CN102445514B - 一种中药制剂金水宝胶囊的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药学领域，具体涉及一种中药制剂金水宝胶囊的检测方法，包括对冬虫夏草菌粉的鉴别方法和对金水宝胶囊中的有效成分进行含量测定的方法，所述鉴别方法采用薄层色谱法，所述含量测定方法采用高效液相色谱法。
Description
发明领域
本发明涉及中药制剂的质量检测方法，特别涉及金水宝胶囊的质量检测方法。
背景技术
金水宝胶囊原料为蝙蝠蛾拟青霉Cs-4，该组份是由中国医学科学院药物研究所采用人工固体培养基培育而成。现代药理实验表明蝙蝠蛾拟青霉Cs-4主要有效成分及功效如下：
虫草多糖：大于等于18％，启动巨噬细胞，增强免疫及造血能力；
腺苷：大于等于0.3％，舒缓压力及紧张情绪、帮助睡眠、增强体力、耐力增加。男士不容易疲倦；女士能活血，提升气血，产前产后调理更佳，面色红润，手暖足温，美容健体。有效维持健康胆固醇；
虫草素：大于等于0.0015％，天然抗生元素，抑制有害细胞生长；
虫草酸(甘露醇)大于等于14.0％，舒畅器官、止咳平喘、减少呼吸道问题、针对鼻部敏感症状、强化肾上腺素、减少呼吸道问题；
麦角甾醇：大于等于0.65％，强化心脏及心血管功能，抑制有害细胞生长；
超氧歧化酶(SOD)：少量，抗氧化、增强脑部供氧量、提升脑力及记忆力，舒缓读书压力。对抗身体或机能老化，令心、肺、肾及脑部保持健康精灵；
蛋白质：31.0％--35.0％，是构成人体细胞及生命活动的基础物质。
处方：发酵虫草菌粉(Cs-4)330g
现有金水宝胶囊质量标准对腺嘌呤及腺苷、尿苷及亮氨酸及丙氨酸、缬氨酸和甘露醇进行了定性鉴别，而且有腺苷含量测定，但现有检测方法操作复杂，精度不高，实际操作过程中容易出现差错，产品质量控制专属性和可控性存在缺陷，难以准确测定金水宝胶囊。本发明经过研究，提出了对有关物质进行准确的鉴别方法和准确的含量测定方法，该方法可以准确测定金水宝胶囊的质量，专属可控、稳定、简便、可行。
方法：增加了对制剂中发酵虫草菌粉的专属鉴别；同时用高效液相法对制剂中的虫草酸(D-甘露醇)进行含量测定；建立以虫草多糖和麦角甾醇含量为生物量指标的质量控制方法。
发明内容
本发明的金水宝胶囊其处方如下：
处方：发酵虫草菌粉(Cs-4)330g，制备成1000粒胶囊。
本发明所述的质量检测方法，包括鉴别方法和含量测定方法。
本发明的方法共有3项，可以使用其中任何一项作为对金水宝胶囊的测定方法，也可以组合使用作为对金水宝胶囊的测定方法，优选的是组合使用。
为此，本发明首先提供一种金水宝胶囊的鉴别方法，本发明的鉴别方法采用薄层色谱法。该方法包括对冬虫夏草菌粉的鉴别，鉴别方法如下：
(1)取金水宝胶囊内容物0.5g，加甲醇10ml，超声处理1h，滤过，滤液作为供试品溶液。另取发酵冬虫夏草菌粉对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。再取麦角甾醇对照品，加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-甲酸(5∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别在日光和紫外光灯(365nm)下检视.供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的斑点；紫外光下显相同颜色的荧光斑点。
其次，本发明还包括对金水宝胶囊中的有效成分进行含量测定，其中所述的有效成分为虫草酸。本发明的含量测定方法采用高效液相层析法。
本发明的含量测定方法，色谱条件：采用Lichromsob NH2色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，乙腈∶水(70-90∶10-25)为流动相，流速为1ml/min，柱温为40℃。
本发明的含量测定方法，优选采用以下方法：
用高效液相色谱法测定虫草酸的含量
色谱条件：采用Lichromsob NH2色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，乙腈∶水(70-90∶10-25)为流动相，流速为1ml/min，柱温为40℃。
供试品溶液的配制：取装量差异项下的金水宝胶囊内容物研细，取约0.3g，精密称定，置100ml量瓶中，加水约50ml超声处理10-25分钟，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
对照品溶液配制：精密称取甘露醇对照品适量，加水制成每1ml含80ug的溶液，即得。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
控制项：本品每粒(以0.32g/粒计)含量甘露醇(C6H16O6)不少于23.1mg
