CN112577934B - 一种基于叶绿素荧光图像分析的灌浆期耐热油菜筛选方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于叶绿素荧光图像分析的灌浆期耐热油菜筛选方法。本发明包括油菜角果采集、油菜角果处理、角果处理环境设置及叶绿素荧光图像采集和叶绿素荧光参数测定等步骤，筛选出RFv/Fm较小的油菜植株为灌浆期高温耐受性较强的油菜，本发明筛选所需灌浆期种子量少，每个油菜材料最少用2个角果即可，对油菜植株的生长和品质性状影响均很小，并可在完全相同的条件下同时测量多个样品，操作过程快捷、结果重复性好、鉴定效率高、省时省能耗。在灌浆期耐热油菜品种选育、基因型筛选和突变株筛选等领域均有广泛的应用前景，特别适用于灌浆期耐热油菜的早期筛选。本方法为油菜种子灌浆期高温耐受性遗传改良提供技术基础。
Description
技术领域
本发明属于油菜育种及评价技术领域，特别涉及一种基于叶绿素荧光技术筛选种子灌浆期耐高温油菜筛选鉴定方法，尤其是涉及一种应用叶绿素荧光图像分析技术考察油菜发育期种子的叶绿素荧光参数从而筛选出灌浆期耐热油菜品种的方法。
背景技术
油菜是世界主要油料作物，菜籽油是国产食用植物油的第一大来源，在国民经济和人民生活中占有重要地位。培育高产、稳产、高含油量油菜品种是稳定油菜产能、确保食用油供给安全最重要的途径之一。种子是作物产量构成的重要器官；种子发育进程是作物产量和品质形成的关键过程，影响这一过程的遗传和外界环境因子会直接或间接的影响油料作物的产量和油脂等贮藏物质含量(Wu X,Liu Z,Hu Z and Huang R.BnWRI1Coordinates Fatty Acid Biosynthesis and Photosynthesis Pathways during OilAccumulation in Rapeseed.J.Integr.Plant Biol.2014,56(6):582-593.)。在胁迫因子中，高温热害严重影响油菜生长发育过程并降低最终产量与品质，特别是在灌浆期，温度对油菜含油量和产量的影响都达到显著水平(刘智宏，吴学龙，黄锐之。高温胁迫影响油菜籽粒产量、含油量研究进展。农业科学,2018,8(7):684-689.)。
长江流域冬油菜区是我国最大的油菜产区和世界上规模最大的油菜生产带，每年油菜种植面积与总产量分别占全国的80％以上和世界的1/4左右(殷艳，王汉中。我国油菜产业发展成就、问题与科技对策。中国农业科技导报，2012，14(4):1－7.)，但该区域在油菜成熟期气温回升快，造成油菜“高温逼熟”、油菜含油量下降，在全球气候变暖的大背景下，高温等极端气候现象的发生呈现增多加重的趋势。然而目前仅少数油菜品种受高温胁迫影响较小，含油量可稳定在42％以上。培育、筛选出更多在高温胁迫下产量品质稳定的油菜材料、提高油菜品种耐热性，对改善我国油菜品质、保障全球气候变暖下的食用油供给安全具有重大意义(伊淑丽,亓浩。在高温胁迫下品质稳定型和敏感型甘蓝型油菜的筛选及其品质动态变化过程的研究。陕西农业科学,2015,61(12):31-33.)。
建立高效、可靠的油菜灌浆期耐热性筛选鉴定技术是快速准确地鉴定和筛选油菜耐热材料、挖掘油菜耐热基因型、提高耐热油菜育种效率的基础。然而迄今为止，尚未建立简便、快捷、稳定的的油菜灌浆期耐热性大规模筛选鉴定技术。
光合作用是植物物质转化和能量代谢的关键，也是植物对高温最为敏感的生理过程之一，光合作用受抑制早于其它胁迫特征的出现,导致同化产物供应不足,是高温胁迫引起籽粒充实不良、产量下降等现象的重要原因(Barnabas B,Gager K,Feher A.The effectof drought and heat stress on reproductive processes in cereals.Plant CellEnviron,2008,31:11–38)。许多研究表明,高温对植物光合机能破坏的关键部位是位于叶绿体类囊体膜上的光系统II(PSII)反应中心,高温等逆境可损伤叶片光合膜，特别是PSⅡ的结构和功能，降低PSⅡ光能转换效率(杨卫丽，黄福灯，曹珍珍，雷炳婷，胡东维，程方民。高温胁迫对水稻光合PSII系统伤害及其与叶绿体D1蛋白间关系。作物学报，2013,39(6):1060-1068.)。
