘脂素定量限

2-1)精密称取连翘脂素对照品(10.87mg)置于100ml的容量瓶中，加入质量百分比浓度为25％乙腈适量，超声溶解后再加入25％的乙腈水溶液稀释，定容至刻度，制得浓度为1.09ng/μl的连翘脂素对照品溶液；

2-2)精密吸取该对照品溶液10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，计算信噪比(S/N)。测定的色谱条件如下：

连翘脂素定量限测定结果如下：本发明方法的信噪比(S/N)≥10，测定结果表明本方法的连翘脂素定量限为10.9ng(1.09ng/μl*10μl)。

3、连翘脂素线性范围

3-1)精密称取连翘脂素对照品10.87mg至100ml量瓶中，加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液适量，超声溶解后再加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液稀释，定容至刻度，制得连翘脂素对照品储备液；

3-2)分别6次精密吸取步骤3-1)制备的连翘脂素对照品储备液适量，分别置于6个10ml的容量瓶中，精密加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液，稀释至刻度，摇匀，制成浓度为32.6μg/ml、43.5μg/ml、54.4μg/ml、65.2μg/ml、76.1μg/ml、87.0μg/ml的连翘脂素对照品溶液；

3-3)分别精密吸取上述连翘苷对照品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中测定，记录色谱峰，计算连翘苷脂素面积(A)，测定的色谱条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，ODS2，5μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱[0min(12％A)→5min(15％A)→15min(20％A)→30min(20％A)→60min(25％A)→70min(38％A)→85min(38％A)→90min(12％A)→105min(12％A)]，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为277nm。理论板数按连翘脂素峰计算应不低于3000；

以连翘脂素对照品浓度(μg/ml)为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为Y＝4733.8x-84889，R²＝0.9986，N＝6，连翘脂素浓度在32.6～87.0μg/ml范围内呈良好的线性关系，如图3所示。

4、稳定性试验

4-1)精密称定实施例1方法制备的批号为20140301的原料药连翘苷10.89mg于200ml量瓶中，加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液适量，超声溶解后再加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液稀释，定容至刻度，制得浓度为0.05mg/ml的原料药中相关物质连翘脂素供试品溶液；

4-2)分别于0、8、16、18、24、30h的间隔分别精密吸取10μl，分别注入高效液相色谱仪中，按照步骤3)的色谱条件进行测定，记录色谱峰，计算连翘脂素峰面积(A)，连翘脂素峰面积值的RSD为1.7％，表明连翘脂素对照品溶液在30小时内稳定，结果见表6。

表6 连翘脂素稳定性试验

5、精密度试验

5-1)精密称取连翘脂素对照品10.90mg至200ml量瓶中，加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液适量，超声溶解后再加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液稀释，定容至刻度，制得浓度为0.05mg/ml的连翘脂素对照品溶液；

5-2)分6次精密吸取连翘脂素对照品溶液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，按照步骤3)的色谱条件进行测定，记录色谱峰，计算连翘脂素峰面积(A)，连翘脂素峰面积值的RSD为0.86％，表明本发明方法的仪器精密度高，结果见表7。

表7 仪器精密度试验结果

6、重复性试验

6-1)按照表8，分别精密称取实施例1方法制备的批号为20140301的原料药连翘苷6份至25ml量瓶中，加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液适量，超声溶解后再加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液稀释，定容至刻度，制成浓度为1.18-1.28mg/ml的原料药连翘苷供试品液；

6-2)分别精密吸取上述原料药连翘苷供试品液各10μl，分别注入高效液相色谱仪中，测定并记录色谱峰，按外标法以峰面积计算原料药中连翘脂素峰含量，测定的色谱条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，ODS2，5μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱[0min(12％A)→5min(15％A)→15min(20％A)→30min(20％A)→60min(25％A)→70min(38％A)→85min(38％A)→90min(12％A)→105min(12％A)]，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为277nm。理论板数按连翘脂素峰计算应不低于4000；测定结果如表8所示。

表8 HPLC方法学重复性试验结果

本发明方法测定的原料药连翘苷的相关物质连翘脂素的平均含量为5.6％，RSD＝1.8，重复性良好。

7、回收率试验

7-1)精密称取连翘脂素标准品(10.9mg)置于200ml的容量瓶中，加入质量百分比浓度为25％乙腈适量，超声溶解后再加入25％的乙腈水溶液稀释，定容至刻度，制得浓度为0.05mg/ml的连翘脂素对照品溶液；