以上的含量测定方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1.提取条件的选择：根据甘露醇易溶于热水、热乙醇、稀酸、稀碱溶液的性质，实验选用超声提取。分别用水超声5、10、15、20、25分钟，结果表明超声时间为15分钟的效果比较好。在实验中，分别以：水、乙醇、0.1mol/盐酸、0.1mol/l氢氧化钠为溶剂，超声处15分钟，结果表明以水处理样品测定效果最佳，且水提取的杂质少，可更好保保护色谱柱，因此本方法采用有水作为提取溶剂。
表1超声时间的选择(批号：090601)
表2提取溶剂的选择(批号：090601)
2.色谱条件考察
2.1流动相的选择：实验先用乙腈和水的四种不同配比的流动相进行考察，其比例分别为75∶25、80∶20、82∶18、85∶15结果表明，四种不同配比的流动相中，乙腈∶水(82∶18)分离效果最，样品分离度、拖尾因子均符合规定。
2.2色谱条件及系统适应性试验：用Lichromsob NH2键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈∶水(82∶18)；示差折光检测器；流速：1ml/min；温度：40℃，理论板数按甘露醇峰计算应不低于3500。甘露醇对照品(批号：中国药品生物制品所提供，供含量测定用)；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2.3对照品溶液的制备：精密称取甘露醇对照品适量，加水制成每1ml含80ug的溶液，即得。
2.4供试品溶液的制备：取装量差异项下的内容物研细，取约0.3g，精密称定，置100ml量瓶中，加水约50ml超声处理15分钟，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
3方法学试验
3.1线性关系
对照品储备液的制备：精密称取甘露醇对照品20.15mg置25ml的量瓶中，加水溶解并定容至刻度，作为储备液(0.806mg/ml)
对照品溶液的制备：分别精密吸取上述储备液0.2、0.5、1.0、1.2、1.6、2.0ml置10.0ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录)测定峰面积，结果见表3，以色谱峰峰面积为纵坐标，浓度为横坐标。绘制标准曲线。
表3线性关系考察表
由回归方程可见，甘露醇量在16.12-161.2ug/ml范围内，色谱峰峰面积与浓度之间有良好的线性关系。
3.2阴性对照试验：按标准处方工艺制备(去除发酵虫草菌粉)阴性对照样品。
将制备的样品按[含量测定]项下甘露醇的方法操作，结果表时：样品中其他组分对该法甘露醇含量测定无干扰。
3.3稳定性试验：取样品，按[含量测定]项下甘露醇的方法制备供试品溶液，分别于第0、2、6、12、24小时依法进行测定，结果见表4。
表4稳定性试验考察表(甘露醇)
结果表明，供试品溶液在24小时内稳定性较好。
3.4精密度试验：取甘露醇对照品溶液(80.60ug/ml)，按高效液相色谱法连续进样五次，每次20ul，进行精密度考察，结果见表5。
表5精密度试验结果
结果表明，本法精密度良好。
3.5重复性试验：分别取同一样品(批号：090601)约0.3g，精密称定五份，按[含量测定]项下甘露醇的方法测定，结果见表6
表6重复性试验结果
结果表明，本法重复性良好。
3.6加样回收试验：精密称取已知含量的样品(批号：090601 27.82mg/粒)五份，分别加入一定量甘露醇标准品，按[含量测定]项下甘露醇的方法测定，结果见表7；
表7加样回收试验结果
平均回收率：99.6％，RSD：0.14％，加样回收率试验结果表明本法准确性较高。
3.7十批样品的含量测定：按[含量测定]项下甘露醇的方法对十批样品进行了含量测，结果见表8：
表8十批样品的含量测定结果
结果表明，测得十批金水宝胶囊的甘露醇含量均在27.82mg/粒以上，考虑工业放大中的损耗误差，因此在最低含量的基础上，下浮20％，因此得到检测标准为金水宝胶囊每粒(以0.32g/粒计)含量甘露醇(C6H16O6)不少于23.1mg
本发明的含量测定方法，还包括对金水宝胶囊中的虫草多糖的含量进行测定的方法，该测定方法如下：
标准品溶液的配制：
精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品12.5mg，置250ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。
标准曲线的制备
精密吸取标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0分别置10ml具塞刻度试管中，各用重蒸馏水补足至每管1.0ml，再分别加入8％苯酚1.0ml摇匀，加浓硫酸5.0ml，充分摇匀后放置5min，置沸水浴中加热15min，取出立即用冷水冷却至室温。另取蒸馏水1.0ml，加苯酚，浓硫酸同法操作为一空白对照，于490nm处测定吸收度。以吸光度(Y)为纵坐标，以浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。