叶绿素含量及叶绿素荧光动力学参数能够灵敏反映光合作用的变化情况,被视为揭示植物生理状态及其与环境关系的光系统探针，通过研究叶绿素荧光来间接研究光合作用的变化具有快速、灵敏和非破坏性测量等优点,逐渐成为农业领域的一项热门技术,在植物光合作用、抗逆生理、作物栽培育种等领域中得到广泛应用。新型调制叶绿素荧光成像系统由于可测定快速光响应曲线(120s内完成，比光合放氧和气体交换等技术快得多)、进行叶片光合作用的横向异质性检测、在完全相同的条件下同时测量多个样品，更是成为遗传育种、突变株筛选的强大工具(Rousseau C1,Belin E,Bove E,Rousseau D,Fabre F,Berruyer R,Guillaumès J,Manceau C,Jacques MA,Boureau T.High throughputquantitative phenotyping of plant resistance using chlorophyll fluorescenceimage analysis.Plant Methods.2013,9(1):17.)。但迄今为止，叶绿素荧光技术在作物抗逆性筛选鉴定上的应用均是针对叶片这样典型的光合器官(黄纯倩,朱晓义,张亮,孙兴超,华玮。干旱和高温对油菜叶片光合作用和叶绿素荧光特性的影响。中国油料作物学报,2017,39(3):342-350.)，直接以灌浆期种子为研究对象的尚不多见。由于植物营养生长期的耐热性并不一定与生殖生长期耐热性一致，对油菜种子应答高温胁迫的转录谱分析也显示其存在不同于营养生长期的独特的表达调控途径(Huang RZ Liu ZH,Xing MQ,Yang Y,Wu XL,Liu HQ,Liang WF.Heat Stress Suppresses Brassica napus Seed OilAccumulation by Inhibition of Photosynthesis and BnWRI1 Pathway,Plant CellPhysiol.2019,60(7):1457-1470.)，对油菜这样以收获种子为生产目标的作物，急需建立可以反映油菜灌浆期耐热性的高效、便捷、可重复的检测技术，以适应大量油菜材料灌浆期耐热性(特别是高温胁迫下种子含油量稳定性)的批量筛选，服务于耐热油菜的品种培育和种质资源挖掘。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的是提供一种基于叶绿素荧光图像分析的灌浆期耐热油菜筛选方法，具体步骤如下：
1.油菜材料：
可以是常规育种或转基因、分子编辑等途径获得的油菜育种资源、品系、品种等，也可以是其他农家品种、野生油菜。
2.方法：
2.1油菜种植
供试油菜种植可采用田间种植、盆栽种植等方法，各油菜材料按常规栽培技术进行管理，各供试油菜材料种植条件和采取的农事管理措施需保持一致。
2.2油菜角果采集
各供试油菜试验用植株，每个油菜材料最少可使用一株植株，如条件允许每个供试油菜可选择10株以上形态、长势一致的植株用于后续检测。
在油菜盛花期、晴好天气的某一天标记当天开花的花朵，以这一天作为开花后0天。在油菜种子油脂快速积累时期在标记花朵的植株上取由标记花朵生长而成的大小相似、带有角果柄的若干偶数个角果，每个供试油菜材料最少需采集2个角果；具体可采用开花后15～30天的角果，并以采用开花后20～25天的角果为佳。
2.3油菜角果处理
各油菜材料所取的角果分别混合、平均分为两组，以角果柄接触培养基的方式插入植物培养基，所述植物培育基可以是固体培养基也可以是液体培养基。将装有每个油菜材料角果的培养容器分别放入两个相同型号的植物生长箱或相同的生长室中，一组设为适温组，另一组设为高温组。
2.4角果处理环境设置
环境湿度50％～70％；每天光照时间不少于12小时，较佳的为每天光照时间14～16小时；适温组温度设置在15℃～25℃之间，光照时段的温度不低于黑暗时段；高温组的温度需始终不低于相应时间适温组的温度，并在光照时段进行35℃～42℃的高温处理，高温处理时间每天不少于5小时；各样品连续处理时间不超过3天，总高温处理时间不少于5小时，并以总高温处理时间不少于10小时为佳。
