CN103076405A - 脉血康胶囊的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脉血康胶囊的检测方法，它是由鲜水蛭粉碎后填充胶囊而得；所述检测方法提供了脉血康胶囊中氨基酸和多糖的含量测定方法，弥补了现有技术中单一的抗凝血酶活性测定含量测定方法，所述检测方法准确，灵敏度高，重复性好，能够有效控制脉血康胶囊的质量。
Description
技术领域
本发明涉及一种脉血康胶囊的检测方法，属于药品技术的领域。
背景技术
被成为“富贵病”的“三高症”是心脏血管和脑血管的疾病统称。心脑血管疾病严重威胁人类健康，当今已成为50岁以上中老年人的常见病，具有关调查显示，我国心脑血管疾病患者已超过2.7亿人，尽管现代医学的快速发展，但我国每年死于心脑血管疾病近300万人。现代医学研究表明，引起心脑血管疾病发病原因是血液粘稠、高血压以及不良的生活习惯等等；另外，诸多因素导致的血瘀经闭、跌打损伤所引起的血瘀、疼痛均严重影响现人们的正常生活。脉血康胶囊是一种以水蛭制成的用于血瘀经闭、跌打损伤和心脑血管疾病的胶囊制剂，具有破血、逐瘀、通脉止痛的功效，临床上已经取得良好疗效。脉血康胶囊是维护人类健康的重要药物之一；为此，脉血康胶囊的质量极其重要，尤其是其中有效成分的控制，该环节关系到产品的各个方面乃至患者的健康。目前，脉血康胶囊已有成分控制只限于抗凝血酶活性的测定，存在一定的片面性。为确保临床药效，客观、有效、全面地对脉血康胶囊的质量进行控制，本发明提供了一种脉血康胶囊的检测方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种脉血康胶囊的检测方法。所述检测方法准确，重复性好。
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案实现：
所述脉血康胶囊由鲜水蛭粉碎后填充胶囊而得。
具体地说，由鲜水蛭，在-10℃～-15℃下冷冻，取出捣碎，40℃～50℃、-0.1MPa干燥，粉碎，过筛，装入肠溶胶囊，即得。
所述脉血康胶囊的检测方法包括包括对氨基酸和多糖的含量测定。
其中，氨基酸的含量测定方法为：采用高效液相色谱法测定：
色谱条件：ODS色谱柱4.6mm×250mm，5μm；流动相A相：0.02mol·L-1醋酸钾溶液，加四氢呋喃2.85μl；所述0.02mol·L-1的醋酸钾溶液是由三乙醇胺与1.5％冰醋酸溶液调至pH7.2；B相：pH7.2的0.1mol·L-1醋酸钾溶液∶甲醇∶乙腈＝200∶200∶200；梯度洗脱：0～15min，100％A相，15～16min，40％A相-60％B相，16～30min100％B相；波长：初始338nm，16.5min时262nm；流速：1ml·min-1；柱温：20～25℃；
供试品溶液的制备：取4粒脉血康胶囊去壳，精密称取内容物粉末1.0g，加0.9％生理盐水50ml浸泡24h，匀浆，以3000r·min离心10min，收集上清液；所余沉淀再以30ml乙醇60℃回流2次，每次30min，合并提取液，滤过，挥去乙醇至无醇味，放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液；精密量取脉血康胶囊提取液50μl置于有盖小瓶，加含1％苯酚的6mol·L-1盐酸200μl，冲氮气1min，压盖后置于恒温反应器中，110℃反应20h，取出后加入40％氢氧化钾溶液120μl，涡旋8～10min，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：精密量取氨基酸标准品2ml，无需做任何处理，直接进样；
测定法：分别取待测供试品溶液和对照品溶液各5μl，置于自动进样瓶中，进样测定，即得。
所述多糖的含量测定方法为：采用分光光度法测定：
供试品溶液的制备：取胶囊内容物粉末2.0g，精密称定，置于索式提取器中，加入60～90℃的石油醚120ml回流提取8h，弃取石油醚，残渣挥干石油醚，再置于圆底烧瓶中，加蒸馏水50ml回流提取3次，每次1h，合并提取液，滤过，滤液浓缩至50ml，加氯仿50ml萃取3次，取上清液置于100ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置冰箱内备用；
