CN102552465B - 一种山楂叶药材、山楂叶提取物或其制成品的质量检测方法 - Google Patents
一种山楂叶药材、山楂叶提取物或其制成品的质量检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种山楂叶药材、山楂叶提取物或其制成品的质量检测方法。其流动相组成为：四氢呋喃-乙酸-水-甲醇-乙腈，其中具体组成为：四氢呋喃10～30体积份，乙酸0.5～4体积份，水60～89.5体积份，甲醇0～3体积份，乙腈0～3体积份；按上述比例配好流动相后，用三乙胺调整pH值3.5～4.4。采用上述流动相测定山楂叶药材、山楂叶提取物及其制成品中金丝桃苷含量、牡荆素鼠李糖苷含量或山楂叶提取物的特征图谱，金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素与相邻峰分离情况得到显著改善，并有利于延长色谱柱的使用寿命，对控制山楂叶、山楂叶提取物及其制剂的质量有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种质量检测方法，特别涉及山楂叶药材、山楂叶提取物及其制成品的质量检测方法。
背景技术
山楂叶收载于《中国药典》2010年版一部第30页，具有活血化瘀，理气通脉，化浊降脂的功效。用于气滞血瘀，脑痹心痛，胸闷憋气，心悸健忘，眩晕耳鸣，高血脂证。
山楂叶提取物收载于《中国药典》2010年版一部第372页，具有活血化瘀，宣通心脉，理气舒络。用于气结血瘀，胸闷憋气，心悸健忘，眩晕耳鸣；冠心病，心绞痛，高脂血症，脑动脉供血不足属上述证候者。
山楂叶及山楂叶提取物临床上广泛应用于高血脂、脑动脉供血不足的治疗，具有疗效确切，临床应用安全等特点。临床现有制剂有益心酮片等。
山楂叶总黄酮为山楂叶药材、山楂叶提取物中降血脂的有效成分，研究表明，金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素是山楂叶总黄酮的主要成分，《中国药典》2010年版一部中，山楂叶药材、山楂叶提取物分别收载了金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷的含量测定，在《中国药典》2010年版一部山楂叶提取物中对山楂叶提取物的特征图谱中对金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素等指标进行了控制。山楂叶药材标准中采用乙腈-甲醇-四氢呋喃-0.5％醋酸溶液(1∶1∶19.4∶78.6)为流动相测定山楂叶中金丝桃苷含量，山楂叶提取物标准采用乙腈-甲醇-四氢呋喃-乙酸-水(3∶3∶38∶2∶152)测定山楂叶提取物特征图谱和牡荆素鼠李糖苷含量。
《中国药典》2010年版一部中公示的山楂叶提取物特征图谱表明，采用上述流动相测定山楂叶药材、山楂叶提取物及其制成品中金丝桃苷含量、牡荆素鼠李糖苷含量或山楂叶提取物的特征图谱，金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素与相邻峰均不能完全分离，影响含量测定的准确性。且上述流动相的pH值在2.6～2.8，酸性较强，已接近硅胶为基质的键合相填料的色谱柱能耐用的pH值下限，长期使用影响高效液相色谱柱的使用寿命。
发明内容
本发明目的在于公开山楂叶药材、山楂叶提取物或其制成品的质量检测方法。
本发明目的是通过如下技术方案实现的：
本发明山楂叶药材、山楂叶提取物及其制成品的质量检测方法，该方法包括如下步骤：
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VD)测定；
A.对照品溶液的制备：
金丝桃苷对照品溶液：取金丝桃苷对照品，精密称定，加45％～55％的乙醇溶解并稀
释，制成每1ml中含金丝桃苷10μg～30μg的溶液，作为对照品溶液；
牡荆素鼠李糖苷对照品溶液：取牡荆素鼠李糖苷对照品，精密称定，加55～65％乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含牡荆素鼠李糖苷50μg～100μg的溶液，作为对照品溶液；
B.供试品溶液的制备：
山楂叶提取物及其固体制成品供试品溶液的制备：分别取山楂叶提取物25mg以及相当于山楂叶提取物25mg的固体制成品，精密称定，置25体积份量瓶中，加45％～55％的乙醇10--20体积份，超声处理10-20分钟，放冷，用45％～55％的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
山楂叶提取物及其液体制成品供试品溶液的制备：分别取山楂叶提取物25mg以及相当于山楂叶提取物25mg的液体制成品，精密量取，置25体积份量瓶中，加45％～55％的乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
山楂叶药材及其制成品供试品溶液的制备：分别取山楂叶药材1g以及相当于山楂叶药材1g的制成品，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流提取至提取液无色，弃去三氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色，提取液蒸干，残渣加45％～55％的乙醇溶解，转移至50体积份量瓶中，加45％～55％的乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品储备液；取供试品储备液，滤过，精密量取续滤液5体积份，置25体积份量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
c.测定条件：色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；以四氢呋喃-乙酸-水-甲醇-乙腈＝10～30∶0.5～4∶60～89.5∶0～3∶0～3为流动相；用三乙胺调整pH值3.5～4.4；检测波长为320nm～380nm；
d.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.00002体积份，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明质量检测方法优选为：
A.对照品溶液的制备：
金丝桃苷对照品溶液：取金丝桃苷对照品，精密称定，置50体积份量瓶中，加50％的乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含金丝桃苷20μg的溶液，作为对照品溶液；
