CN105823767B - 一种评价海带高温耐受性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种评价海带高温耐受性的方法，属于海洋生物技术领域，它包括对正常培养的待评价海带材料进行一定时间的高温胁迫，然后测定其Fv/Fm值，如果其Fv/Fm值小于海带群体Fv/Fm值的第一四分位数，则判断被评价对象的高温耐受性较差；如果其Fv/Fm值大于海带群体Fv/Fm值的第三四分位数，则判断被评价对象的高温耐受性较强。本发明依据的原理是Fv/Fm可以间接反映海带材料潜在的最大光合作用能力，当海带材料受到胁迫时，该值会显著下降。本发明技术测定时不伤害植物组织，测定指标准确、指示灵敏，应用本发明所述评价方法可以提高海带高温耐受性评价的准确性和高效性，解决了海带高温耐受性评价困难的问题。

Description

一种评价海带高温耐受性的方法
技术领域
本发明属于海洋生物技术领域，具体地涉及一种评价海带高温耐受性的方法。
背景技术
海带是一种重要的大型经济海藻，在食品、饲料、化工、医药等领域具有广泛的用途，例如海带可以加工为各种风味的食品，可以作为鲍鱼、海参等水产养殖动物的饵料，也可以作为提取碘、褐藻胶、甘露醇等的原材料，还对甲状腺肿大等疾病具有预防作用。海带养殖业经过几十年的发展，已成为我国海洋产业的重要组成部分，具有重要的经济价值和生态价值，近年来养殖面积约4公顷，养殖产量约80-100万吨干品，产量、规模位居世界第一。海带是一种冷水性海藻，可能起源于日本的北海道海域，被从冷温带引种到我国的温带甚至亚热带海域进行养殖后，常常受到高温的胁迫。高温胁迫会对海带的正常生长、发育和繁殖造成严重的不良影响，增加病害风险，降低海带的产量和质量。因此，研究并提高海带的高温耐性对海带产业的健康发展具有重要意义。
准确、高效地评价海带高温耐受性，是研究和提高海带高温耐性的基础和前提。海带的高温耐受性是一个复杂的数量性状，表型受到基因型和环境的双重影响。前期的研究表明，在个体水平上海带在不同的发育阶段、不同世代具有不同的高温耐受性，在群体水平上不同地理群体/品系/品种也具有不同的高温耐受性。海带高温耐受性的多变性增加了对其评价的难度，目前尚无有高效、准确评价海带高温耐受性的方法。目前对海带高温耐受性的评价，通常是观察海带孢子体在高温养殖环境下的腐烂情况，认为那些在高温环境下孢子体腐烂程度较轻的个体具有较强的高温耐受性。这种肉眼观察的评价方法，往往受主观因素影响，准确性不高。另外，对于海带其它发育阶段，如配子体阶段，目前尚无广泛接受和认可的高温耐受性评价方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种评价海带高温耐受性的方法。
该方法基于测量叶绿素荧光参数Fv/Fm值，不仅可以解决当前评价海带孢子体高温耐受性惯用方法的不准确性，也可以为海带配子体高温耐受性的评价提供一种有效方法。
本发明采用下述技术方案予以实现：
一种评价海带高温耐受性的方法，它包括对正常培养的待评价海带材料进行一定时间的高温胁迫，然后测定其Fv/Fm值，如果其Fv/Fm值小于海带群体Fv/Fm值的第一四分位数，则判断被评价对象的高温耐受性较差；如果其Fv/Fm值大于海带群体Fv/Fm值的第三四分位数，则判断被评价对象的高温耐受性较强。
本发明还提供一种评价海带高温耐受性的具体方法，包括海带材料的培养、海带材料的高温胁迫、海带材料叶绿素荧光参数的测定和海带材料的耐高温性评价，步骤如下：
1)海带材料的培养选取健康的海带材料，调控光照、温度和营养盐浓度，使得海带处于最佳的生理状态；
进一步，步骤1)的海带材料具体培养条件为：光照设置为30-50μmol photons/(m2·s)，温度设置为13℃，营养盐设置为NaNO3：3ppm，KH2PO4：0.3ppm，光周期设置为L：D＝10:14，充气悬浮培养。
进一步，步骤1)所述的海带材料为海带孢子体或配子体克隆系。
2)海带材料的高温胁迫采用步骤1)中所述的培养条件，仅提高温度至25℃，对海带材料继续培养36h；