对照品溶液的制备：精密称定葡萄糖对照品0.0035g，加蒸馏水溶解，定容于25ml量瓶中，即得浓度为0.140mg·ml-1的葡萄糖对照品溶液；
测定法：分别量取对照品溶液和样品供试液0.5ml于试管中，加蒸馏水1ml，精密加入苯酚1.0ml，迅速加入浓硫酸5.0ml摇匀，冷却至室温；同法制备空白溶液，置于沸水加入15min，冷却；在487nm处测定吸收度值，即得。
具体地说，所述脉血康胶囊的检测方法为：
【性状】
本品为肠溶胶囊剂，内容物为灰黄色至灰褐色颗粒或粉末；气微腥，味微咸。
【鉴别】
取本品内容物2g，加生理盐水10ml，充分搅匀，浸渍30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取水蛭对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-乙醇-水(4∶1∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮溶液，在110℃烘约5分钟。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫色斑点。
【检查】
水分
称取本品内容物2.0～2.2g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶(40*25mm)中，厚度不超过5mm，照水分测定法(《中国药典》一部附录ⅨH第一法)测定，不得过7.0％。
装量差异
照胶囊剂装量差异项下(《中国药典》一部附录IL)测定，取供试品10粒，分别精密称定重量，倾出内容物(不得损失囊壳)，硬胶囊囊壳用小刷或其它适宜的用具拭净。分别精密称定囊壳重量。求出每粒内容物的装量。每粒装量与标示量相比较，超出装量差异限度的不得多于2粒，并不得有1粒超出限度一倍。规定本胶囊剂装量差异限度为标示装量的±7.5％。
崩解时限
照崩解时限检查法(《中国药典》一部附录ⅫA)测定，在盐酸溶液(9→1000)中检查2小时，每粒的囊壳均不得有裂缝或崩解现象；将吊篮取出，用少量水洗涤后，每管加入挡板，依法在人工肠液中检查，40分钟内应全部崩解。如有一粒不能完全崩解，应另取6粒复试，均应符合规定。
【含量测定】
抗凝血酶活性测定
取本品装量差异项下的内容物约1g，精密称定，精密加入生理盐水5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100μl，置试管中，加入含0.5％纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与0.1mol/L盐酸溶液40ml，加水至100ml，即得，pH值7.4。)200μl，摇匀，置37℃缓缓滴加每1ml中含40U的凝血酶溶液(每分钟5μl，边滴加边轻轻摇匀)至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积数，按下式计算：
U＝C1V1W/C2V2
式中U：每粒含抗凝血酶活性单位；
C1：凝血酶溶液的浓度(μ/ml)；
C2：供试品溶液的浓度(g/ml)；
V1：消耗凝血酶溶液的体积(μl)；
V2：供试品溶液的加入量(μl)；
W：平均装量；
中和一个国际单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位。
本品每粒含抗凝血酶活性应为11.9～16.1U。
氨基酸含量测定
色谱条件：ODS色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A相：0.02mol·L-1醋酸钾溶液(三乙醇胺与1.5％冰醋酸溶液调至pH7.2)，加四氢呋喃2.85μl，B相：0.1mol·L-1醋酸钾溶液(pH7.2)-甲醇-乙腈(200∶200∶200)；梯度洗脱：0～15min，100％A相，15～16min，40％A相-60％B相，16～30min100％B相；波长：初始338nm，16.5min时262nm；流速：1ml·min-1；柱温：20～25℃。