牡荆素鼠李糖苷对照品溶液：取牡荆素鼠李糖苷对照品，精密称定，加60％乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含牡荆素鼠李糖苷或重量份60、70或80μg的溶液，作为对照品溶液；
B.供试品溶液的制备：
山楂叶提取物及其制成品供试品溶液的制备：分别取山楂叶提取物25mg以及相当于山楂叶提取物25mg的制成品，精密称定，置25体积份量瓶中，加50％的乙醇20体积份，在功率300W，频率为50kHz下超声处理15分钟，放冷，用50％的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
山楂叶提取物及其制成品(液体)供试品溶液的制备：分别取山楂叶提取物25mg以及相当于山楂叶提取物25mg的制成品，精密量取，置25体积份量瓶中，加50％的乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
山楂叶药材及其制成品供试品溶液的制备：分别取山楂叶药材1g以及相当于山楂叶药材1g的制成品，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流提取至提取液无色，弃去三氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色，提取液蒸干，残渣加50％的乙醇溶解，转移至50体积份量瓶中，加50％的乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品储备液；取供试品储备液，滤过，精密量取续滤液5体积份，置25体积份量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
C.测定条件：色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为：四氢呋喃-乙酸-水-甲醇-乙腈＝15～25∶1～3∶68～83∶0.5～2∶0.5～2；按上述比例配好流动相后，用三乙胺调整pH值至3.8～4.2；检测波长为330nm～363nm；
C.测定条件更优选：色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为：四氢呋喃-乙酸-水-甲醇-乙腈＝19∶2∶78.5∶1.5∶1.5体积份；按上述比例配好流动相后，用三乙胺调整pH值至4.0；检测波长为363nm；
C.测定条件更优选：色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为：四氢呋喃-乙酸-水-甲醇-乙腈＝22∶1.5∶75∶1.8∶1.8体积份；按上述比例配好流动相后，用三乙胺调整pH值至4.1；检测波长为330nm；
C.测定条件更优选：色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为：四氢呋喃-乙酸-水-甲醇-乙腈＝17∶2.5∶80∶0.8∶0.8体积份；按上述比例配好流动相后，用三乙胺调整pH值至3.9；检测波长为355nm；
d.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各0.00002体积份，注入液相色谱仪，测定，即得。
上述流动相中乙酸可以部分或完全用磷酸、乳酸、甲酸、乙二酸、丁二酸中一种或数种代替；流动相中三乙胺可以部分或完全用二乙胺、吡啶、二异丙基乙胺中一种或数种代替。
其中所述山楂叶提取物收载于《中国药典》2010年版一部益心酮片项下，其制备方法：取蔷薇科植物山里红或山楂的叶1重量份，粉碎成粗粉，用6体积份乙醇为溶剂，浸渍48小时，进行渗漉，收集漉液，减压回收乙醇至相对密度约1.04(60℃)的浓缩液，加等量水稀释后，用1/6体积份的石油醚(60～90℃)除去色素，分出水层，用0.7体积份的乙酸乙酯振摇提取，提取液减压回收乙酸乙酯并浓缩至干，即得。
本发明所述山楂叶提取物制成品包括绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物和益心酮片。
绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(一)制备方法：取绞股蓝总苷5重量份、山楂叶总黄酮80重量份，加淀粉120重量份，混合均匀，用淀粉浆制粒，压制成1000片，即得。
绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(二)制备方法：取绞股蓝总苷40重量份、山楂叶总黄酮40重量份，加淀粉100重量份，混合均匀，用淀粉浆制粒，干燥，装入胶囊，制成1000粒，即得。
绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(三)制备方法：取绞股蓝总苷20重量份、山楂叶总黄酮40重量份，加淀粉120重量份，混合均匀，用淀粉浆制粒，干燥，装入胶囊，制成1000粒，即得。
绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(四)制备方法：取绞股蓝总苷12重量份、山楂叶总黄酮2重量份，加入纯化水200ml使溶解，另取苯甲酸钠2重量份、对羟基苯甲酸乙酯0.5重量份、甜味素5重量份，用100ml纯化水使溶解，混合上述两种溶液，加纯化水至1000ml，过滤、灌装、灭菌，即得绞股蓝总苷山楂叶总黄酮口服溶液。
其中所述绞股蓝总苷收载于国家食品药品监督管理局新药转正标准第四册第31页。其中所述益心酮片具有活血化瘀、宣通血脉的作用，收载于《中国药典》2010年版一部第1023页。
上述重量份和体积份的关系是：g/ml。
本发明的主要优点在于：金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素与相邻峰均达到了有效分离，方法回收率和准确性高。流动相pH值适中，有利于延长色谱柱的使用寿命。
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1 山楂叶药材中金丝桃苷的含量测定
1、仪器和试药
SHI MADZU LC-10AT Liquid Chromatograph
SPD-10A VP UV-VIS Detector
山楂叶药材：20080901，购于安徽亳州蜀中医药有限公司
金丝桃苷对照品：购自中国药品生物制品检验所，批号：111521-200303。