供试品溶液的制备：取金水宝胶囊内容物约2g，精密称定，精密加入蒸馏水100ml，置水浴上加热回流0.5-4小时，趁热过滤，精密量取续滤液5.0ml，置于50ml离心管中，加入无水乙醇30ml，混匀5min后，以3000r/min离心20min，弃去上清液，加入80％乙醇溶液5ml，充分洗涤沉淀后，以3000r/min离心5min，弃去上清液，反复操作3次。残渣用水溶解并定容至25ml精密吸取1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法自“再分别加入8％苯酚1.0ml摇匀”起依法测定吸收度，从标准曲线中读出供试品溶液中虫草多糖的重量。计算，即得。
本发明的虫草多糖的含量测定方法，也是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1.提取条件的选择：根据虫草多糖易溶于水的性质，实验选用加热回流0.5、1、2、3、4小时，结果表明加热回流2小时的效果比较好。在实验中分别以为加热回流、超声处理30分钟，结果表明加热回流处理样品测定效果最佳.因此本法采用以加热回流为提取条件.
表1加热回流时间的选择(批号：090601)
表2提取条件的选择(批号：090601)
2.方法学考察
2.1线性关系
对照品储备液的制备：精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品15.20mg置250ml的量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，作为储备液(52.8ug/ml)。
对照品溶液的制备：分别精密吸取上述储备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0分别置10ml具塞刻度试管中，照虫草多糖含量项下的标准曲线制备方法依法操作，测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
表3线性关系考察表
由回归方程可见，虫草多糖量中12.16-60.80ug范围内，吸收度与浓度之间良好的线性关系。
2.2阴性对照试验：按标准处方工艺制备(去除发酵虫草菌粉)阴性对照样品。将制备的样品按[含量测定]项下虫草多糖的方法操作，结果表时：样品中其他组分对该法虫草多糖含量测定无干扰。
2.3稳定性试验：取样品，按[含量测定]项下虫草多糖的方法制备供试品溶液，分别于第0、2、6、12、24小时依法进行测定，结果见表4。
表4稳定性试验考察表(虫草多糖)
结果表明，供试品溶液在24小时内稳定性较好。
2.4精密度试验：精密吸取无水葡萄糖溶液(0.0608mg/ml)照2.1项下方法操作，重复测定6次，进行精密度考察，结果见表5
表5精密度试验结果
结果表时，本法精密度良好。
2.5重复性试验：分别取同一样品(批号：090601)约2g，精密称五份，按[含量测定]项下虫草多糖测定，结果见表6。
表6重复性试验结果
结果表明，本法重复性良好。
3.6加样回收试验：精密称取已知含量的样品(批号：090601 15.32mg/g)五份，分别加入一定量无水葡萄糖标准品，按[含量测定]项下虫草多糖的方法测定，结果见表7；
表7加样回收试验结果
平均回收率：99.4％，RSD：0.48％，加样回收率试验结果表明本法准确性较高。
3.7十批样品的含量测定：按[含量测定]项下虫草多糖的方法对十批样品进行了含量测，结果见表8：
表8十批样品的含量测定结果
结果表明，测得十批金水宝胶囊的虫草多糖含量均在15.0mg/g以上，考虑工业放大中的损耗误差，因此在最低含量的基础上，下浮20％，因此得到检测标准为金水宝胶囊每g计含量虫草多糖不少于12.0mg。
以上的虫草多糖的含量测定可以和前述的虫草酸的含量测定方法一同使用作为金水宝胶囊的测定方法，也可单独使用，优选联合使用，以便更加准确和精密。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1金水宝胶囊中冬虫夏草菌粉的鉴别
(1)取本品内容物0.5g，加甲醇10ml，超声处理1h，滤过，滤液作为供试品溶液。另取发酵冬虫夏草菌粉对照药材0.5g，同法制成对照药材溶液。再取麦角甾醇对照品，加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述三种溶液各10ul，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60-90℃)-乙酸乙酯-甲酸(5∶1∶0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别在日光和紫外光灯(365nm)下检视.供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，日光下显相同颜色的斑点；紫外光下显相同颜色的荧光斑点。
实施例2
金水宝胶囊中虫草酸(甘露醇)的含量测定
色谱条件：采用Lichromsob NH2色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)，乙腈∶水(70-90∶10-25)为流动相，流速为1ml/min，柱温为40℃。