供试品溶液的制备：取4粒脉血康胶囊去壳，精密称取内容物粉末1.0g，加0.9％生理盐水50ml浸泡24h，匀浆，以3000r·min离心10min，收集上清液；所余沉淀再以30ml乙醇60℃回流2次，每次30min，合并提取液，滤过，挥去乙醇至无醇味，放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液；精密量取脉血康胶囊提取液50μl置于有盖小瓶，加含1％苯酚的6mol·L-1盐酸200μl，冲氮气1min，压盖后置于恒温反应器中，110℃反应20h，取出后加入40％氢氧化钾溶液120μl，涡旋8～10min，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：精密量取氨基酸标准品2ml，无需做任何处理，直接进样。
测定法：分别取待测供试品溶液和对照品溶液各5μl，置于自动进样瓶中，进样测定，即得。
多糖含量测定
脉血康胶囊供试品溶液的制备：取胶囊内容物粉末2.0g，精密称定，置于索式提取器中，加入石油醚(60～90℃)120ml回流提取8h，弃取石油醚，残渣挥干石油醚，再置于圆底烧瓶中，加蒸馏水50ml回流提取3次，每次1h，合并提取液，滤过，滤液浓缩至50ml，加氯仿50ml萃取3次，取上清液置于100ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置冰箱内备用；
对照品溶液的制备：精密称定葡萄糖对照品约0.0035g，加蒸馏水溶解，定容于25ml量瓶中，即得浓度为0.140mg·ml-1的葡萄糖对照品溶液；
测定法：分别量取葡萄糖对照品溶液和样品供试液0.5ml于试管中，加蒸馏水1ml，精密加入苯酚1.0ml，迅速加入浓硫酸5.0ml摇匀，冷却至室温；同法制备空白溶液，置于沸水加入15min，冷却；在487nm处测定吸收度值，即得。
以下是本发明所述检测方法的研究
实验例1：脉血康胶囊中氨基酸的含量测定研究
1仪器与试药
1.1仪器：1100型高效液相色谱仪，G1313A紫外检测器和自动进样系统，Agilent工作站(Agilent公司生产)。
1.2试药：脉血康胶囊；混合氨基酸标品(Agilent公司，批号114580/1，含量/mg·ml-1分别为Ser0.10509，Asp0.13311，Glu0.14713，His0.20963，Gly0.07507，Thr0.1192，Arg0.1742，Ala0.0891，Tyr0.018119，Pro0.11513，Cys0.12015，Val0.11715，Phe0.16519，Ile0.13118，Leu0.13118，Lys0.18265，Met0.13921)；硼酸缓冲液、邻苯二甲醛、9-芴基甲基氯甲酸酯(色谱纯，Agilent公司)；乙醇、甲醇、乙腈、三乙醇胺(色谱纯，美国天地)。
2方法与结果
2.1色谱条件：ODS色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A相：0.02mol·L-1醋酸钾溶液(三乙醇胺与1.5％冰醋酸溶液调至pH7.2)，加四氢呋喃2.85μl，B相：0.1mol·L-1醋酸钾溶液(pH7.2)-甲醇-乙腈(200∶200∶200)；梯度洗脱：0～15min，100％A相，15～16min，40％A相-60％B相，16～30min100％B相；波长：初始338nm，16.5min时262nm；流速：1ml·min-1；柱温：20～25℃。
2.2溶液配置
脉血康胶囊提取液的制备：取4粒脉血康胶囊去壳，精密称取内容物粉末1.0g，加0.9％生理盐水50ml浸泡24h，匀浆，以3000r·min离心10min，收集上清液；所余沉淀再以30ml乙醇60℃回流2次，每次30min，合并提取液，滤过，挥去乙醇至无醇味，放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液。