2、试验方法与结果
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VD)测定。
a.对照品溶液的制备：
金丝桃苷对照品溶液：取金丝桃苷对照品10.22mg，精密称定，加50％的乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含20.44μg的溶液；
牡荆素鼠李糖苷对照品溶液：取牡荆素鼠李糖苷对照品约9.75mg，精密称定，加60％乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含48.75μg的溶液；
b.供试品溶液的制备取山楂叶药材细粉1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流提取至提取液无色，弃去三氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色，提取液蒸干，残渣加50％的乙醇溶解，转移至50ml量瓶中，加50％的乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品储备液；取供试品储备液，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
c.测定条件：
①色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；
规格：250mm×4.6mm，5μm
②流动相：甲醇-乙腈-四氢呋喃-0.5％醋酸溶液＝1∶1∶19.4∶78.6；
③检测波长：363nm；
d.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：山楂叶药材色谱图中，金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素与前后峰有粘连，不能达到有效分离。详见附图说明(附图一)。
实验例2 山楂叶提取物中有效成分的含量测定
1、仪器和试药
SHI MADZU LC-10AT Liquid Chromatograph
SPD-10A VP UV-VIS Detector
山楂叶提取物：20081210，购于山西晋城中晋药业有限公司
金丝桃苷对照品：购自中国药品生物制品检验所，批号：111521-200303。
牡荆素鼠李糖苷对照品：购自成都普思生物科技有限公司，批号：20091101。
2、试验方法与结果
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VD)测定。
a.对照品溶液的制备：
金丝桃苷对照品溶液：取金丝桃苷对照品10.22mg，精密称定，加50％的乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含30.66μg的溶液；
牡荆素鼠李糖苷对照品溶液：取牡荆素鼠李糖苷对照品9.75mg，精密称定，加60％乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含97.5μg的溶液；
b.供试品溶液的制备取山楂叶提取物25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加50％的乙醇20ml，在功率为300W，频率50kHz下超声处理15分钟，放冷，用50％的乙醇稀释至刻度，放冷，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
c.测定条件
①色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；
规格：250mm×4.6mm，5μm
②流动相：甲醇-乙腈-四氢呋喃-乙酸-水＝3∶3∶38∶4∶152；
③检测波长：330nm；
d.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：山楂叶提取物色谱图中，金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素与前后峰有粘连，不能达到有效分离。详见附图说明(附图二)。
实验例3 流动相pH值的筛选
a.对照品溶液的制备：
金丝桃苷对照品溶液：取金丝桃苷对照品10.22mg，精密称定，加50％的乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含10.22μg的溶液。
牡荆素鼠李糖苷对照品溶液：取牡荆素鼠李糖苷对照品10.12mg，精密称定，加60％乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含80.96μg的溶液。
b.供试品溶液的制备：取山楂叶提取物25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加50％的乙醇20ml，在功率300W，频率50kHz下超声处理15分钟，放冷，用50％的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
c.测定条件：
①色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；
②流动相：四氢呋喃-乙酸-水-甲醇-乙腈＝19∶2∶78.5∶1.5∶1.5；按上述比例配好流动相后，分别用三乙胺调整pH值3.1，3.3，3.5，3.8，4.0，4.2，4.6，4.8，5.0；
③检测波长：363nm；
d.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果见下表：
表1流动相pH值筛选结果
结果表明，当pH在3.5～4.4范围内时，金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素与相邻峰能达到基本分离；当pH在3.8～4.2时，金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素与相邻峰的分离均较好。当pH在4.0时，金丝桃苷与相邻峰的分离最好，且峰型良好。
实验例4 不同流动相对色谱柱的使用寿命的影响
1、仪器和试药
SHI MADZU LC-10AT Liquid Chromatograph
SPD-10A VP UV-VIS Detector
山楂叶提取物：20081210，购于山西晋城中晋药业有限公司