供试品溶液的配制：取装量差异项下的内容物研细，取约0.3g，精密称定，置100ml量瓶中，加水约50ml超声处理10-25分钟，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，即得。
对照品溶液配制：精密称取甘露醇对照品适量，加水制成每1ml含80ug的溶液，即得。测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每粒(以0.32g/粒计)含量甘露醇(C6H16O6)不少于23.1mg
实施例3
金水宝胶囊中虫草多糖的含量测定
标准品溶液的配制：
精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品12.5mg，置250ml容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀备用。
标准曲线的制备
精密吸取标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0分别置10ml具塞刻度试管中，各用重蒸馏水补足至每管1.0ml，再分别加入8％苯酚1.0ml摇匀，加浓硫酸5.0ml，充分摇匀后放置5min，置沸水浴中加热15min，取出立即用冷水冷却至室温。另取蒸馏水1.0ml，加苯酚，浓硫酸同法操作为一空白对照，于490nm处测定吸收度。以吸光度(Y)为纵坐标，以浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线。
供试品溶液的制备：取本品内容物约2g，精密称定，精密加入蒸馏水100ml，置水浴上加热回流0.5-4小时，趁热过滤，精密量取续滤液5.0ml，置于50ml离心管中，加入无水乙醇30ml，混匀5min后，以3000r/min离心20min，弃去上清液，加入80％乙醇溶液5ml，充分洗涤沉淀后，以3000r/min离心5min，弃去上清液，反复操作3次。残渣用水溶解并定容至25ml精密吸取1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法自“再分别加入8％苯酚1.0ml摇匀”起依法测定吸收度，从标准曲线中读出供试品溶液中虫草多糖的重量。计算，即得。
Claims (1)
1.一种金水宝胶囊的检测方法，其特征在于，包括对冬虫夏草菌粉的鉴别方法和对金水宝胶囊中甘露醇、虫草多糖的含量测定的方法：
其中，对冬虫夏草菌粉的鉴别：
取金水宝胶囊内容物0.5 g，加甲醇10 ml，超声处理1 h，滤过，滤液作为供试品溶液，另取发酵冬虫夏草菌粉对照药材0.5g,同法制成对照药材溶液，再取麦角甾醇对照品,加甲醇制成每1ml含0.4mg的溶液，作为对照品溶液，照薄层色谱法试验,吸取上述三种溶液各10ul,分别点于同一硅胶G薄层板上,以5:1:0.1=石油醚-乙酸乙酯-甲酸为展开剂,展开,取出,晾干,喷以10%硫酸乙醇溶液,在105℃加热至斑点显色清晰,分别在日光和365nm紫外光灯下检视，供试品色谱中,在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上,日光下显相同颜色的斑点;紫外光下显相同颜色的荧光斑点，其中石油醚的温度为60-90℃；
其中，对金水宝胶囊中甘露醇的含量测定：
色谱条件：采用LichromsobNH2色谱柱，型号为：4.6mm×250mm，5μm，乙腈：水=75-90∶10-25为流动相，流速为1ml/min，柱温为40℃，
供试品溶液的配制：取装量差异项下的内容物研细，取0.3g，精密称定，置100ml量瓶中，加水50ml超声处理10-25分钟，放冷，加水稀释至刻度，摇匀，过滤，即得，
对照品溶液配制：精密称取甘露醇对照品适量，加水制成每1ml含80ug的溶液，即得，
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得，本品每粒以0.32g/粒计，含量甘露醇不少于23.1mg；
其中，对金水宝胶囊中虫草多糖的含量测定：
标准品溶液的配制：精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品12.5mg ,置250ml 容量瓶中,加蒸馏水稀释至刻度,摇匀备用，
标准曲线的制备：精密吸取标准品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0分别置10ml具塞刻度试管中,各用重蒸馏水补足至每管1.0ml ,再分别加入8%苯酚1.0ml 摇匀, 加浓硫酸5.0ml , 充分摇匀后放置5min ,置沸水浴中加热15min ,取出立即用冷水冷却至室温，另取蒸馏水1.0ml ,加苯酚,浓硫酸同法操作为一空白对照,于490nm 处测定吸光度，以吸光度为纵坐标,以浓度为横坐标,绘制标准曲线；