供试品溶液：精密量取脉血康胶囊提取液50μl置于有盖小瓶，加含1％苯酚的6mol·L-1盐酸200μl，冲氮气1min，压盖后置于恒温反应器中，110℃反应20h，取出后加入40％氢氧化钾溶液120μl，涡旋8～10min，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
氨基酸标准品溶液：精密量取氨基酸标准品2ml，无需做任何处理，直接进样。
2.3测定法：分别取待测供试品溶液和氨基酸标准品溶液各5μl，置于自动进样瓶中，进样测定。
2.4系统适应性考察：取氨基酸标准品溶液按2.3项下操作后进样，得17种氨基酸的理论塔板数均大于16000，峰的分离度≥1.5。
2.5线性关系考察：分别精密吸取氨基酸标准品溶液(0.0210mg/ml)2、4、6、8、10μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，以峰面积积分值(Y)为纵坐标，氨基酸标准品进样量(X)为横坐标，得回归方程为：Y=3*107X-9128.7，r=0.9998，结果见表1、图1。
表1氨基酸标准品峰面积积分值与进样量关系
2.6精密度试验
取氨基酸标准品溶液5μl，按上述色谱件重复进样6次，氨基酸标准品峰面积积分值的RSD<2％，结果见表2。
表2精密度试验
由表2试验表明：精密度良好。
2.7稳定性试验
分别精密吸取供试品溶液10μl在0、9.6、19.2、28.8、38.4、48h内分别样，测得总氨基酸峰面积积分值，计算RSD值，结果见表3。
表3稳定性试验结果
由表3可知：稳定性良好。
2.8回收率试验
精密量取脉血康胶囊提取液1.5ml，置于10ml量瓶中，加入精密量取的适量氨基酸标准品溶液，按供试品溶液的制备方法制备加样回收供试品溶液，分别进样10ul，测定。结果见表4。
表4总氨基酸回收率试验
据表4试验结果表明：回收率在96％-100％之间，加样回收良好。
3样品含量测定
分别取供试品溶液，按2.3项下操作后进样测定，计算总氨基酸含量为0.306mg·g-1。
表5样品测定结果
4结论
本发明采用的HPLC法测定脉血康胶囊中氨基酸含量是可行、有效、简单的，为全面对脉血康胶囊的质控增加了很必要的测定方法。
实验例2：脉血康胶囊中多糖的含量测定研究
1仪器与试药
1.1仪器
UV-2501PC紫外-可见分光光度仪(日本岛津公司)，十万分之一电子天平(上海梅特勒仪器有限公司AE/240)。
1.2试药
脉血康胶囊；D-无水葡萄糖(99％，中国药品生物制品检验所，批号110833-200307)。
2方法与结果
2.1脉血康胶囊供试品溶液的制备
取胶囊内容物粉末2.0g，精密称定，置于索式提取器中，加入石油醚(60～90℃)120ml回流提取8h，弃取石油醚，残渣挥干石油醚，再置于圆底烧瓶中，加蒸馏水50ml回流提取3次，每次1h，合并提取液，滤过，滤液浓缩至50ml，加氯仿50ml萃取3次，取上清液置于100ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置冰箱内备用。
2.2对照品溶液的制备
精密称定葡萄糖对照品约0.0035g，加蒸馏水溶解，定容于25ml量瓶中，即得浓度为0.140mg·ml-1的葡萄糖对照品溶液。
2.3最大吸收波长的测定
分别量取葡萄糖对照品溶液和样品供试液0.5ml于试管中，加蒸馏水1ml，精密加入苯酚1.0ml，迅速加入浓硫酸5.0ml摇匀，冷却至室温；同法制备空白溶液，置于沸水加入15min，冷却；按《中国药典》(2010版)附录中紫外-可见分光光度法，置于分光光度计中，于400～800nm区间扫描，分别测得最大吸收波长为487、491nm。选择对照品溶液的最大吸收波长487nm作为测定波长。
2.4标准曲线的绘制
分别精密量取葡萄糖对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1ml，按照2.3项自“于试管中……冷却”止，以第一份溶液为空白对照，在487nm处分别测定吸光度，以葡萄糖对照品含量(ml)为横坐标、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程为Y＝3.4593X-0.0023，r＝0.999093，线性范围为0.014～1.54mg。结果见表6、图2。