金丝桃苷对照品：购自中国药品生物制品检验所，批号：111521-200303。
牡荆素鼠李糖苷对照品：购自成都普思生物科技有限公司，批号：20091101。
2、试验方法与结果
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VD)测定。
a.对照品溶液的制备：
金丝桃苷对照品溶液：取金丝桃苷对照品10.22mg，精密称定，加50％的乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含30.66μg的溶液；
牡荆素鼠李糖苷对照品溶液：取牡荆素鼠李糖苷对照品9.75，精密称定，加60％乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含97.5μg的溶液；
b.供试品溶液的制备
1)山楂叶提取物及其制成品供试品溶液的制备：分别取山楂叶提取物25mg以及相当于山楂叶提取物25mg的制成品，精密称定，置25ml量瓶中，加50％的乙醇20ml，在功率为300W，频率50kHz下超声处理15分钟，放冷，用50％的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
2)山楂叶药材及其制成品供试品溶液的制备：分别取山楂叶药材以及相当于山楂叶药材1g的制成品，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流提取至提取液无色，弃去三氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色，提取液蒸干，残渣加50％的乙醇溶解，转移至50ml量瓶中，加50％的乙醇稀释至刻度，摇匀，作为供试品储备液；取供试品储备液，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
c.测定条件(方法1：测定山楂叶提取物)
①色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；
规格：250mm×4.6mm，5μm(编号76#)
②流动相：甲醇-乙腈-四氢呋喃-乙酸-水＝3∶3∶38∶4∶152；
③检测波长：330nm；
d.测定条件(方法2：测定山楂叶提取物)
①色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；
规格：250mm×4.6mm，5μm(编号：111#)
②流动相：甲醇-乙腈-四氢呋喃-乙酸-水＝1.5∶1.5∶19∶2∶78.5，三乙胺调节pH值4.01；
③检测波长：330nm；
e.测定条件(方法3：测定山楂叶药材)
①色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；
规格：250mm×4.6mm，5μm(编号：99#)
②流动相：甲醇-乙腈-四氢呋喃-0.5％醋酸溶液＝1∶1∶19.4∶78.6；
③检测波长：363nm；
f.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
上述3根色谱柱初始柱效相当，分别采用上述3种方法用于山楂叶提取物、山楂叶药材的质量检测方法研究，研究内容均包括方法学验证及稳定性考察，每次进行测定时检测色谱柱柱效及金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素与相邻峰的分离情况。在试验过程中，上述3根色谱柱均未用于其它样品的测定。结果如下：
表2各流动相对色谱柱柱效及各色谱峰分离度的影响
说明：(1)指金丝桃苷、(2)指牡荆素鼠李糖苷、(3)指牡荆素葡萄糖苷、(4)指牡荆素。
试验阶段1：指开始测试样品；试验阶段2：方法学研究结束
试验阶段3：样品测定；试验阶段4：稳定性1月测定
试验阶段5：稳定性2月测定；试验阶段6：稳定性3月测定
每次测试完均用甲醇-水(10∶90)为流动相以1.0ml/min的流速冲洗2小时后用甲醇保存色谱柱。
上述实验结果表明，在3个月的使用过程中，方法1、方法3中色谱柱的柱效下降很明显，金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素与相邻峰的分离情况下降也更明显，无论从保证样品中测试成分与相邻峰的分离情况方面，还是从延长色谱柱寿命、降低分析成本方面，方法2均有明显的优势。
实验例5 绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(三)中金丝桃苷测定的方法学研究
1、仪器和试药
Agilent 1200型高效液相色谱仪
金丝桃苷对照品：购自中国药品生物制品检验所，批号：111521-200303。
2、试验方法与结果
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VD)测定。
a.对照品溶液的制备：
金丝桃苷对照品溶液：取金丝桃苷对照品约10.23mg，精密称定，加50％的乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含30.69μg的溶液。
b.供试品溶液的制备
1)供试品溶液的制备：取绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(三)0.13g，精密称定，置25ml量瓶中，加50％的乙醇20ml，在功率为300W，频率50kHz下超声处理15分钟，放冷，用50％的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
c.测定条件
①色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；
规格：250mm×4.6mm，5μm
②流动相：甲醇-乙腈-四氢呋喃-乙酸-水＝1.5∶1.5∶19∶2∶78.5，三乙胺调节pH值4.01；
③检测波长：363nm；
d.方法学研究。
(1)定量限
以浓度为1.396μg/ml的对照品溶液进样2μl时，信号为噪音水平德比值约为10∶1，即金丝桃苷的定量限为2.792ng。
(2)线性范围
取浓度为14.24μg/ml、1.396μg/ml的对照品溶液，按下表精密吸取各对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积对进样量进行线性回归。结果见表3。
表3 金丝桃苷线性和范围的测定结果