2.5叶绿素荧光图像采集和叶绿素荧光参数测定
叶绿素荧光图像采集和叶绿素荧光参数测定采用叶绿素荧光成像系统，所述叶绿素荧光成像系统需可检测PSⅡ最大光化学量子产量Fv/Fm。
温度处理结束后，从各培养角果中分离种子。分离出的种子在黑暗条件下放置>20min进行暗适应。将经暗适应的待检测种子放置在叶绿素荧光成像系统的载物台上，可将多个待检测油菜材料的种子同时放置在载物台上；为便于比较，可将同一油菜材料适温、高温组的种子相邻摆放。按仪器说明书所述规范运行叶绿素荧光成像系统，采集供试样品叶绿素荧光图像、测量叶绿素荧光参数，采集的参数中需包括Fv/Fm。在采集的图像中每一被检样品选择3个以上区域，分析选定区域的Fv/Fm，取平均值作为对应样品的叶绿素荧光参数Fv/Fm。
进一步的优化措施：对经温度处理、暗适应的供试油菜种子按上述方法重复进行2～3次的叶绿素荧光图像采集、叶绿素荧光参数测量，取同一材料多次测定的Fv/Fm平均值作为对应材料的Fv/Fm。
2.6耐高温油菜材料筛选：
计算各材料高温组种子较适温组种子叶绿素荧光参数Fv/Fm下降比率RFv/Fm(RFv/Fm为叶绿素荧光参数Fv/Fm较适温组种子Fv/Fm下降比率)；筛选出RFv/Fm较小的油菜材料(植株)为灌浆期高温耐受性较强的油菜，优选的RFv/Fm<5％的油菜材料(植株)为灌浆期耐热油菜。
进一步的，所述油菜角果离体高温处理样品种子Fv/Fm下降比率RFv/Fm的计算公式为：
其中，Fv/Fm(适温)为适温组种子Fv/Fm，Fv/Fm(高温)为高温组种子Fv/Fm。
与已有技术相比，本发明的有益技术效果：
本发明筛选所需灌浆期种子量少，每个油菜材料最少用2个角果即可，对油菜植株的生长和品质性状影响均很小。本方法可以用于对油菜单个植株灌浆期耐热性的筛选。本方法可在完全相同的条件下同时测量多个样品，操作过程快捷、结果重复性好、鉴定效率高、省时省能耗。本方法利用单年单点即可预测油菜材料灌浆期对环境高温的适应能力，可缩短育种年限，节省试验地的面积。本方法在灌浆期耐热油菜(特别是高温胁迫下种子含油量稳定型油菜)品种选育、基因型筛选和突变株筛选等领域均有广泛的应用前景，特别适用于灌浆期耐热油菜的早期筛选。
附图说明
图1本发明实施例的高温胁迫对油菜材料HS1～HS10灌浆期种子Fv/Fm的影响；
图2本发明实施例的高温胁迫后种子Fv/Fm下降比率与种子含油量下降比率显著正相关。
具体实施方式
以下结合附图说明对本发明的实施例作进一步详细描述，但本实施例并不用于限制本发明，凡是采用本发明的相似制备方法或相似变化的，均应列入本发明的保护范围。
一、油菜灌浆期整株高温处理筛选耐热油菜
采用29份环境敏感性差异显著的不同基因型油菜材料，依次编号为HS1-HS29。
由于油菜的经济价值主要是通过其种子中的油脂实现，为了验证对比本发明所述方法，本专利实施例分别采用整株高温处理和角果离体处理两种方法对这29份油菜材料进行灌浆期高温处理，测定油菜材料整株高温处理后种子含油量和灌浆期角果高温处理后种子Fv/Fm变化。
油菜材料HS1-HS29采用盆栽种植。各试验材料在相同条件下按油菜常规栽培管理技术进行。
在油菜灌浆期，每个材料取6株或6株以上偶数株形态、长势一致的植株，并平均分成适温组和高温组两组，利用人工气候室分别进行正常温度和高温处理，两人工气候室除温度之外的其他参数如面积、光照、湿度等均相同，光周期均设置为长日照。处理15～30天后所有材料从人工气候室移出，继续在常规条件下生长至各材料正常成熟，分别收获各处理材料成熟种子用于后续产量和种子含油量等性状分析。举例来说：
盆栽种植：将油菜材料HS1～HS29这29种入盆中，每盆1株，每1材料种植10株，按油菜栽培常规管理，每盆大小、盆中土质和土量、水肥条件、光照条件等均相同。
植株分组：在油菜灌浆期在HS1～HS29这29个材料每一材料分别选择6盆长势一致的植株用于后续试验。其中3盆放入正常温度(适温组)人工气候室，3盆放入高温处理(高温组)人工气候室，开始进行高温处理，共处理15天。