表6线性关系考察
2.5精密度考察
分别精密量取脉血康供试液0.5ml，按2.3项自“于试管中……冷却”止，在487nm处测定吸收度值，连续操作6次，结果溶液吸光度的RSD值为1.77％，仪器精密度良好。见表7。
表7葡萄糖精密度考察
2.6重现性试验
精密称取于50℃恒温干燥的脉血康胶囊内容物6份，按2.1项制备供试液品溶液，并精密吸取供试液1ml，按2.3项自“于试管中……冷却”止，于487nm处分别测定其吸光度，结果吸光度RSD值为1.95％，方法重现性好，结果见表8。
表8重现性试验
2.7稳定性试验
精密量取脉血康供试液0.2ml，按2.3项自“于试管中……冷却”止，分别在0、30、60、90、120min时在487nm处测定吸光度，结果吸光度RSD为1.75％；脉血康样品在2h内稳定。结果见表9。
表9脉血康胶囊样品的稳定性考察
2.8加样回收试验
取已知含量脉血康胶囊样品9份，每份约0.1g精密称定，分别精密加入葡萄糖对照品，按2.1项制备供试液溶液，精密吸取1ml按2.3项自“于试管中……冷却”止，在487nm处测定各吸光值，计算供试液平均回收率为96.98％，其RSD为1.87％。结果见表10。
表10加样回收试验结果
2.9脉血康胶囊样品含量测定
精密量取脉血康供试液0.20ml，按2.3项自“于试管中……冷却”止，在487nm处测定吸光度，按回归方程计算样品中可溶性蛋白质含量，结果平均含量(n=6)为3.33％。
表11脉血康胶囊中葡萄糖含量测定
3结论
本发明采用的紫外-分光光度法测定脉血康胶囊中多糖的含量，检测结果准确，且稳定性、重复性好。
与现有技术相比，本发明提供了脉血康胶囊中氨基酸和多糖的含量测定方法，弥补了现有技术中单一的抗凝血酶活性测定的含量测定方法，所述检测方法测定准确，灵敏度高，重复性好，能够有效控制脉血康胶囊的质量，达到了发明目的。
附图说明
图1是氨基酸标准品标准曲线图
图2是葡萄糖对照品标准曲线图
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
具体实施方式
实施例1：
本发明所述脉血康胶囊这样制备：取鲜水蛭，在-10℃～-15℃下冷冻，取出捣碎，40℃～50℃、-0.1MPa干燥，粉碎，过筛，装入肠溶胶囊，即得。
所述检测方法为：
【性状】
本品为肠溶胶囊剂，内容物为灰黄色至灰褐色颗粒或粉末；气微腥，味微咸。
【鉴别】
取本品内容物2g，加生理盐水10ml，充分搅匀，浸渍30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取水蛭对照药材2g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》一部附录ⅥB)试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-乙醇-水(4∶1∶1∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮溶液，在110℃烘约5分钟。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相 同的紫色斑点。
【检查】
水分
称取本品内容物2.0～2.2g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶(40*25mm)中，厚度不超过5mm，照水分测定法(《中国药典》一部附录ⅨH第一法)测定，不得过7.0％。
装量差异
照胶囊剂装量差异项下(《中国药典》一部附录IL)测定，取供试品10粒，分别精密称定重量，倾出内容物(不得损失囊壳)，硬胶囊囊壳用小刷或其它适宜的用具拭净。分别精密称定囊壳重量。求出每粒内容物的装量。每粒装量与标示量相比较，超出装量差异限度的不得多于2粒，并不得有1粒超出限度一倍。规定本胶囊剂装量差异限度为标示装量的±7.5％。
崩解时限