线性回归方程：A＝2.1869M+9.2295；R2＝0.9991
以上结果表明，进样量在13.96～427.2ng范围内，峰面积与进样量有良好线性关系。(见附图3)
(3)精密度试验
在选定的色谱条件下分别吸取13.96μg/ml的对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，测定峰面积值，计算平均峰面积和RSD。试验结果见表4：
表4 金丝桃苷精密度的测定结果
以上结果表明，仪器精密度较好。
(4)稳定性试验
在选定的色谱条件下于0、1、2、4、21、24小时吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积值，计算平均峰面积和RSD。试验结果见表5。
表5 稳定性的测定结果
以上结果表明，供试品溶液24小时内测定稳定，稳定性较好。
(5)重复性试验
取样品(20090219)6份，按前述供试品溶液制备方法进行制备。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定峰面积值，将峰面积及进样量用外标法计算，计算供试品中金丝桃苷的含量。结果见表6。
表6 重复性试验结果
20090219批样品的平均装量为0.205。
由上表可见本方法具有良好的重复性。
(6)加样回收试验
对照品贮备液精密称取金丝桃苷对照品8.90mg，置25ml量瓶中加50％的乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每1ml中含对照品0.356mg，即得对照品贮备液；
供试品溶液的制备：取已知金丝桃苷含量的样品(批号：20090219，金丝桃苷含量：2.34mg/g)9份，按下表取样，精密称定，置50ml量瓶中，分别精密加入对照品溶液0.4ml、0.5ml、0.6ml，再分别加入50％的乙醇至20ml，每种体积平行3份，在为功率300W，频率50kHz超声处理15分钟，放冷，加50％的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定法：在选定的色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定峰面积值，按外标法计算供试品中金丝桃苷的量，按以下公式计算加样回收率。结果见表7：
表7 加样回收率的测定结果
由上表可见，本测定方法的加样回收率在98.70％～102.76％之间，平均回收率为101.15％，回收率良好。
方法学研究结果表明，建立的高效液相色谱条件可用于绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(三)中金丝桃苷的含量测定。
实验例6 山楂叶提取物中牡荆素鼠李糖苷测定的方法学研究
1、仪器和试药
Agilent 1200型高效液相色谱仪
山楂叶提取物：20081210，购于山西晋城中晋药业有限公司
牡荆素鼠李糖苷对照品：购自成都普思生物科技有限公司，批号：20091101。
2、试验方法与结果
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录VD)测定。
a.对照品溶液的制备：
牡荆素鼠李糖苷对照品溶液：取牡荆素鼠李糖苷对照品10.43mg，精密称定，加60％乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含104.3μg的溶液；
b.供试品溶液的制备
1)山楂叶提取物供试品溶液的制备：取山楂叶提取物25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加55％的乙醇20ml，在功率为300W，频率50kHz超声处理15分钟，放冷，用55％的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
c.测定条件
①色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；
规格：250mm×4.6mm，5μm
②流动相：甲醇-乙腈-四氢呋喃-乙酸-水＝1.5∶1.5∶19∶2∶78.5，三乙胺调节pH值3.99；
③检测波长：330nm；
d.方法学验证
(1)定量限
以浓度为2.181μg/ml的牡荆素鼠李糖苷对照品溶液进样2μl时，信号为噪音水平德比值约为10∶1，即牡荆素鼠李糖苷的定量限为4.362ng；
(2)线性范围
分别取浓度为104.3μg/ml、20.86μg/ml的对照品溶液，按下表精密吸取各对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积对进样量进行线性回归。结果见表8。
表8 牡荆素鼠李糖苷线性和范围的测定结果
线性回归方程：y＝2.02012x-0.44736；R2＝0.99998
以上结果表明，进样量在208.6～3128.0ng范围内，峰面积与进样量有良好线性关系(标准曲线见附图四)。
(3)精密度试验
在选定的色谱条件下分别吸取浓度为104.32μg/ml对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，连续进样6次，记录色谱图，测定峰面积值，计算平均峰面积和RSD。试验结果见表9。
表9 牡荆素鼠李糖苷精密度的测定结果
以上结果表明，仪器精密度较好。
(4)稳定性试验
在选定的色谱条件下于0、1、2、4、21、24小时吸取供试品溶液20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，测定峰面积值，计算平均峰面积和RSD。试验结果见表10：
表10 稳定性的测定结果
以上结果表明，供试品溶液24小时内测定稳定，稳定性较好。
(5)重复性试验
取山楂叶提取物(20081210)6份，按前述供试品溶液制备方法进行制备。分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定峰面积值，将峰面积及进样量用外标法计算，计算供试品中牡荆素鼠李糖苷的含量。结果见表11。
表11 重复性试验结果
(6)加样回收试验
对照品贮备液精密称取牡荆素鼠李糖苷对照品12.90mg，置10ml量瓶中加60％的乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品贮备液(每1ml中含对照品1.29mg)。
