CN103278453A - 利用双向电泳和maldi-tof-ms技术获得小麦根相关抗旱蛋白的方法 - Google Patents

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叶景秀
姚有华
谢德庆
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Abstract

本发明公开了一种利用双向电泳和MALDI-TOF-MS技术获得小麦根相关抗旱蛋白的方法，包括以下步骤：(1)材料处理；(2)双向电泳；(3)图谱分析；(4)MALDI-TOF-MS：差异蛋白质点经胶内酶解后，用ultraflex TOF/TOF进行MALDI-TOF肽质谱指纹图分析，所得PMF数据通过Mascot软件检索蛋白质数据库进行鉴定。本发明采用双向电泳和MALDI-TOF-MS技术相结合，通过分析干旱胁迫与正常供水小麦根的蛋白表达差异，并通过质谱进一步鉴定，通过这种方法获得的根表达蛋白是和性状直接联系的，相对于基因水平和作物其它器官更具有实际意义。

Description

利用双向电泳和MALDI-TOF-MS技术获得小麦根相关抗旱蛋白的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种利用双向电泳和MALDI-TOF-MS技术获得小麦根相关抗旱蛋白的方法。
背景技术
目前全球干旱、半干旱地区占耕地面积的43％，大多数国家都面临水资源危机，我国也不例外，干旱在我国分布广泛，特别是我国北方地区，干旱已成为我国北方地区的主要自然灾害之一，每年都有不同程度的干旱危害农业生产，导致粮食减产。干旱是精细农业和农业产量稳定的主要威胁。青海省地处我国西北部的青藏高原，属于高原大陆性气候，干燥、多风，降水少且时空分布不均、地域差异大。境内干旱频繁且严重，受害面积大。据青海省统计局2009年统计，青海省耕地面积为54.3万公顷，其中旱地面积为35.7万公顷，约占全部耕地的66％，降水量平均少于300毫米，且不能灌溉。全省降水量主要集中在6～9月份，10月～3月降水量仅占全年降水的4.1％-16.6％，4-5月仅占全年降水的7.8％～19.5％，加之蒸发量大，因此，青海省各地的干旱又以春旱最为严重，有“十年九旱”之说。干旱已成为青海省最为严重的农业气象灾害之一。
春小麦是青海省的主要粮食作物，也是青海人民的主要口粮之一。小麦的产量和品质不仅受遗传特性的影响，而且与生态环境和栽培措施有密切关系。栽培措施中，水是影响小麦生长发育与产量、品质最活跃的因素之一。4-5月份是青海省干旱最严重的时期，而此时春小麦正处于出苗-分蘖期，干旱对小麦的生长发育造成了严重的影响，进一步影响了小麦的产量和品质。根是小麦水分吸收利用的重要器官。因此，进行小麦苗期根抗旱研究，对培育具有抗旱特性的小麦品种具有十分重要的意义。
蛋白质组学(proteomics)是基于蛋白质组的对大量蛋白质的一个整体研究，包括在生长发育中和各种外界因素作用下的蛋白质结构、功能和丰度的变化等，它是后基因组时代功能基因组学研究的新兴学科和热点领域，是基因组DNA序列与基因功能之间的桥梁，是研究功能基因组学的重要方法，双向电泳、MALDI-TOF-MS技术是蛋白质组学研究中的重要手段。
目前抗旱性研究多采用生理生化的方法，这种方法比较繁琐，而且通过测定多个指标也只能大体鉴定植物的抗旱性，耗时较长，不能从根本上解决培育抗旱品种的难题。在基因水平进行抗旱基因的筛选，虽然能确定一些与抗旱相关的基因，但是基于mRNA数量的检测方法并不能完全了解特定基因的表达情况。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种利用双向电泳和MALDI-TOF-MS技术获得小麦根相关抗旱蛋白的方法。
本发明的技术方案如下：
一种利用双向电泳和MALDI-TOF-MS技术获得小麦根相关抗旱蛋白的方法，包括以下步骤：(1)材料处理：对春小麦品种青春38幼苗分别进行PEG6000干旱胁迫、复水作为处理，以相对应的正常供水作为对照，分别提取根蛋白质，进行双向电泳；
(2)双向电泳：将含样品蛋白质900μg水化液共350μl沿PROTAIN IEF Cell型电泳仪聚焦槽内连续加入；将17cm IPG胶条胶面朝下覆盖在样品上，被动吸收1h后，加2ml矿物油覆盖胶条；第二向SDS-PAGE用11％凝胶；凝胶染色采用胶体考马斯亮蓝染色法，其过程依次是：超纯水洗2次，每次10min；固定液固定2.5h；超纯水快速冲洗2次；染色液染色12.5h；脱色液脱色1h；超纯水水洗约4h，每30min换水一次，至斑点清晰为准；
(3)图谱分析：染色后的2-DE凝胶应用UMAX PowerLook2100XL型光密度扫描仪透射扫描获取图像，分辨率设为600dpi，在PDQuest2DE8.0.1分析软件的辅助下，定义蛋白质点的大小、强弱，检测和统计蛋白质点数目，计算蛋白质点的分子量和等电点，选取表达水平相差2倍以上的差异蛋白质点进行质谱分析；
(4)MALDI-TOF-MS：差异蛋白质点经胶内酶解后，用ultraflex TOF/TOF进行MALDI-TOF肽质谱指纹图分析，所得PMF数据通过Mascot软件检索蛋白质数据库进行鉴定。
现有技术中的生理生化方法比较繁琐，而且通过测定多个指标也只能大体鉴定植物的抗旱性，耗时较长，不能从根本上解决培育抗旱品种的难题。基因水平进行抗旱基因的筛选，虽然能确定一些与抗旱相关的基因，但是基于mRNA数量的检测方法并不能完全了解特定基因的表达情况。根是小麦水分吸收利用的重要器官，本发明采用双向电泳和MALDI-TOF-MS技术相结合，通过分析干旱胁迫与正常供水小麦根的蛋白表达差异，并通过质谱进一步鉴定，通过这种方法获得的根表达蛋白是和性状直接联系的，相对于基因水平和作物其它器官更具有实际意义。
附图说明
图1为春小麦品种青春38PEG6000胁迫与对照双向电泳图谱；
图2为一个差异表达蛋白点的质谱图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
(1)材料处理：对春小麦品种青春38幼苗分别进行PEG6000干旱胁迫、复水作为处理，以相对应的正常供水作为对照，分别提取根蛋白质，进行双向电泳。
(2)双向电泳：主要按
Figure BSA00000865167200031
等的方法和IPGphor等电聚焦系统指南进行。将含样品蛋白质900μg水化液(加入痕量0.001％溴酚蓝)共350μl沿PROTAIN IEF Cell型电泳仪(BIO-RAD)聚焦槽内连续加入。将17cm IPG胶条胶面朝下覆盖在样品上，被动吸收1h后，加2ml矿物油覆盖胶条。等电聚焦及第二向垂直板SDS-PAGE参照陈蕊红等方法稍加改动，第二向SDS-PAGE用11％凝胶。凝胶染色采用胶体考马斯亮蓝染色法，其过程依次是：超纯水洗2次，每次10min；固定液固定2.5h；超纯水快速冲洗2次；染色液染色12.5h；脱色液脱色1h；超纯水水洗约4h，每30min换水一次，至斑点清晰为准。
(3)图谱分析染色后的2-DE凝胶应用UMAX PowerLook2100XL型光密度扫描仪透射扫描获取图像，分辨率设为600dpi，在PDQuest2DE8.0.1分析软件(美Bio-Rad公司)的辅助下，定义蛋白质点的大小、强弱，检测和统计蛋白质点数目，计算蛋白质点的分子量和等电点，选取表达水平相差2倍以上的差异蛋白质点进行质谱分析，如图1所示，左图是春小麦品种青春38正常供水培养的对照根蛋白双向电泳图谱，右图是春小麦品种青春38经PEG6000干旱胁迫72小时的处理根双向电泳图谱。图中圆圈标出的蛋白点是对照与处理相比时出现的差异蛋白，选取标数字的点进行MALDI-TOF肽质谱指纹图分析。
(4)MALDI-TOF-MS：差异蛋白质点经胶内酶解后，用ultraflexTOF/TOF(德国BRUKER)进行MALDI-TOF肽质谱指纹图分析(图2)，所得PMF数据通过Mascot(Matrix Science Ltd，London)软件检索蛋白质数据库进行鉴定(表1)，如图2所示，纵坐标代表信号强度即表达丰度，横坐标表示质荷比值，图2是其中一个差异蛋白点的质谱图。
如表1所示，对图1中选取的差异表达蛋白进行MALDI-TOF肽质谱指纹鉴定的结果，参数在NCBInr数据库中检索蛋白质信息：Species：green plant；酶：胰蛋白酶(trypsin)；肽质量模式：monoisotopic；肽质量允错：±100ppm；荷电状态：1+；最大漏切位点：1；一般认为Sequence coverage＞10％，NCBInr数据库搜索得分大于73分被认为是有效的。
本实验共选取其中29个差异蛋白点进行MALDI-TOF-MS鉴定，其中经PEG6000胁迫后上调表达(包括新增特异表达蛋白)的蛋白7个，下调表达(包括缺失)的蛋白5个；经复水24小时后，上调表达的蛋白7个，下调表达的蛋白10个；鉴定结果为20个阳性，9个阴性(注：阴性结果无意义)。阳性结果具体见下表2：
表1差异表达蛋白的质谱鉴定(部分)
Figure BSA00000865167200041
Figure BSA00000865167200051
表2差异表达蛋白MALDI-TOF-MS鉴定阳性结果
Figure BSA00000865167200052
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (1)