3)海带材料叶绿素荧光参数的测定胁迫36h后的海带材料在其培养条件下黑暗适应10min后迅速测定其Fv/Fm值；
4)海带材料的耐高温性评价
对高温耐受性迥异的海带材料进行25℃高温胁迫36h，然后测定其叶绿素荧光参数Fv/Fm值，并计算得出四分位数。如果被评价海带材料的Fv/Fm值小于第一四分位数，则判断被评价材料的高温耐受性较差；如果被评价材料的Fv/Fm值大于第三四分位数，则判断被评价材料的高温耐受性较强。
进一步，步骤4)所述的对高温耐受性迥异的海带材料包括海带属的不同物种、野生海带的不同地理种群、养殖海带的不同品种/品系。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明不仅可以评价海带材料的高温耐受性，还可对其光合作用能力进行高效的评价，不受时间限制，可实现海带整个发育过程中各阶段的温度耐受性的评价；而且应用本发明所述鉴定方法可以提高海带高温耐受性评价的准确度和效率，也可以为海带配子体高温耐受性的评价提供一种有效方法，解决了海带高温耐受性评价困难的问题。
附图说明
图1是本发明中海带幼孢子体高温胁迫后的形态图。
图2海带幼孢子体叶绿素荧光参数Fv/Fm在25℃高温胁迫下的变化趋势。
图3是高温耐受性迥异的海带材料(包括海带属的不同物种、野生海带的不同地理种群、养殖海带的不同品种/品系)经25℃高温胁迫36h后叶绿素荧光参数Fv/Fm的盒形图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
实施例1海带耐高温评价标准的建立
本发明的核心是建立评价海带耐高温性的标准，其原理是利用高温胁迫下海带叶绿素荧光参数Fv/Fm值来反映海带对高温的耐受性。通常而言，高温胁迫会对海带造成多方面的影响，包括从个体层面上的生长缓慢、到生理层面的光合作用效率降低、再到分子层面的基因表达调控等等。实验表明叶绿素荧光参数Fv/Fm作为反映藻体光合作用能力的参数，对高温胁迫敏感，其数值变化能反应出高温胁迫对海带的伤害程度。如图1所示，从图1中可以明显看出海带幼孢子体高温条件下培养36h，藻体色素变淡，局部变绿，藻体软化。如附图2，在高温胁迫下随着时间的延长，海带幼孢子体Fv/Fm呈现下降趋势，胁迫前Fv/Fm最大值为0.7，胁迫36h后下降17％，且下降缓慢。36h至72h下降较快，72h降至最低，低于0.1，此时藻体基本死亡。因此，可以判定36h可作为25℃高温胁迫的半致死时间。那么通过比较不同海带材料在半致死时间时的Fv/Fm值，即可判断不同海带材料的高温耐受性。
本实施例从海带种质库中选取20份材料，包括新近培育的耐高温品种“黄官1号”，它被认为是当前最耐高温的海带；也包括来自日本北海道的野生海带群体，它们的高温耐受性显著低于养殖海带，被认为是不耐高温的海带材料。这些海带材料的高温耐受性差异较大，基本覆盖了海带高温耐受性的变化幅度。在25℃下对它们进行高温胁迫36h，然后测定其叶绿素荧光参数Fv/Fm值，结果如附表1。从表中可看出，海带配子体Fv/Fm值变化范围为0.166～0.524，海带配子体Fv/Fm值变化范围为0.237～0.563。
附表1不同海带材料受25℃高温胁迫36h后的叶绿素荧光参数Fv/Fm
Fv/Fm值 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 样品6 样品7 样品8 样品9 样品10
海带配子体 0.166 0.230 0.239 0.239 0.332 0.342 0.374 0.402 0.417 0.424
海带孢子体 0.237 0.253 0.261 0.282 0.293 0.337 0.355 0.426 0.431 0.441
Fv/Fm值 样品11 样品12 样品13 样品14 样品15 样品16 样品17 样品18 样品19 样品20
海带配子体 0.435 0.440 0.459 0.467 0.484 0.488 0.503 0.516 0.520 0.524