供试品溶液的制备：取已知牡荆素鼠李糖苷含量的样品(牡荆素鼠李糖苷含量：10.10％)9份，按下表取样，精密称定，置25ml量瓶中，分别精密加入对照品溶液0.8ml、1ml、1.2ml，再分别加入60％的乙醇至20ml，每种体积平行3份，在功率300W，频率50kHz下超声处理15分钟，放冷，加60％的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
测定法：在选定的色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定峰面积值，按外标法计算供试品中金丝桃苷的量，按以下公式计算加样回收率。结果见表12
表12 加样回收率的测定结果
由上表可见，本测定方法的加样回收率在96.430％～102.91％之间，平均回收率为100.39％，回收率良好。
方法学研究结果表明，建立的高效液相色谱条件可用于山楂叶提取物中牡荆素鼠李糖苷的含量测定。
附图说明：
图1：山楂叶提取物有效成分测定色谱图
图2：山楂叶提取物有效成分测定色谱图
图3：金丝桃苷线性回归图
图4：牡荆素鼠李糖苷线性回归图
图5：山楂叶药材金丝桃苷测定色谱图
图6：山楂叶提取物有效成分测定色谱图
图7：绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(三)金丝桃苷含量色谱图
图8：益心酮片中金丝桃苷含量色谱图
图9：绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(一)金丝桃苷含量色谱图
图10：绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(二)金丝桃苷含量色谱图
图11：绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(四)金丝桃苷含量色谱图
下述实施例均能实现上述实验例所述效果。
具体实施方式
实施例1：山楂叶药材中金丝桃苷的测定
a.对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品约10.55mg，精密称定，加45％的乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含21.10μg的溶液；
b.供试品溶液的制备：取山楂叶药材细粉1g，精密称定为1.002g，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流提取至提取液无色，弃去三氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色，提取液蒸干，残渣加45％的乙醇溶解，转移至50ml量瓶中，加45％的乙醇至刻度，摇匀，作为供试品储备液；取供试品储备液，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
c.测定条件：
①色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；
②流动相：四氢呋喃-乙酸-水-甲醇-乙腈，其中具体组成为：15∶1.5∶81∶2.0∶0.5；按上述比例配好流动相后，分别用二乙胺调整pH值4.2。
③检测波长：363nm；
d.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
结果表明，山楂叶药材中金丝桃苷的含量为0.102％，采用该色谱方法测定山楂叶药材中金丝桃苷含量，金丝桃苷与相邻峰的最小分离度为2.28，详见附图(附图五)。
实施例2：山楂叶提取物中有效成分的测定
山楂叶提取物收载于《中国药典》2010年版一部益心酮片项下，其制备方法：取蔷薇科植物山里红或山楂的叶1重量份，粉碎成粗粉，用6体积份乙醇为溶剂，浸渍48小时，进行渗漉，收集漉液，减压回收乙醇至相对密度约1.04(60℃)的浓缩液，加等量水稀释后，用1/6体积份的石油醚(60～90℃)除去色素，分出水层，用0.7体积份的乙酸乙酯振摇提取，提取液减压回收乙酸乙酯并浓缩至干，即得。
a.对照品溶液的制备：
金丝桃苷对照品溶液：取金丝桃苷对照品约10.33mg，精密称定，加50％的乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含10.33μg的溶液；
牡荆素鼠李糖苷对照品溶液：取牡荆素鼠李糖苷对照品10.59mg，精密称定，加60％乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含31.77μg的溶液；
b.供试品溶液的制备：取山楂叶提取物25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加50％的乙醇20ml，在功率为300W，频率50kHz下超声处理15分钟，放冷，用50％的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
c.测定条件：
①色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；
②流动相：四氢呋喃-乳酸-水-甲醇-乙腈，其中具体组成为：25∶3∶69.5∶0.5∶2.0；按上述比例配好流动相后，分别用三乙胺调整pH值3.8。
③检测波长：330nm。
d.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果表明，山楂叶提取物中金丝桃苷的含量为10.87mg/g，牡荆素鼠李糖苷的含量为25.18mg/g。采用该方法测定山楂叶提取物有效成分，金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素与相邻峰的分离度依次为2.39、2.95、1.57、2.63，详见附图说明(附图六)。
实施例3：绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(三)中金丝桃苷测定
绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(三)制备方法：取绞股蓝总苷20重量份、山楂叶总黄酮40重量份，加淀粉120重量份，混合均匀，用淀粉浆制粒，干燥，装入胶囊，制成1000粒，即得。
其中所述绞股蓝总苷收载于国家食品药品监督管理局新药转正标准第四册第31页。