照崩解时限检查法(《中国药典》一部附录ⅫA)测定，在盐酸溶液(9→1000)中检查2小时，每粒的囊壳均不得有裂缝或崩解现象；将吊篮取出，用少量水洗涤后，每管加入挡板，依法在人工肠液中检查，40分钟内应全部崩解。如有一粒不能完全崩解，应另取6粒复试，均应符合规定。
【含量测定】
抗凝血酶活性测定
取本品装量差异项下的内容物约1g，精密称定，精密加入生理盐水5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100μl，置试管中，加入含0.5％纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与0.1mol/L盐酸溶液40ml，加水至100ml，即得，pH值7.4。)200μl，摇匀，置37℃缓缓滴加每1ml中含40U的凝血酶溶液(每分钟5μl，边滴加边轻轻摇匀)至凝固，记录消耗
凝血酶溶液的体积数，按下式计算：
U＝C1V1W/C2V2
式中U：每粒含抗凝血酶活性单位；
C1：凝血酶溶液的浓度(μ/ml)；
C2：供试品溶液的浓度(g/ml)；
V1：消耗凝血酶溶液的体积(μl)；
V2：供试品溶液的加入量(μl)；
W：平均装量；
中和一个国际单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位。
本品每粒含抗凝血酶活性应为11.9～16.1U。
氨基酸含量测定
色谱条件：ODS色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相A相：0.02mol·L-1醋酸钾溶液(三乙醇胺与1.5％冰醋酸溶液调至pH7.2)，加四氢呋喃2.85μl，B相：0.1mol·L-1醋酸钾溶液(pH7.2)-甲醇-乙腈(200∶200∶200)；梯度洗脱：0～15min，100％A相，15～16min，40％A相-60％B相，16～30min100％B相；波长：初始338nm，16.5min时262nm；流速：1ml·min-1；柱温：20～25℃。
供试品溶液的制备：取4粒脉血康胶囊去壳，精密称取内容物粉末1.0g，加0.9％生理盐水50ml浸泡24h，匀浆，以3000r·min离心10min，收集上清液；所余沉淀再以30ml乙醇60℃回流2次，每次30min，合并提取液，滤过，挥去乙醇至无醇味，放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液；精密量取脉血康胶囊提取液50μl置于有盖小瓶，加含1％苯酚的6mol·L-1盐酸200μl，冲氮气1min，压盖后置于恒温反应器中，110℃反应20h，取出后加入40％氢氧化钾溶液120μl，涡旋8～10min，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：精密量取氨基酸标准品2ml，无需做任何处理，直接进样。
测定法：分别取待测供试品溶液和对照品溶液各5μl，置于自动进样瓶中，进样测定，即得。
多糖含量测定
脉血康胶囊供试品溶液的制备：取胶囊内容物粉末2.0g，精密称定，置于索式提取器中，加入石油醚(60～90℃)120ml回流提取8h，弃取石油醚，残渣挥干石油醚，再置于圆底烧瓶中，加蒸馏水50ml回流提取3次，每次1h，合并提取液，滤过，滤液浓缩至50ml，加氯仿50ml萃取3次，取上清液置于100ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置冰箱内备用；
对照品溶液的制备：精密称定葡萄糖对照品约0.0035g，加蒸馏水溶解，定容于25ml量瓶中，即得浓度为0.140mg·ml-1的葡萄糖对照品溶液；
测定法：分别量取葡萄糖对照品溶液和样品供试液0.5ml于试管中，加蒸馏水1ml，精密加入苯酚1.0ml，迅速加入浓硫酸5.0ml摇匀，冷却至室温；同法制备空白溶液，置于沸 水加入15min，冷却；在487nm处测定吸收度值，即得。
Claims (3)
1.一种脉血康胶囊的检测方法，其特征在于：所述脉血康胶囊由鲜水蛭粉碎后填充胶囊而得；所述检测方法包括对氨基酸和多糖的含量测定，其中，氨基酸的含量测定方法为：采用高效液相色谱法测定：