海带孢子体 0.455 0.487 0.501 0.512 0.518 0.526 0.529 0.531 0.561 0.563
根据上表，我们分别计算得出海带孢子体和配子体受25℃高温胁迫36h后Fv/Fm值的四分位数(如附图3)，从图中可以看出海带孢子体Fv/Fm的第一、第三分位数分别为0.315、0.522，海带配子体Fv/Fm的第一、第三分位数分别为0.337、0.486。总体而言，耐高温的养殖品系具有较高的Fv/Fm值，大于第三四分位数，而野生的海带具有较低的Fv/Fm值，小于第一四分位数。对于待评价的海带材料，在25℃下进行高温胁迫36h，然后测定其叶绿素荧光参数Fv/Fm值，如果被评价海带材料的Fv/Fm值小于第一四分位数，则判断被评价材料的高温耐受性较差；如果被评价材料的Fv/Fm值大于第三四分位数，则判断被评价材料的高温耐受性较强。
实施例2
一种评价海带高温耐受性的具体方法，具体步骤如下：
1、海带幼孢子体材料的培养
以南方海带养殖品种“黄官2号”为材料，尽量挑选大小均匀、健康的幼孢子体，在以下培养条件下培3天：光照设置为30μmol photons/(m2·s)，温度设置为13℃，营养盐设置为NaNO3：3ppm，KH2PO4：0.3ppm，光周期设置为L：D＝10:14，充气悬浮培养。
2、海带幼孢子体材料的高温胁迫
因为海带光合作用受多种环境条件的影响，所以为了避免除温度外的其它因素对叶绿素荧光参数造成影响，故高温胁迫处理时仅提高温度至25℃，其他条件不变，对海带材料继续培养36h。
3、海带幼孢子体材料叶绿素荧光参数的测定
胁迫36h后的海带材料在其培养条件下黑暗适应10min后迅速测定其Fv/Fm值。测定Fv/Fm时需要提前将叶绿素荧光仪DUAL-PAM-100(WALZ，Germany)的数据线连接在电脑上，并打开相应的软件进行参数设置和仪器调零设置。打开软件在用户操作界面里设定测量参数，选择Settings选项，然后在Measure Mode中选Fluo，Analysis Mode中选SP-Analysis，Detector Type选择Detector2中的NC，Fluo中Gain选择5(Hight)，Damping中选1ms(Hight)；然后点击meas light选项，选择与培养条件一致的光强，其他条件选择默认值。然后点击save user setting，以便重复试验。点击mode界面的点击Fluo下方的zero Offset，当右侧的电压显示+0.00v时点击下方的Slow Kinetics，点击Manual下拉按钮选择Ind.Curve，选择表格横纵坐标上的Auto，使图案能全部显示在操作界面内。其他条件保持默认值。参数设置完毕后打开测试用的小盒子，待样品暗适应时间结束，迅速将海带幼孢子体(叶宽至少0.5cm)夹在装置中间，迅速盖上，点击电脑操作界面的start按钮，测试时间为5min。测完后迅速将海带幼孢子体放回继续培养，同时将装置盖上并保存数据。
4、海带材料的耐高温性评价
根据步骤3中测得“黄官2号”海带幼孢子体的Fv/Fm值为0.531，该值大于海带耐高温评价标准中海带群体Fv/Fm值的第三四分位数(0.522)，表明“黄官2号”的高温耐受性较强，这与实际生产中“黄官2号”所表现出的较强的高温耐受性相一致，也证明了本发明的有效性。
实施例3
一种评价海带高温耐受性的具体方法，具体步骤如下：
1、海带配子体材料的培养
当前，配子体克隆系是海带种质材料保存的主要方式。对海带配子体克隆系高温耐受性的评价，对培育耐高温新品种具有重要意义。本发明也可高效应用于海带配子体克隆系的高温耐受性评价。取适量低温、弱光保存的、来自日本北海道的野生海带配子体克隆系，按照以下条件进行扩大培养：光照设置为30μmol photons/(m2·s)，温度设置为13℃，营养盐设置为NaNO3：3ppm，KH2PO4：0.3ppm，光周期设置为L：D＝10:14，充气悬浮培养。
2、海带配子体材料的高温胁迫
因为海带光合作用受多种环境条件的影响，所以为了避免除温度外的其它因素对叶绿素荧光参数造成影响，故高温胁迫处理时仅提高温度至25℃，其他条件不变，对海带配子体材料继续培养36h。
