CN103575846B - 一种定量鉴定麦芽汁中混浊物质的方法 - Google Patents
一种定量鉴定麦芽汁中混浊物质的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种定量鉴定麦芽汁中混浊物质的方法，是以麦芽汁作为样品，先对麦汁离心，沉淀冷冻干燥；然后测定冻干粉中的蛋白质、总糖及总多酚含量；并采用质谱手段鉴定蛋白质；采用色谱手段进行氨基酸分析、单糖组成分析及多糖分子量的测定；采用红外光谱对多糖的结构进行鉴定。本发明采用定量的方法明确了麦芽汁混浊物质的组成情况，确定引起江苏啤酒大麦麦芽的混浊成分主要为低分子量（1000Da左右）的葡聚糖，这些葡聚糖的产生是由于內源外切葡聚糖酶的不足导致的，本结果可以指导大麦育种人员和麦芽制造人员控制大麦及其制麦过程中的內源外切葡聚糖酶，促进葡聚糖的降解，提高麦芽的酿造质量，具有积极的意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种定量鉴定麦芽汁中混浊物质的方法。
背景技术
我国啤酒产量已连续多年位居世界第一，但是与此同时，我国啤酒麦芽产业的发展却一直不尽人意。究其原因，由于地理气候、品种、生产工艺等条件的差异，国产麦芽各种酶系活力不足，导致蛋白质、半纤维素等物质降解不充分，其中糖化后的麦汁浊度过高是其突出的质量缺陷之一，造成国产麦芽无法用于生产高端啤酒，或使用量受到很大限制。目前对于麦汁混浊物质的鉴定，多以染料染色后显微观察为主，这种方法不能准确了解麦汁中混浊物质的组成情况，因而无法根据实际情况解决麦汁浊度过高的问题。
与此同时，由于浊度这一指标在国标《啤酒麦芽》（QB/T1686-2008）中未做要求，因此未引起育种人员的重视，而麦芽行业的技术层次稍微偏低，且麦芽企业利润微薄，没有足够的科研人员和资金投入，因此，这些缺陷导致以江苏地产啤酒大麦麦芽为主的部分国产麦芽在啤酒酿造中用量较低，且主要用于中、低档酒。
发明内容
本发明提供了一种定量检测麦汁混浊物质的方法。
为解决上述问题，提供技术方案如下：1）过滤后的麦芽汁离心收集沉淀物质，沉淀物质进行冷冻干燥；2）分别测定蛋白质含量、总糖含量、多酚含量；3）取冻干粉，溶含有SDS和β-巯基乙醇的尿素中，离心去除不溶部分，上清液进行SDS-PAGE；4）切取SDS-PAGE电泳胶上的目标条带，经过胰蛋白酶消化之后，通过飞行时间串联质谱分析和蛋白质数据库检索进行蛋白质鉴定；4）取冻干粉，用盐酸在110℃真空条件下水解，水解液经过滤、离心后用高效液相色谱法测定氨基酸含量；5）取冻干粉，加蒸馏水和HCl于沸水浴中水解，冷却至室温后加NaOH中和，离心，过滤膜，用高效阴离子交换色谱分析单糖含量；6）取冻干粉，溶于蒸馏水，离心去除不溶物，取上清，用高效体积排阻色谱分析多糖分子量；7）取冻干粉，用傅里叶红外光谱仪分析多糖结构。
本发明具体技术方案如下：
1)过滤后的麦汁离心，12000r/min离心30min后，弃去上清，沉淀物质冷冻干燥；
2)采用凯氏定氮法测定蛋白质含量，采用苯酚-硫酸法测定总糖含量，采用Folin-Ciocalteu法测定总多酚含量；
3)蛋白质的鉴定方法：称取10mg冻干粉，溶于500μL8mol/L尿素（含有1%（W/V）SDS、1%（V/V）β-巯基乙醇）中，离心去除不溶部分，上清依照Laemmli的方法进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，分离胶和浓缩胶的聚丙烯酰胺终浓度分别为12.5%(w/v)和5%(w/v)，用考马斯亮蓝染色，标准分子量蛋白为：β-半乳糖苷酶(116kDa)、牛血清白蛋白(66.2kDa)、卵清蛋白(45.0kDa)、乳酸脱氢酶(35.0kDa)、REase Bsp981(25.0kDa)、β-乳球蛋白(18.4kDa)和溶解酵素(14.4kDa)；切取SDS-PAGE电泳胶上的目标条带，经过胰蛋白酶消化之后，通过飞行时间串联质谱分析和蛋白质数据库（NCBInr）检索（http://www.matrixscience.com/）进行蛋白质鉴定；