7-2)取实施例1方法制备的批号为20140301、含量为90.3％的原料药连翘苷研细混匀，按照表9精密称定后置于25ml容量瓶中，加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液适量，超声溶解后再加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液稀释，定容至刻度，制成原料药连翘苷供试品溶液；

7-3)精密量取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算连翘脂素的量，并计算回收率，测定的色谱条件如下：

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，ODS2，5μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱[0min(12％A)→5min(15％A)→15min(20％A)→30min(20％A)→60min(25％A)→70min(38％A)→85min(38％A)→90min(12％A)→105min(12％A)]，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为277nm。理论板数按连翘脂素峰计算应不低于4000；测定结果如表9所示。

表9连翘脂素回收率测定试验结果

试验例4 残留溶剂

取实施例1制备的批号为20140301的原料药连翘苷研细后精密称取原料药连翘苷样品(0.5g)，置于10ml顶空瓶中，精密量取水(5.0ml)，加入到顶空瓶中，密封振摇，溶解，制成原料药连翘苷供试品溶液；

称取甲醇适量，精密称定，加水溶解并稀释，制成每1ml中含300μg甲醇溶液，接着精密量取5ml甲醇溶液，密封作为甲醇对照品溶液；

分别精密量取原料药连翘苷供试品溶液、甲醇对照品溶液各1ml，顶空进样，注入气相相色谱仪，测定，测定的色谱条件如下：

气相相色谱仪测定，记录色谱图，按外标法，以峰面积计算，应符合规定。

实施例1

1、原料药连翘苷的制备

干燥的连翘叶1kg，加入95％(m/m)乙醇10kg，加热回流提取2次，每次2小时，过滤，滤液减压浓缩至原体积的1/2，于25℃放置1h，析出沉淀；再用甲醇溶解，进行重结晶，析出沉淀；重复上述方法用甲醇重结晶，得无定形粉末状态的原料药连翘苷。

原料药连翘苷为淡黄色至黄色粉末，有一定吸湿性；无臭，味微苦。

实施例2

干燥的连翘果实1kg，加入甲醇10kg，加热回流提取3次，每次4小时，过滤，滤液减压浓缩至原体积的1/10，于20℃放置48h，析出沉淀；再用乙醇溶解，进行重结晶，析出沉淀；重复上述方法用乙醇重结晶，得连无定形粉末状态的原料药连翘苷。

实施例3

干燥的连翘叶1kg，加入70％(m/m)甲醇10kg，加热回流提取3次，每次3小时，过滤，滤液减压浓缩至原体积的1/3，于室温放置2h，析出沉淀；再用90％甲醇溶解之，进行重结晶，析出沉淀；重复上述方法用甲醇重结晶，得连无定形粉末状态的原料药连翘苷。

实施例4 质量标准检测

1、连翘苷含量测定

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，ODS2，5μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱[0min(25％A)→12min(25％A)→15min(65％A)→20min(65％A)→25min(25％A)→30min(25％A)，流速为1.0mL/min，柱温30℃，检测波长为277nm。理论板数按连翘苷峰计算应不低于4000；

1-1)取连翘苷标准品适量，研细后，精密称定连翘苷标准品(10mg)，加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液，超声溶解，配制成每1ml含连翘苷0.2mg的连翘苷对照品溶液；

1-2)取实施例1制备的连翘苷原料药适量，研细后精密称取连翘苷样品(22.1mg)，置于100mL的容量瓶中，加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液适量，摇匀，溶解后置于超声仪进行超声处理60min，接着冷却至室温(15-35℃)后加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液至容量瓶刻度线，摇匀，制成每1ml含原料药连翘苷0.2mg的原料药连翘苷供试品溶液；

1-3)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，计算，原料药连翘苷中连翘苷含量为92.3％。

“2010版药典一部收录连翘苷原药材的液相检测方法与本发明方法的不同在于：本研究方法在连翘苷主成分峰洗脱之后，增加了梯度洗脱，缩短了检测运行时间，为大生产检测节约时间”

2、连翘苷鉴定

2-1)取实施例1制备的原料药连翘苷样品适量，研细后称取连翘苷样品(10mg)，置于10mL的容量瓶中，加入无水甲醇适量，摇匀，溶解后置于超声仪进行超声处理60min，接着冷却至室温(15-35℃)，然后加入甲醇至容量瓶刻度线，摇匀，得到原料药连翘苷供试品溶液；