色谱条件：ODS色谱柱4.6mm×250mm，5μm；流动相A相：0.02mol·L-1醋酸钾溶液，加四氢呋喃2.85μl；所述0.02mol·L-1的醋酸钾溶液是由三乙醇胺与1.5％冰醋酸溶液调至pH7.2；B相：pH7.2的0.1mol·L-1醋酸钾溶液∶甲醇∶乙腈＝200∶200∶200；梯度洗脱：0～15min，100％A相，15～16min，40％A相-60％B相，16～30min100％B相；波长：初始338nm，16.5min时262nm；流速：1ml·min-1；柱温：20～25℃；
供试品溶液的制备：取4粒脉血康胶囊去壳，精密称取内容物粉末1.0g，加0.9％生理盐水50ml浸泡24h，匀浆，以3000r·min离心10min，收集上清液；所余沉淀再以30ml乙醇60℃回流2次，每次30min，合并提取液，滤过，挥去乙醇至无醇味，放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液；精密量取脉血康胶囊提取液50μl置于有盖小瓶，加含1％苯酚的6mol·L-1盐酸200μl，冲氮气1min，压盖后置于恒温反应器中，110℃反应20h，取出后加入40％氢氧化钾溶液120μl，涡旋8～10min，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：精密量取氨基酸标准品2ml，无需做任何处理，直接进样；
测定法：分别取待测供试品溶液和对照品溶液各5μl，置于自动进样瓶中，进样测定，即得。
2.如权利要求1所述脉血康胶囊的检测方法，其特征在于：所述多糖的含量测定方法为：采用分光光度法测定：
供试品溶液的制备：取胶囊内容物粉末2.0g，精密称定，置于索式提取器中，加入60～90℃的石油醚120ml回流提取8h，弃取石油醚，残渣挥干石油醚，再置于圆底烧瓶中，加蒸馏水50ml回流提取3次，每次1h，合并提取液，滤过，滤液浓缩至50ml，加氯仿50ml萃取3次，取上清液置于100ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置冰箱内备用；
对照品溶液的制备：精密称定葡萄糖对照品0.0035g，加蒸馏水溶解，定容于25ml量瓶中，即得浓度为0.140mg·ml-1的葡萄糖对照品溶液；
测定法：分别量取对照品溶液和样品供试液0.5ml于试管中，加蒸馏水1ml，精密加入苯酚1.0ml，迅速加入浓硫酸5.0ml摇匀，冷却至室温；同法制备空白溶液，置于沸水加入15min，冷却；在487nm处测定吸收度值，即得。
3.如权利要求1或2所述脉血康胶囊的检测方法，其特征在于：
【性状】
本品为肠溶胶囊剂，内容物为灰黄色至灰褐色颗粒或粉末；气微腥，味微咸；
【鉴别】
取本品内容物2g，加生理盐水10ml，充分搅匀，浸渍30分钟，滤过，滤液作为供试品溶液；另取水蛭对照药材2g，同法制成对照药材溶液；照中国药典薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各1μl，分别点于同一含羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸∶乙醇∶水=4∶1∶1∶2为展开剂，展开，取出，晾干，喷以0.5％茚三酮溶液，在110℃烘约5分钟，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫色斑点；
【检查】
水分
称取本品内容物2.0～2.2g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶40*25mm中，厚度不超过5mm，照中国药典水分测定法测定，不得过7.0％；
装量差异
照中国药典胶囊剂装量差异项下测定，取供试品10粒，分别精密称定重量，倾出内容物，硬胶囊囊壳用小刷或其它适宜的用具拭净；分别精密称定囊壳重量；求出每粒内容物的装量；每粒装量与标示量相比较，超出装量差异限度的不得多于2粒，并不得有1粒超出限度一倍；规定本胶囊剂装量差异限度为标示装量的±7.5％；
崩解时限