4)氨基酸含量分析：称取冻干粉约0.15g，精确到0.01g，用6mol/L盐酸在110℃真空条件下水解22h，水解液经过滤、离心后用高效液相色谱法测定氨基酸含量；色谱柱：HYPERSIL OSD色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；柱温：40℃；紫外检测器波长：338nm；流动相A：1000mL0.8%乙酸钠溶液与225mL三乙胺混合后用5%醋酸将pH调至7.20±0.05，加入5mL四氢呋喃，混合；流动相B：用2%醋酸将400mL2%乙酸钠溶液的pH调至7.20±0.05，加入800mL乙腈和800mL甲醇，混合；流速：1.0mL/min；梯度洗脱条件：0～27.5min，92%A、8%B；27.5～32min，40%A、60%B；32～35.5min，100%B；
5)单糖组成分析：称取10mg冻干粉，加4ml蒸馏水和4ml4mol/L HCl，于沸水浴中水解1h，冷却至室温后加4ml4mol/L NaOH中和，离心，过0.45μm滤膜，用高效阴离子交换色谱分析单糖含量；色谱柱：CarboPac PA20；检测器：脉冲安培检测器；流动相A：水；流动相B：250mmol/L NaOH；流动相C：1mol/L NaAc；流速：0.5mL/min；梯度洗脱条件：0～21.1min，98.2%A、1.8%B；21.1～30min，93.2%A、1.8%B、5%C；30～30.1min，78.2%A、1.8%B、20%C；30.1～50min，20%A、80%B；
6)多糖分子量测定：称取10mg冻干粉，溶于1mL蒸馏水，离心去除不溶物，取上清，用高效体积排阻色谱（HPSEC）分析多糖分子量；色谱柱：UltrahydrogelTMLinear（300mm×7.8mm i.d.），两根串联；检测器：视差折光检测器；流动相：0.1mol/L NaNO3；流速：0.9mL/min；柱温：45℃；
7)多糖结构分析：取冻干粉，用傅里叶红外光谱仪进行分析；
称取冻干粉2mg与100mg KBr混合，研磨均匀，压片，测定红外光谱，并用空片做空白；分辨率：0.5～16cm-1；测试波数范围：4000～400cm-1；波数精度：＜0.01cm-1；扫描次数，32。
本发明有益效果：确定引起江苏啤酒大麦麦芽的混浊成分主要为低分子量（1000Da左右）的葡聚糖，这些葡聚糖的产生是由于內源外切葡聚糖酶的不足导致的，该结果可以指导大麦育种人员和麦芽制造人员控制大麦及其制麦过程中的內源外切葡聚糖酶，促进葡聚糖的降解，提高麦芽的酿造质量。
附图说明
图1为混浊蛋白质的SDS-PAGE电泳图；
（M为marker）。
图2为HPSEC法测定混浊物质中多糖分子量的色谱图。
图3为红外光谱法鉴定混浊物质中多糖结构的光谱图。
具体实施方式
实施例
取单二麦芽协定糖化制备的麦芽汁2000mL，12000r/min离心30min后，弃去上清，沉淀冷冻干燥。得到冻干粉约0.2g。
1)对混浊物质进行蛋白质含量测定
采用凯氏定氮测定总氮含量，蛋白质含量=总氮含量×6.25。结果显示蛋白质含量为15.23%。
2)对混浊物质进行总糖含量测定
采用苯酚-硫酸比色法测定总糖含量，结果以葡萄糖计，含量为82.57%。
3)对混浊物质进行总多酚含量测定
采用Folin-Ciocalteu法测定总多酚含量，结果以没食子酸计，含量为1.07%。
4)混浊物质的蛋白质鉴定
取冻干粉，溶于8mol/L尿素（含有1%（W/V）SDS、1%（V/V）β-巯基乙醇）中，离心去除不溶部分。上清采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)根据分子量分离蛋白质（图1）。切取SDS-PAGE电泳胶上的目标条带，经过胰蛋白酶消化之后，通过飞行时间串联质谱分析和蛋白质数据库（NCBInr）检索（http://www.matrixscience.com/）进行蛋白质鉴定。
表1蛋白质鉴定的结果
5)氨基酸含量分析
表2采用色谱法进行氨基酸含量分析
6)单糖组成分析
称取冻干粉10mg，HCl水解后，采用高效阴离子交换色谱测定单糖含量，结果如下：
表3采用高效阴离子交换色谱测定单糖含量
7)多糖分子量测定
称取冻干粉10mg，溶于1mL蒸馏水，离心去除不溶物，取上清，用高效体积排阻色谱分析多糖分子量（图2）。结果显示混浊物质多糖数均分子量为1672Da，重均分子量为2139Da，峰值分子量为1552Da。
8)多糖结构鉴定
称取冻干粉2mg与100mg KBr混合，研磨均匀，压片，测定红外光谱（图3）。结果显示在844cm-1处有吸收峰，判定为α键，故多糖中大部分组成为糊精。