2-2)取连翘苷标准品适量，研细后称取连翘苷标准品(10mg)，加入无水甲醇，配制成每1ml含1mg连翘苷的连翘苷对照品溶液；

2-3)吸取上述供试品溶液、对照品溶液、无水甲醇各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以体积比为8.5:1.5的三氯甲烷-甲醇混合溶液为展开剂，展开，然后取出硅胶G薄层板，晾干，喷以显色剂(10％硫酸乙醇溶液)，在105℃加热至斑点显色清晰。。

供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显示相同颜色斑点，Rf值为0.51，与其它成分的斑点得到很好的分离；阴性样品(即无水甲醇)在相应位置无斑点

3、相关物质检测

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(4.6mm×250mm，5μm)，乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱[0min(12％A)→5min(15％A)→15min(20％A)→30min(20％A)→60min(25％A)→70min(38％A)→85min(38％A)→90min(12％A)→105min(12％A)]，流速为1.0ml/min，柱温30℃，检测波长为277nm。理论板数按连翘苷峰计算应不低于3000，主峰及各杂质峰分离度不得低于1.5；

3-1)取步骤1制备的连翘苷原料药适量，研细后精密称取连翘苷样品(55.2mg)，置于50mL的容量瓶中，加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液适量，摇匀，溶解后置于超声仪进行超声处理60min，接着冷却至室温(15-35℃)后加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液至容量瓶刻度线，摇匀，制成每1ml含原料药连翘苷1mg的原料药连翘苷供试品溶液；

3-2)精密量取供试品溶液适量，用质量百分比浓度为25％乙腈水溶液定量稀释成每1ml中约含连翘苷20μg的溶液，作为原料药连翘苷溶液；

3-3)取连翘脂素标准品适量，研细后，精密称定，加入质量百分比浓度为25％的乙腈水溶液，超声溶解，配制成每1ml含连翘脂素50μg的连翘脂素对照品溶液；

3-4)精密量取连翘脂素对照品溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分连翘脂素的色谱峰的峰高约为满量程的25％；

3-5)精密量取原料药连翘苷供试品溶液、对照溶液各10μl，分别注入液相色谱仪。供试品溶液色谱中如有与连翘脂素保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算，不得大于8.0％；其他单个杂质峰面积，不得大于对照溶液中的主峰面积的0.5倍(1.0％)；其他各杂质峰面积的和不得大于对照溶液中的主峰面积(2.0％)。供试品溶液色谱图中任何小于对照溶液主峰面积0.05倍的峰可忽略不计。

4、溶剂残留

4-1)实施例1制备的连翘苷原料药适量，研细后精密称取连翘苷样品(0.5g)，置于10ml顶空瓶中，精密量取水(5.0ml)，加入到顶空瓶中，密封振摇，溶解，作为原料药连翘苷供试品溶液；

4-2)称取甲醇适量，精密称定，加水溶解并稀释，制成每1ml中含300μg甲醇溶液，接着精密量取5ml甲醇溶液，密封作为对照品溶液；

4-3)分别精密量取原料药连翘苷供试品溶液、甲醇对照品溶液各1ml，顶空进样，注入气相相色谱仪，测定，记录色谱图。按外标法，以峰面积计算，测定的色谱条件如下：

气相色谱柱：用ZB-WAXplus(或极性相近为固定液的)石英毛细管柱；载气：氮气；升温程序：起始温度为35℃，维持13分钟，以每分种30℃的速率升温至230℃，维持10分钟，进样口温度为250℃，检测器温度为270℃，顶空瓶瓶口温度为80℃，平衡时间为10分钟。

5、干燥失重

按照2010年版药典一部附录附录ⅧL(干燥失重测定法)测定。具体如下：

精密称取步骤1制备的原料药连翘苷1.0g，放置于五氧化二磷干燥器中，减压干燥至衡重，减失重量不得超过5.0％。

6、炽灼残渣

按照炽灼残渣检查法(2010年版药典一部附录附录ⅧN)进行测定，具体如下：

精密称取步骤1制备的原料药连翘苷1.0g，置于已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定原料药与坩埚的总重量，接着缓缓炽灼至原料药完全炭化，放冷至室温；加硫酸(质量百分比浓度98％)0.5～1ml使湿润，低温(350-450℃)加热至硫酸蒸气除尽后，在500～600℃炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500～600℃炽灼至恒重，炽灼残渣不得超过0.1％。