供试品溶液的制备: 取本品内容物2g，精密称定，精密加入蒸馏水100ml，置水浴上加热回流0.5-4小时，趁热过滤，精密量取续滤液5.0ml，置于50ml离心管中，加入无水乙醇30ml，混匀5min后，以3000r/min离心20min，弃去上清液，加入80％乙醇溶液5ml，充分洗涤沉淀后，以3000r/min离心5min，弃去上清液，反复操作3次，残渣用水溶解并定容至25ml 精密吸取1.0ml，照标准曲线的制备项下的方法自“再分别加入8 %苯酚1.0ml 摇匀”起依法测定吸光度,从标准曲线中读出供试品溶液中虫草多糖的重量，计算，即得。
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Legal Events
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Address after: 330096 No. seven, No. 888, hi tech Zone, Nanchang hi tech Zone, Jiangxi Co-patentee after: Jiangxi Jinshuibao Pharmaceutical Co.,Ltd. Patentee after: JIANGXI JEMINCARE GROUP Co.,Ltd. Address before: 330096 No. seven, No. 888, hi tech Development Zone, Jiangxi, Nanchang Co-patentee before: JIANGXI JIMINKEXIN JINSHUIBAO PHARMACEUTICAL Co.,Ltd. Patentee before: JIANGXI JEMINCARE GROUP Co.,Ltd. |
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Denomination of invention: A detection method of Jinshuibao capsule Effective date of registration: 20211223 Granted publication date: 20140820 Pledgee: Bank of China Limited Nanchang Qingyunpu sub branch Pledgor: JIANGXI JEMINCARE GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2021980016166 |
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Denomination of invention: A kind of detection method of traditional Chinese medicine preparation Jinshuibao capsule Effective date of registration: 20220905 Granted publication date: 20140820 Pledgee: Bank of China Limited Nanchang Qingyunpu sub branch Pledgor: JIANGXI JEMINCARE GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2022980014583 |
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Date of cancellation: 20230830 Granted publication date: 20140820 Pledgee: Bank of China Limited Nanchang Qingyunpu sub branch Pledgor: JIANGXI JEMINCARE GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2022980014583 |
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Denomination of invention: A detection method for traditional Chinese medicine preparation Jinshuibao capsules Effective date of registration: 20230831 Granted publication date: 20140820 Pledgee: Bank of China Limited Nanchang Qingyunpu sub branch Pledgor: JIANGXI JEMINCARE GROUP Co.,Ltd. Registration number: Y2023980054957 |
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