a.对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品10.19mg，精密称定，加50％的乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含10.19μg的溶液；
b.供试品溶液的制备：精密称取绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(三)内容物0.1311g，置25ml量瓶中，加50％的乙醇20ml，在功率为300W，频率50kHz下超声处理15分钟，放冷，用50％的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
c.测定条件：
①色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；
②流动相：四氢呋喃-乙二酸-水-甲醇-乙腈＝19∶2∶78.5∶1.5∶1.5；按上述比例配好流动相后，分别用三乙胺调整pH值4.0；
③检测波长：363nm。
d.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果表明，绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(三)中金丝桃苷的含量为0.59mg/粒。采用该色谱方法测定绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(三)中金丝桃苷含量，金丝桃苷与相邻峰的最小分离度为2.99，详见附图说明(附图七)。
实施例4：益心酮片中金丝桃苷的测定
益心酮片具有活血化瘀、宣通血脉的作用，收载于《中国药典》2010年版一部第
1023页，采用该发明方法控制益心酮片中金丝桃苷的具体实施方式为：
a.对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品10.15mg，精密称定，加48％的乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含25.38μg的溶液；
b.供试品溶液的制备：取益心酮片10片，研细，精密称取0.3177g，置25ml量瓶中，加48％的乙醇0ml，在功率为300W，频率50kHz下超声处理15分钟，放冷，用48％的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
c.测定条件：
①色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；
②流动相：四氢呋喃-丁二酸-水-甲醇-乙腈＝18∶1.5∶77∶2.0∶1.5；按上述比例配好流动相后，分别用吡啶调整pH值4.0；
③检测波长：363nm。
d.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果表明，益心酮片中金丝桃苷含量为0.55mg/片，采用该色谱方法测定益心酮片中金丝桃苷含量，金丝桃苷与相邻峰的最小分离度为3.08，详见附图说明(附图八)。
实施例5：绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(一)中金丝桃苷测定
绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(一)制备方法：取绞股蓝总苷5重量份、山楂叶总黄酮80重量份，加淀粉120重量份，混合均匀，用淀粉浆制粒，压制成1000片，即得。
其中所述绞股蓝总苷收载于国家食品药品监督管理局新药转正标准第四册第31页。
a.对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品10.29mg，精密称定，加55％的乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含20.58μg的溶液；
b.供试品溶液的制备：取绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(一)10片，研细，精密称取0.1017g，置25ml量瓶中，加55％的乙醇20ml，在功率为300W，频率50kHz下超声处理15分钟，放冷，用55％的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
c.测定条件：
①色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；
②流动相：四氢呋喃-磷酸-水-甲醇-乙腈，其中具体组成为：22∶1.5∶75∶1.8∶1.8；按上述比例配好流动相后，分别用三乙胺调整pH值4.1；
③检测波长：363nm；
d.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
结果表明，绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(三)中金丝桃苷含量为0.97mg/粒，采用该色谱方法测定绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(一)中金丝桃苷含量，金丝桃苷与相邻峰的最小分离度为2.63，详见附图说明(附图九)。
实施例6：绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(二)中金丝桃苷的测定
绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(二)制备方法：取绞股蓝总苷40重量份、山楂叶总黄酮40重量份，加淀粉100重量份，混合均匀，用淀粉浆制粒，干燥，装入胶囊，制成1000粒，即得。
其中所述绞股蓝总苷收载于国家食品药品监督管理局新药转正标准第四册第31页。
a.金丝桃苷对照品溶液：取金丝桃苷对照品9.39mg，精密称定，加50％的乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含金丝桃苷28.17μg的溶液，作为对照品溶液；
b.供试品溶液的制备：：精密称取绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(二)0.1322g，置25ml量瓶中，加50％的乙醇20ml，在功率300W，频率为50kHz下超声处理15分钟，放冷，用50％的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