7、重金属

按照重金属检查法(2010年版药典一部附录ⅧH第二法)测定，具体如下：

精密称取步骤1制备的原料药连翘苷1.0g，置于已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定原料药与坩埚的总重量，接着缓缓炽灼至原料药完全炭化，放冷至室温；加硫酸(质量百分比浓度98％，m/m)0.5～1ml使湿润，低温(350-450℃)加热至硫酸蒸气除尽后，在500～600℃炽灼使完全灰化，移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500～600℃炽灼至恒重；向遗留的残渣中加硝酸(90％，m/m)0.5ml，蒸干,至氧化氮蒸气除尽后，放冷，加盐酸(37％，m/m)2ml，置水浴上蒸干后加水15ml，滴加氨试液至对酚酞指示液显中性，再加醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml，混匀后，移置纳氏比色管中，加水稀释成25ml，制得原料药连翘苷供试品溶液；取硝酸0.5ml，蒸干,至氧化氮蒸气除尽后，放冷，加盐酸2ml，置水浴上蒸干后加水15ml，滴加氨试液至对酚酞指示液显中性，再加醋酸盐缓冲液(pH3.5)2ml，混匀后，移置纳氏比色管中，加标准铅溶液1ml，加水稀释成25ml，制得重金属对照品溶液；

将纳氏比色管同置白纸上，自上向下透视，样品管中显出的颜色与标准铅溶液管比较,不得深于标准铅溶液管的颜色(即样品管中重金属含量小于10μg/g)。

8、砷

按照砷盐检查法(中国药典2010年版一部附录ⅨF第一法)测定，具体如下：

8-1)标准砷溶液的制备称取三氧化二砷0.132g，置1000ml量瓶中，加20％氢氧化钠溶液5ml溶解后，用适量的稀硫酸中和，再加稀硫酸10ml，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。临用前，精密量取贮备液10ml，置1000ml量瓶中，加稀硫酸10ml，用水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml相当于1μg的As)。

8-2)仪器装置如图4，A为100ml标准磨口锥形瓶；B为中空的标准磨口塞，上连导气管C(外径8.0mm，内径6.0mm)，全长约180mm；D为具孔的有机玻璃旋塞，其上部为圆形平面，中央有一圆孔，孔径与导气管C的内径一致，其下部孔径与导气管C的外径相适应，将导气管C的顶端套入旋塞下部孔内，并使管壁与旋塞的圆孔适相吻合，黏合固定；E为中央具有圆孔(孔径6.0mm)的有机玻璃旋塞盖，与D紧密吻合。

测试时，于导气管C中装入醋酸铅棉花60mg(装管高度为60～80mm)，再于旋塞D的顶端平面上放一片溴化汞试纸(试纸大小以能履盖孔径而不露出平面外为宜)，盖上旋塞盖E并旋紧，即得。

8-3)标准砷斑的制备精密量取标准砷溶液2ml，置A瓶中，加盐酸5ml与水21ml，再加碘化钾试液5ml与酸性氛化亚锡试液5滴，在室温放置10分钟后，加锌粒2g，立即将照上法装妥的导气管C密塞于A瓶上，并将A瓶置25～40℃水浴中，反应45分钟，取出溴化汞试纸，即得。

8-4)精密称定原料药连翘苷1.0g，置于已炽灼至恒重的坩埚中，精密称定原料药与坩埚的总重量；置于炭化炉内，缓缓炽灼至原料药完全炭化；接着在500～600℃炽灼，使完全灰化；置A瓶中，加盐酸(质量百分比浓度37％)5ml，水21ml，再加碘化钾试液5ml与酸性氛化亚锡试液5滴，在室温放置10分钟后，加锌粒2g，立即将照上法装妥的导气管C密塞于A瓶上，并将A瓶置25～40℃水浴中，反应45分钟，取出溴化汞试纸，即得。将生成的砷斑与标准砷斑比较，不得更深。(＜2ppm)

实施例5

取按照实施例1制备的批号为20140302原料药连翘苷适量，按照实施例4的方法测定相应的连翘苷含量、连翘苷鉴定、相关物质检测，检测结果表明，批号为20140302样品性状指标与质量标准规定相符，鉴别指标均呈阳性结果，检查指标均符合质量标准的规定，样品含量为91.9％。

实施例6

取按照实施例1制备的批号为20140303原料药连翘苷适量，按照实施例4的方法测定相应的连翘苷含量、连翘苷鉴定、相关物质检测，检测结果表明，批号为20140302样品性状指标与质量标准规定相符，鉴别指标均呈阳性结果，检查指标均符合质量标准的规定，样品含量为92.1％。

尽管上述对本发明做了详细说明，但不限于此，本技术领域的技术人员可以根据本发明的原理进行修改，因此，凡按照本发明的原理进行的各种修改都应当理解为落入本发明的保护范围。