生长环境设置：人工气候室设置为湿度60％，光照强度300mE m±2s±1，14/10h日/夜周期，每天5：00～19：00设为白天。两个人工气候室夜间温度均设为18℃，适温组白天温度设为23℃。高温组设置为5：00～10：00从23℃逐渐升温至35℃，维持35℃高温4小时到14：00，14：00到19：00期间从35℃逐渐降温至23℃，然后迅速降温到18℃。
继续培植：在人工气候室生长15天后，将所有植株从人工气候室移出，在相同的常规条件下继续培植至各油菜植株正常成熟；
测量植株种子含油量：各油菜植株分单株收获种子，测量成熟种子含油量，种子含油量的测定采用近红外光谱法。植株高温处理对各油菜材料种子含油量的影响如表1所示；
由于油菜的经济价值主要通过其种子的油脂来实现，故在此我们采用各油菜材料灌浆期高温胁迫后种子含油量的下降比率来评价各材料灌浆期耐热性。如表1所示，与适温组的相应对照比较，各油菜材料经15天整株高温处理后的种子含油量均有所下降，但下降程度在材料之间差异显著，其中14份材料含油量较对照下降比率<5％,为含油量高温稳定型油菜材料。值得关注的是HS1、HS8、HS17、HS27这4份油菜材料高温胁迫后种子含油量下降比率均小于1％，HS27、HS28、HS29这3份油菜材料经15天高温处理后含油量仍高于51％，最高可达53.75％；这些油脂积累高温稳定型油菜材料可直接应用于耐热高含油量油菜品种培养。
二、基于叶绿素荧光图像分析筛选灌浆期耐热油菜
油菜种植：将供试油菜材料在田间种植，各试验材料在相同条件下按油菜栽培技术统一进行农事管理。
取角果：油菜植株到达盛花期时，每个油菜材料选择10株以上形态、长势一致的植株，在晴好天气标记同一天开花的花朵，在开花后20天(20DAP)从标记植株上取由标记花朵生长而成的大小相似、带有角果柄的若干偶数个角果。
角果处理：将每个油菜材料所取的角果混合后，平均分为两组，并将所有组角果分别以角果柄插入植物培养基，将装有每个油菜材料角果的培养容器分别放入两个相同型号的植物生长箱或相同的生长室中，一组设为适温组，另一组设为高温组。
角果处理环境设置：植物生长箱每天5：00～19：00设为白天，19：00～5：00设为夜间，环境湿度均为60％，夜间温度均设为18℃，适温组白天温度设为23℃，高温组5：00迅速升温至23℃，8:00升温至37℃，维持37℃高温7小时到15：00，然后迅速降温至23℃，到19：00开始夜间培养时迅速降温到18℃。
经处理的各油菜材料种子叶绿素荧光图像采集和叶绿素荧光参数测定：采用调制叶绿素荧光成像系统IMAGING-PAM进行种子叶绿素荧光分析。温度处理第二天15：00高温处理结束后，从各油菜样品角果中取出种子；取出的油菜种子在黑暗处放置>20min(暗适应)；将经暗适应的待检测种子放置在载物台上，每一待检测油菜材料所用种子不少于20粒。为便于比较，可将多个待检测油菜材料的种子同时放置在叶绿素荧光成像系统的载物台上，并将同一油菜材料适温组、高温组的种子相邻摆放。按仪器说明书所述规范运行叶绿素荧光成像系统，采集叶绿素荧光图像、测量叶绿素荧光参数，采集的参数中需包括PSⅡ的最大光化学量子产量Fv/Fm。
耐高温油菜材料筛选：
运行IMAGING-PAM程序，打开采集的Fv/Fm叶绿素荧光图像，高温胁迫对油菜材料HS1～HS10开花后20天种子Fv/Fm的影响见图2。由图2可知，
与相应适温生长种子相比，各油菜材料经高温胁迫后灌浆期种子的PSII反应中心的最大光量子产量Fv/Fm均显著下降，但不同油菜材料灌浆期种子Fv/Fm受影响程度存在明显差异。
在采集的叶绿素荧光图像中每一被检油菜材料种子选择3个以上区域(本实施例中每个供试材料选择5个区域)，分析选定区域的Fv/Fm，取平均值作为对应材料的叶绿素荧光参数Fv/Fm。按下述公式计算各材料高温组种子较适温组种子的Fv/Fm下降比率RFv/Fm，结果见表2。
其中，Fv/Fm(适温)为适温组种子Fv/Fm，Fv/Fm(高温)为高温组种子Fv/Fm。
如图1为高温胁迫对油菜材料HS1～HS10灌浆期种子Fv/Fm的影响。HS1-R～HS10-R所示为油菜材料HS1～HS10适温组Fv/Fm结果，HS1-H～HS10-H所示为油菜材料HS1～HS10高温组Fv/Fm结果。
