CN110907413A - 一种利用叶绿素荧光技术鉴定芥兰耐盐性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于叶绿素技术鉴定领域，具体涉及一种利用叶绿素荧光技术鉴定芥兰耐盐性的方法。包括以下步骤：1）芥兰材料准备：选择籽粒饱满的芥兰种子进行催芽，待种子露白后种植于穴盘中，待芥兰材料长成幼苗，将幼苗作为实验材料进行后续实验；2）盐胁迫诱导：收集健壮的芥兰植株进行盐胁迫处理，作为处理组，同时以进行盐胁迫处理为空白对照分；3）叶绿素荧光参数检测：用叶绿素荧光仪分别对处理组的盐胁迫处理1‑21d的芥兰植株及对照进行叶绿素荧光参数测定绿素荧光参数Fo、qP、NPQ、Fv/Fm和Y(II)来评估不同盐胁迫处理对芥兰叶绿素荧光参数变化的影响。本发明利用叶绿素荧光参数实现无损、快速的评估不同芥兰材料对盐胁迫的响应能力并鉴定其耐盐性。

Description

一种利用叶绿素荧光技术鉴定芥兰耐盐性的方法

技术领域

本发明属于叶绿素技术鉴定领域，具体涉及一种利用叶绿素荧光技术鉴定芥兰耐盐性的方法。

背景技术

芥兰(Brassica oleracea var. alboglabra Baily；Chinese kale)是十字花科芸薹属植物，是十字花科芸薹属、以花薹和嫩叶为食用器官的甘蓝类蔬菜，芥兰富含维生素C、多酚和芥子油苷等，具有很高的营养价值，其起源于中国南部，在广东、福建等地区被广泛栽培，且近年来，已被多地区引种栽培和扩大种植。

环境胁迫如低温、干旱、弱光、高盐等是影响植物生长的重要环境因子。植物在遭受不同的环境胁迫时会产生不同的防御或缓解措施，通过调节自身代谢及一系列生理生化反应来躲避或减少伤害从而适应外界环境。植物对胁迫的反应常表现在渗透调节物质积累（脯氨酸、可溶性糖），内源激素的变化，自由基平衡，pH调节，气孔调节、生物膜结构变化等。因此研究和探测各种逆境对植物光合生理的影响十分必要。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中所述的缺陷，从而提供一种利用叶绿素荧光技术鉴定芥兰耐盐性的方法，本发明利用叶绿素荧光参数实现无损、快速的评估不同芥兰材料对盐胁迫的响应能力并鉴定其耐盐性。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种利用叶绿素荧光技术鉴定芥兰耐盐性的方法，包括以下步骤：

1）芥兰材料准备：选择籽粒饱满的芥兰种子进行催芽，待种子露白后种植于穴盘中，待芥兰材料长成幼苗，将幼苗作为实验材料进行后续实验；

2）盐胁迫诱导：收集健壮的芥兰植株进行盐胁迫处理，作为处理组，同时以进行盐胁迫处理为空白对照分；

3）叶绿素荧光参数检测：用叶绿素荧光仪分别对处理组的盐胁迫处理1-21d的芥兰植株及对照进行叶绿素荧光参数测定绿素荧光参数Fo、qP、NPQ、Fv/Fm和Y(II)来评估不同盐胁迫处理对芥兰叶绿素荧光参数变化的影响；其中，所述Fo为初始荧光，所述qP为光化学淬灭系数，所述NPQ为非光化学淬灭系数，所述Fv/Fm最大光化学产量，所述Y(II)为实际光化学产量值。

优选地，所述步骤1）中芥兰为中花芥兰、黄花芥兰和红脚芥兰中的一种及一种以上。

优选地，所述步骤1）中幼苗的苗龄为40 天。

优选地，所述步骤2）盐胁迫处理所用溶液为200 mM NaCI。

优选地，所述步骤3）叶绿素荧光参数检测的具体步骤如下：

第一步，将待测材料放入封闭黑暗的纸箱中，叶夹上下两部分打开夹住待测叶片，暗适应20 min，记录开始测量的时间，数据采样时间为5 min，测一株整个时间为25 min，结束后取出纸箱里的测完材料放入待测材料，关闭纸箱保持黑暗环境20 min后直接开始测量，并记录时间，重复此步骤测量接下来的材料；