Claims (1)
1.一种定量鉴定麦芽汁中混浊物质的方法，其特征在于，步骤如下：1)过滤后的麦芽汁离心收集沉淀物质，沉淀物质进行冷冻干燥；2)分别测定蛋白质含量、总糖含量、多酚含量；3)取冻干粉，溶于含有SDS和β-巯基乙醇的尿素中，离心去除不溶部分，上清液进行SDS-PAGE电泳；4)切取SDS-PAGE电泳胶上的目标条带，经过胰蛋白酶消化之后，通过飞行时间串联质谱分析和蛋白质数据库检索进行蛋白质鉴定；4)取冻干粉，用盐酸在110℃真空条件下水解，水解液经过滤、离心后用高效液相色谱法测定氨基酸含量；5)取冻干粉，加蒸馏水和HCl于沸水浴中水解，冷却至室温后加NaOH中和，离心，过滤膜，用高效阴离子交换色谱分析单糖含量；6)取冻干粉，溶于蒸馏水，离心去除不溶物，取上清，用高效体积排阻色谱分析多糖分子量；7)取冻干粉，用傅里叶红外光谱仪分析多糖结构；
具体步骤如下：
1)过滤后的麦汁离心，12000r/min离心30min后，弃去上清，沉淀物质冷冻干燥；
2)采用凯氏定氮法测定蛋白质含量，采用苯酚-硫酸法测定总糖含量，采用Folin-Ciocalteu法测定总多酚含量；
3)蛋白质的鉴定方法：称取10mg冻干粉，溶于500μL 8mol/L尿素，所述500μL8mol/L尿素含有1％(W/V)SDS、1％(V/V)β-巯基乙醇，离心去除不溶部分，上清液进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶和浓缩胶的聚丙烯酰胺终浓度分别为12.5％(w/v)和5％(w/v)，用考马斯亮蓝染色，标准分子量蛋白为：β-半乳糖苷酶(116kDa)、牛血清白蛋白(66.2kDa)、卵清蛋白(45.0kDa)、乳酸脱氢酶(35.0kDa)、REase Bsp981(25.0kDa)、β-乳球蛋白(18.4kDa)和溶解酵素(14.4kDa)；切取SDS-PAGE电泳胶上的目标条带，经过胰蛋白酶消化之后，通过飞行时间串联质谱分析和蛋白质数据库NCBInr检索进行蛋白质鉴定；
4)氨基酸含量分析：称取冻干粉约0.15g，精确到0.01g，用6mol/L盐酸在110℃真空条件下水解22h，水解液经过滤、离心后用高效液相色谱法测定氨基酸含量；色谱柱：HYPERSIL OSD色谱柱250mm×4.6mm，5μm；柱温：40℃；紫外检测器波长：338nm；流动相A：1000mL 0.8％乙酸钠溶液与225mL三乙胺混合后用5％醋酸将pH调至7.20±0.05，加入5mL四氢呋喃，混合；流动相B：用2％醋酸将400mL2％乙酸钠溶液的pH调至7.20±0.05，加入800mL乙腈和800mL甲醇，混合；流速：1.0mL/min；梯度洗脱条件：0～27.5min，92％A、8％B；27.5～32min，40％A、60％B；32～35.5min，100％B；
5)单糖组成分析：称取10mg冻干粉，加4ml蒸馏水和4ml 4mol/L HCl，于沸水浴中水解1h，冷却至室温后加4ml 4mol/LNaOH中和，离心，过0.45μm滤膜，用高效阴离子交换色谱分析单糖含量；色谱柱：CarboPac PA20；检测器：脉冲安培检测器；流动相A：水；流动相B：250mmol/L NaOH；流动相C：1mol/L NaAc；流速：0.5mL/min；梯度洗脱条件：0～21.1min，98.2％A、1.8％B；21.1～30min，93.2％A、1.8％B、5％C；30～30.1min，78.2％A、1.8％B、20％C；30.1～50min，20％A、80％B；
6)多糖分子量测定：称取10mg冻干粉，溶于1mL蒸馏水，离心去除不溶物，取上清，用高效体积排阻色谱分析多糖分子量；色谱柱：UltrahydrogelTMLinear300mm×7.8mm i.d.，两根串联；检测器：视差折光检测器；流动相：0.1mol/LNaNO3；流速：0.9mL/min；柱温：45℃；
7)多糖结构分析：取冻干粉，用傅里叶红外光谱仪进行分析；称取冻干粉2mg与100mg KBr混合，研磨均匀，压片，测定红外光谱，并用空片做空白；分辨率：0.5～16cm-1；测试波数范围：4000～400cm-1；波数精度：＜0.01cm-1；扫描次数，32。
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