Claims

1.一种原料药连翘苷的质量检测方法，其特征是，包括如下步骤：

1)鉴别连翘苷：

1C)吸取连翘苷对照品溶液、连翘苷供试品溶液、无水甲醇，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇混合溶液为展开剂，展开后，晾干，再喷以显色剂，在105℃加热至斑点显色清晰，其中所述三氯甲烷-甲醇混合溶液中三氯甲烷与甲醇的体积之比为8.5:1.5；所述显色剂为质量百分比浓度为10％硫酸乙醇溶液；

2)测定连翘苷的含量：

2C)分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10-50μl，注入液相色谱仪，测定连翘苷峰面积，按照外标法计算，其中，液相色谱测定的色谱条件如下：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格为4.6mm×250mm，ODS2，5μm；流动相为乙腈/A-水/B；梯度洗脱方式为0min/25％A→12min/25％A→15min/65％A→20min/65％A→25min/25％A→30min/25％A；流速为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为277nm；理论板数按连翘苷峰计算应不低于4000；

3)相关物质检测：

使用连翘质素对照品溶液并使用液相色谱方法进行检测：液相色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，规格为4.6mm×250mm，5μm；流动相为乙腈/A-水/B；梯度洗脱方式为0min/12％A→5min/15％A→15min/20％A→30min/20％A→60min/25％A→70min/38％A→85min/38％A→90min/12％A→105min/12％A；流速为1.0mL/min；柱温30℃；检测波长为277nm。

2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述相关物质检测包括如下顺序进行的步骤：

3C)精密量取连翘脂素对照品溶液10μl注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分连翘苷的色谱峰的峰高为满量程的10-30％，再精密量取连翘苷供试品储备液与连翘苷溶液各10μl，分别注入液相色谱仪。

3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述原料药连翘苷按照如下步骤制备而成：

A)采用溶剂对连翘叶或连翘果实进行加热回流提取2～3次，每次2～4小时；

B)提取液浓缩后静置，析出沉淀，获得连翘苷沉淀；

C)将连翘苷沉淀采用溶剂溶解后，静置，析出结晶，获得连翘苷粗品；

D)用溶剂对连翘苷粗品进行重结晶处理，即得原料药翘苷。

4.如权利要求3所述方法，其特征是所述原料药连翘苷的质量检测方法还包括步骤4)检测溶剂残留，所述溶剂残留检测包括如下步骤：

4A)将精密称取原料药连翘苷置于10ml顶空瓶中，精密量取水5.0ml，加入顶空瓶中，溶解，密封振摇，制成每1ml中含0.1g原料药连翘苷供试品溶液；

5.如权利要求1所述的方法，其特征是所述原料药连翘苷的质量检测方法还包括步骤5)干燥失重检测，所述干燥失重检测包括：精密称定原料药连翘苷1.0-5.0g，置于五氧化二磷干燥器中，在真空状态下进行干燥直至连续2次精密称重至恒重，减失的重量不超过5.0％。

6.如权利要求1所述的方法，其特征是所述原料药连翘苷的质量检测方法还包括步骤6)炽灼残渣检测，所述炽灼残渣检测包括：

6-4)将灰化后的残渣移置干燥器内，放冷至室温，精密称定后，再在500～600℃炽灼至恒重，计算即得，炽灼残渣不超过0.1％。

7.如权利要求1所述的方法，其特征是所述原料药连翘苷的质量检测方法还包括步骤7)重金属检测，所述重金属检测包括：

7-5)加硝酸0.5ml，蒸干,至氧化氮蒸气除尽后，放冷，加盐酸2ml，置水浴上蒸干后加水15ml，滴加氨试液至对酚酞指示液显中性，再加pH＝3.5的醋酸盐缓冲液2ml，混匀后，移置纳氏比色管中，加水稀释成25ml，制得原料药连翘苷供试品溶液；

7-6)取硝酸0.5ml，蒸干,至氧化氮蒸气除尽后，放冷，加盐酸2ml，置水浴上蒸干后加水15ml，滴加氨试液至对酚酞指示液显中性，再加pH＝3.5的醋酸盐缓冲液2ml，混匀后，移置纳氏比色管中，加标准铅溶液1ml，加水稀释成25ml，制得重金属对照品溶液；

7-7)将纳氏比色管同置白纸上，自上向下透视，样品管中显出的颜色与标准铅溶液管比较,不得深于标准铅溶液管的颜色。