照中国药典崩解时限检查法测定，在盐酸溶液9→1000中检查2小时，每粒的囊壳均不得有裂缝或崩解现象；将吊篮取出，用少量水洗涤后，每管加入挡板，依法在人工肠液中检查，40分钟内应全部崩解；如有一粒不能完全崩解，应另取6粒复试，均应符合规定；
【含量测定】
抗凝血酶活性测定
取本品装量差异项下的内容物约1g，精密称定，精密加入生理盐水5ml，充分搅拌，浸提30分钟，并时时振摇，离心，精密量取上清液100μl，置试管中，加入含0.5％纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液200μl，所述0.5％纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液是取0.2mol/L三羟甲基氨基甲烷溶液25ml与0.1mol/L盐酸溶液40ml，加水至100ml，即得，pH值7.4；摇匀，置37℃缓缓滴加每1ml中含40U的凝血酶溶液，每分钟5μl，边滴加边轻轻摇匀至凝固，记录消耗凝血酶溶液的体积数，按下式计算：
U＝C1V1W/C2V2
式中U：每粒含抗凝血酶活性单位；
C1：凝血酶溶液的浓度(μ/ml)；
C2：供试品溶液的浓度(g/ml)；
V1：消耗凝血酶溶液的体积(μl)；
V2：供试品溶液的加入量(μl)；
W：平均装量；
中和一个国际单位的凝血酶的量，为一个抗凝血酶活性单位；
本品每粒含抗凝血酶活性应为11.9～16.1U；
氨基酸含量测定
色谱条件：ODS色谱柱4.6mm×250mm，5μm；流动相A相：0.02mol·L-1醋酸钾溶液，加四氢呋喃2.85μl；所述0.02mol·L-1的醋酸钾溶液是由三乙醇胺与1.5％冰醋酸溶液调至pH7.2；B相：pH7.2的0.1mol·L-1醋酸钾溶液∶甲醇∶乙腈＝200∶200∶200；梯度洗脱：0～15min，100％A相，15～16min，40％A相-60％B相，16～30min100％B相；波长：初始338nm，16.5min时262nm；流速：1ml·min-1；柱温：20～25℃；
供试品溶液的制备：取4粒脉血康胶囊去壳，精密称取内容物粉末1.0g，加0.9％生理盐水50ml浸泡24h，匀浆，以3000r·min离心10min，收集上清液；所余沉淀再以30ml乙醇60℃回流2次，每次30min，合并提取液，滤过，挥去乙醇至无醇味，放至室温后加入上述上清液溶解即得提取液；精密量取脉血康胶囊提取液50μl置于有盖小瓶，加含1％苯酚的6mol·L-1盐酸200μl，冲氮气1min，压盖后置于恒温反应器中，110℃反应20h，取出后加入40％氢氧化钾溶液120μl，涡旋8～10min，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：精密量取氨基酸标准品2ml，无需做任何处理，直接进样；
测定法：分别取待测供试品溶液和对照品溶液各5μl，置于自动进样瓶中，进样测定，即得；
多糖含量测定
供试品溶液的制备：取胶囊内容物粉末2.0g，精密称定，置于索式提取器中，加入60～90℃的石油醚120ml回流提取8h，弃取石油醚，残渣挥干石油醚，再置于圆底烧瓶中，加蒸馏水50ml回流提取3次，每次1h，合并提取液，滤过，滤液浓缩至50ml，加氯仿50ml萃取3次，取上清液置于100ml量瓶中，加蒸馏水至刻度，摇匀，放置冰箱内备用；
对照品溶液的制备：精密称定葡萄糖对照品0.0035g，加蒸馏水溶解，定容于25ml量瓶中，即得浓度为0.140mg·ml-1的葡萄糖对照品溶液；
测定法：分别量取对照品溶液和样品供试液0.5ml于试管中，加蒸馏水1ml，精密加入苯酚1.0ml，迅速加入浓硫酸5.0ml摇匀，冷却至室温；同法制备空白溶液，置于沸水加入15min，冷却；在487nm处测定吸收度值，即得。
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- 2012-12-14 CN CN2012105441177A patent/CN103076405A/zh active Pending
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