如表2所示，高温胁迫使不同油菜材料种子Fv/Fm下降比率不同，RFv/Fm差异显著，说明各材料种子光合系统对高温胁迫反应的敏感性各异。相关分析(图2)表明，开花后20天角果高温处理的油菜种子RFv/Fm与经整株高温处理油菜成熟种子含油量下降比率显著正相关(R2＝0.8469)，且所有RFv/Fm<5％的油菜材料灌浆期整株高温胁迫后种子含油量的下降比率均小于3％，这些结果显示灌浆期(本实施例中为开花后20天)高温胁迫后油菜种子Fv/Fm下降比率RFv/Fm可以作为油菜灌浆期耐热性的筛选指标；筛选出Fv/Fm下降比率较小的油菜材料(植株)为灌浆期高温耐受性较强的油菜，优选的为RFv/Fm<5％的油菜材料(植株)可作为灌浆期耐热油菜。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。
Claims (9)
1.一种基于叶绿素荧光图像分析的灌浆期耐热油菜筛选方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)油菜角果的选取：将各待筛选的油菜在常规条件下种植；标记同一天开花的花朵；在油菜种子油脂快速积累时期取若干偶数个角果，每个油菜材料所取角果平均分为两组；
(2)油菜角果的再培养：并将所有组角果分别以角果柄插入植物培养基，各装有油菜角果的容器分别放入适温组和高温组植物生长箱或生长室中进行角果离体培养；角果离体培养环境设置；
(3)耐高温油菜的筛选：从各经一定时间温度处理的油菜角果样品中分离灌浆期种子；将分离出的种子进行暗适应；将待测种子置于叶绿素荧光成像系统的样品台，在同一界面下对多个适温组和高温组灌浆期种子进行叶绿素荧光图像采集和叶绿素荧光参数测定；计算对应高温组种子叶绿素荧光参数Fv/Fm(PSII反应中心的最大光量子产量)较适温组种子Fv/Fm下降比率RFv/Fm，筛选出RFv/Fm(RFv/Fm叶绿素荧光参数Fv/Fm较适温组种子Fv/Fm下降比率)较小的油菜植株为灌浆期高温耐受性较强的油菜；
所述下降比率RFv/Fm的计算公式为：
其中，Fv/Fm(适温)为适温组种子的Fv/Fm，Fv/Fm(高温)为高温组种子Fv/Fm。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述RFv/Fm<5％。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤(1)中标记同一天开花的花朵为在盛花期标记同一天开花的花朵；所述油菜种子油脂快速积累时期为开花后20～25天。
4.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤(2)中角果离体培养环境为：环境湿度50％～70％；每天光照时间不少于12小时。
5.根据权利要求4所述的筛选方法，其特征在于：所述每天光照时间为14～16小时。
6.根据权利要求4或5所述的筛选方法，其特征在于：所述适温组温度设置在15℃～25℃之间，光照时段的温度不低于黑暗时段；高温组的温度需始终不低于相应时间适温组的温度，并在光照时段进行35℃～42℃的高温处理，高温处理时间每天5～10小时，各样品连续处理时间不超过3天。
7.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述步骤(2)中的暗适应为在黑暗处放置20min以上。
8.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述叶绿素荧光图像采集和叶绿素荧光参数测定时每一被检样品选择3个及以上区域，分析选定区域的Fv/Fm，取平均值作为对应样品的叶绿素荧光参数Fv/Fm。
9.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于：所述角果叶绿素荧光图像采集和叶绿素荧光参数测定复进行2～3次，并将每次叶绿素荧光参数Fv/Fm测量值的平均值作为对应材料的Fv/Fm。
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