c.测定条件：色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为：四氢呋喃-乙酸-水-甲醇-乙腈＝17∶2.5∶80∶0.8∶0.8体积份；按上述比例配好流动相后，用二异丙基乙胺调整pH值至3.9；
③检测波长：363nm；
d.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
结果表明，绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(二)中金丝桃苷含量为0.72mg/粒，采用该方法测定绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(二)有效成分，金丝桃苷与相邻峰的最小分离度为2.41，详见附图说明(附图十)。
实施例7：绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(四)中金丝桃苷的测定
绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(四)制备方法：取绞股蓝总苷12重量份、山楂叶总黄酮2重量份，加入纯化水200ml使溶解，另取苯甲酸钠2重量份、对羟基苯甲酸乙酯0.5重量份、甜味素5重量份，用100ml纯化水使溶解，混合上述两种溶液，加纯化水至1000ml，过滤、灌装、灭菌，即得绞股蓝总苷山楂叶总黄酮口服溶液。
其中所述绞股蓝总苷收载于国家食品药品监督管理局新药转正标准第四册第31页。
a.金丝桃苷对照品溶液：取金丝桃苷对照品10.43mg，精密称定，加50％的乙醇溶解并稀释，制成每1ml中含金丝桃苷10.43μg的溶液，作为对照品溶液；
b.供试品溶液的制备：：精密称取绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(四)10ml，置25ml量瓶中，加50％的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
c.测定条件：色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶；流动相为：四氢呋喃-乙酸-水-甲醇-乙腈＝19∶2∶79.5∶1.5∶1.5体积份；按上述比例配好流动相后，用二异丙基乙胺调整pH值至3.6；
③检测波长：363nm；
d.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
结果表明，绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(四)中金丝桃苷含量为0.08mg/ml，采用该方法测定绞股蓝总苷山楂叶总黄酮组合物(四)有效成分，金丝桃苷与相邻峰的最小分离度为2.19，详见附图说明(附图十一)。
Claims (2)
1.一种山楂叶药材的检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
a.对照品溶液的制备：取金丝桃苷对照品约10.55mg，精密称定，加45%的乙醇溶解并稀释,制成每1ml中含21.10μg的溶液；
b.供试品溶液的制备：取山楂叶药材细粉1g，精密称定为1.002g，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流提取至提取液无色，弃去三氯甲烷液，药渣挥去三氯甲烷，加甲醇继续提取至无色，提取液蒸干，残渣加45%的乙醇溶解，转移至50ml量瓶中，加45%的乙醇至刻度，摇匀，作为供试品储备液；取供试品储备液，滤过，精密量取续滤液5ml，置25ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液；
c.测定条件：
①色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；
②流动相：四氢呋喃-乙酸-水-甲醇-乙腈,其中具体组成为：15：1.5：81：2.0：0.5；按上述比例配好流动相后，分别用二乙胺调整pH值4.2；
③检测波长：363nm；
d.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
结果表明，山楂叶药材中金丝桃苷的含量为0.102%，采用该色谱方法测定山楂叶药材中金丝桃苷含量，金丝桃苷与相邻峰的最小分离度为2.28，详见附图五。
2.一种山楂叶提取物的检测方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
山楂叶提取物收载于《中国药典》2010年版一部益心酮片项下，其制备方法：取蔷薇科植物山里红或山楂的叶1重量份，粉碎成粗粉，用6体积份乙醇为溶剂，浸渍48小时，进行渗漉，收集漉液，减压回收乙醇至相对密度约1.04，温度为60℃的浓缩液，加等量水稀释后，用1/6体积份沸点温度为60～90℃的石油醚，除去色素，分出水层，用0.7体积份的乙酸乙酯振摇提取，提取液减压回收乙酸乙酯并浓缩至干，即得；
a.对照品溶液的制备：
金丝桃苷对照品溶液：取金丝桃苷对照品约10.33mg，精密称定，加50%的乙醇溶解并稀释,制成每1ml中含10.33μg的溶液；
牡荆素鼠李糖苷对照品溶液：取牡荆素鼠李糖苷对照品10.59mg，精密称定，加60%乙醇溶解并稀释,制成每1ml中含31.77μg的溶液；
b.供试品溶液的制备：取山楂叶提取物25mg，精密称定，置25ml量瓶中，加50%的乙醇20ml，在功率为300W，频率50kHz下超声处理15分钟，放冷，用50%的乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液；
c.测定条件：
①色谱柱填料：十八烷基硅烷键合硅胶；
②流动相：四氢呋喃-乳酸-水-甲醇-乙腈,其中具体组成为：25：3：69.5：0.5：2.0；按上述比例配好流动相后，分别用三乙胺调整pH值3.8；
③检测波长：330nm；
d.测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
结果表明，山楂叶提取物中金丝桃苷的含量为10.87mg/g，牡荆素鼠李糖苷的含量为25.18mg/g；采用该方法测定山楂叶提取物有效成分，金丝桃苷、牡荆素鼠李糖苷、牡荆素葡萄糖苷、牡荆素与相邻峰的分离度依次为2.39、2.95、1.57、2.63，详见附图六。
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