3、海带材料叶绿素荧光参数的测定
取适量胁迫36h后的海带配子体材料在其培养条件下黑暗适应10min后迅速测定其Fv/Fm值。测定Fv/Fm时需要提前将叶绿素荧光仪DUAL-PAM-100(WALZ，Germany)的数据线连接在电脑上，并打开相应的软件进行参数设置和仪器调零设置。打开软件在用户操作界面里设定测量参数，选择Settings选项，然后在Measure Mode中选Fluo，Analysis Mode中选SP-Analysis，Detector Type选择Detector 2中的NC，Fluo中Gain选择5(Hight)，Damping中选1ms(Hight)；然后点击meas light选项，选择与培养条件一致的光强，其他条件选择默认值。然后点击save user setting，以便重复试验。点击mode界面的点击Fluo下方的zero Offset，当右侧的电压显示+0.00v时点击下方的Slow Kinetics，点击Manual下拉按钮选择Ind.Curve，选择表格横纵坐标上的Auto，使图案能全部显示在操作界面内。其他条件保持默认值。参数设置完毕后打开测试用的小盒子，待样品暗适应时间结束，迅速将海带配子体(直径约为0.5-1.0cm的配子体球)夹在装置中间，迅速盖上，点击电脑操作界面的start按钮，测试时间为5min。测完后迅速将海带配子体放回继续培养，同时将装置盖上并保存数据
4、海带材料的耐高温性评价
步骤3中测得野生海带配子体克隆系Fv/Fm值为0.299，小于海带耐高温评价标准中海带群体Fv/Fm值的第一四分位数(0.337)，表明野生海带的高温耐受性较弱。

Claims (5)

1.一种评价海带高温耐受性的方法，其特征在于它包括对正常培养的待评价海带材料进行一定时间的高温胁迫，然后测定其Fv/Fm值，如果其Fv/Fm值小于海带群体Fv/Fm值的第一四分位数，则判断被评价对象的高温耐受性较差；如果其Fv/Fm值大于海带群体Fv/Fm值的第三四分位数，则判断被评价对象的高温耐受性较强；海带孢子体Fv/Fm的第一四分位数、第三四数分位数分别为0.315、0.522，海带配子体Fv/Fm的第一四分位数、第三四分位数分别为0.337、0.486。
2.根据权利要求1所述的一种评价海带高温耐受性的方法，其特征在于所述方法包括海带材料的培养、海带材料的高温胁迫、海带材料叶绿素荧光参数的测定和海带材料的耐高温性评价，具体步骤如下：
1）海带材料的培养 选取健康的海带材料，调控光照、温度和营养盐浓度，使得海带处于最佳的生理状态；
2）海带材料的高温胁迫 采用步骤1）中所述的培养条件，仅提高温度至25℃，对海带材料继续培养36 h；
3）海带材料叶绿素荧光参数的测定 胁迫36h后的海带材料在其培养条件下黑暗适应10min后迅速测定其Fv/Fm值；
4）海带材料的耐高温性评价
对高温耐受性迥异的海带材料进行25℃高温胁迫36h，然后测定其叶绿素荧光参数Fv/Fm值，并计算得出四分位数；如果被评价海带材料的Fv/Fm值小于第一四分位数，则判断被评价材料的高温耐受性较差；如果被评价材料的Fv/Fm值大于第三四分位数，则判断被评价材料的高温耐受性较强。
3.根据权利要求2所述的一种评价海带高温耐受性的方法，其特征在于步骤1）的海带材料具体培养条件为：光照设置为30-50 μmol photons/(m2·s)，温度设置为13℃，营养盐设置为NaNO3：3ppm，KH2PO4：0.3ppm，光周期设置为L：D=10:14，充气悬浮培养。
4.根据权利要求2所述的一种评价海带高温耐受性的方法，其特征在于步骤1）所述的海带材料为海带孢子体或配子体克隆系。
5.根据权利要求2所述的一种评价海带高温耐受性的方法，其特征在于步骤4）所述的高温耐受性迥异的海带材料包括海带属的不同物种、野生海带的不同地理种群、养殖海带的不同品种/品系。
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