1.一种利用双向电泳和MALDI-TOF-MS技术获得小麦根相关抗旱蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)材料处理：对春小麦品种青春38幼苗分别进行PEG6000干旱胁迫、复水作为处理，以相对应的正常供水作为对照，分别提取根蛋白质，进行双向电泳；
(2)双向电泳：将含样品蛋白质900μg水化液共350μl沿PROTAIN IEF Cell型电泳仪聚焦槽内连续加入；将17cm IPG胶条胶面朝下覆盖在样品上，被动吸收1h后，加2ml矿物油覆盖胶条；第二向SDS-PAGE用11％凝胶；凝胶染色采用胶体考马斯亮蓝染色法，其过程依次是：超纯水洗2次，每次10min；固定液固定2.5h；超纯水快速冲洗2次；染色液染色12.5h；脱色液脱色1h；超纯水水洗约4h，每30min换水一次，至斑点清晰为准；
(3)图谱分析：染色后的2-DE凝胶应用UMAX PowerLook2100XL型光密度扫描仪透射扫描获取图像，分辨率设为600dpi，在PDQuest2DE8.0.1分析软件的辅助下，定义蛋白质点的大小、强弱，检测和统计蛋白质点数目，计算蛋白质点的分子量和等电点，选取表达水平相差2倍以上的差异蛋白质点进行质谱分析；
(4)MALDI-TOF-MS：差异蛋白质点经胶内酶解后，用ultraflex TOF/TOF进行MALDI-TOF肽质谱指纹图分析，所得PMF数据通过Mascot软件检索蛋白质数据库进行鉴定。
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