第二步，提供一个直径为1厘米圆形测量面，并确保光纤尖端与测量区域之间的标准距离为8 mm，光纤与测量平面呈60°角；最后读取数据，读取参数涉及：（1）固定荧光Fo：当光系统Ⅱ反应中心都处于开放状态时的最小荧光值；（2）最大荧光产量Fm：暗适应后执行饱和脉冲当光系统Ⅱ反应中心都处于关闭状态时的最大荧光产量；（3）光下最小荧光值Fo'；（4）光下最大荧光Fm'：光下执行饱和脉冲当光系统Ⅱ反应中心都处于关闭状态时的最大荧光产量；（5）F：饱和脉冲之前测得的光照样品的瞬时荧光水平（Ft）（6）沼泽模型qP和湖泊模型qL：光化学淬灭系数；（7）qN和NPQ：非光化学淬灭的量子产量；（8）相对电子传递速率ETR；（9）实际光合量子产量Y(II)。根据植物光化学生理特征及植物逆境生理常用叶绿素荧光参数，分别选取具有代表性的5个叶绿素荧光参数：Fo（初始荧光），qP（光化学淬灭系数），NPQ（非光化学淬灭系数），Fv/Fm（最大光化学产量），Y(II)（实际光化学产量）值，来评估不同盐处理对芥兰叶绿素荧光参数变化的影响。

使用叶绿素荧光仪测定时，经过充分暗适应的叶片叶绿素光系统II（PSII）处于完全开放状态，当有测量光照射叶片时，叶绿素发出初始荧光(Fo)，它仅与叶片叶绿素浓度有关。当打开饱和脉冲光时，PSII电子链上的电子由于饱和脉冲的强光照射而迅速堆积，产生最大荧光(Fm)，表示PSII接受光量子的最大能力。Fm与Fo的差值为Fv。Fv表示进行光合作用的最大能力，因此，Fv/Fm称为PSII的最大量子效率。当打开光化光时，叶绿素荧光会产生一个波动，然后维持一个平稳的荧光F。然后打一个饱和脉冲光，电子链再次堆积，则产生荧光Fm'。Fm'超出F的部分代表了正在进行的光合作用的光量子的量。而实际光化学量子产量Y(II)=(Fm'−F)/Fm'，也称为PSII的光合量子产额。当关闭光化光后只有测量光照射时，叶绿素发出荧光Fo'。qP=(Fm'−F)/(Fm'−Fo')称为光化学淬灭系数，它表示光化光下因光合作用而使叶绿素少生产荧光的程度。可以看出，Fm'低于Fm，这部分为以热耗散的方式释放，为非光化学淬灭即NPQ和qN。Fo叫做初始荧光也叫作最小变荧光强度，表示已经暗适应的光合PSII中心全部开放时的荧光强度。Fo的升高一般认为是PSII中心受到伤害或不可逆失活，变化越大遭到的破环越大，抗性越差；而其降低是PSII中心受到抑制，非化学能量耗散增加造成，热耗散增加，减少了对PSII中心的损伤，表现较强的抗逆能力。Fv/Fm的下降代表环境胁迫导致PSII的损伤，高等植物生长在最适宜环境下Fv/Fm最大为0.84。一般植物生长环境达不到最适宜水平，均低于此值，在0.8左右。Fv/Fm值较稳定，只有环境胁迫达到一定程度，使PSII受损时才下降。所以，Fv/Fm可以用于确定幼苗叶片受损的指标。Y(II)是PSII实际量子产量ΔF/Fm'，对逆境胁迫的敏感性要高于Fv/Fm。即受环境胁迫时较早开始下降，下降越小抗逆性越好。但它与Fv/Fm不同，它仅表示叶绿素光合作用产率的下降，并不是光系统受损。非光化学猝灭（NPQ）为调节性能量耗散，反映PSII将过量的光能不能用于光合电子传递而以热的形势耗散掉的光能部分。这是植物的一种自我保护机制，其数值的变化反映了植物对光合器官的保护作用。光化学猝灭（qP），反映的是PSII天然色素吸收的光能用于光化学电子传递的份额，光化学猝灭又在一定程度上反映PSII反映中心开放程度高低，qP越小，PSII的电子传递效率和反应活性越小。植物抗逆境能力越大，qP下降变化越小。因此，选用Fo，Fv/Fm，Y(II) ，qP，NPQ作为衡量植物耐逆能力的重要参考指标。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1. 本发明通过研究不同盐处理及不同处理时间下芥兰叶片的绿素荧光参数：Fo，qP，NPQ，Fv/Fm，Y(II)的差异性，能够准确反映盐胁迫对光合作用的影响，从而提供了一种利用叶绿素荧光技术快速鉴定耐盐性芥兰的技术。

2. 本发明可以实现无损、快速的评估不同芥兰材料对盐胁迫的响应能力并鉴定其耐盐性。

附图说明

图1是实施例1CK1叶片叶绿素荧光参数变化：图A-E分别表示Fo，Fv/Fm，Y(II)，qP，NPQ数值；

图2是实施例2CK2叶片叶绿素荧光参数变化：图A-E分别表示Fo，Fv/Fm，Y(II)，qP，NPQ数值；

图3是实施例3CK3叶片叶绿素荧光参数变化：图A-E分别表示Fo，Fv/Fm，Y(II)，qP，NPQ数值。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

盐胁迫下芥兰CK1（中花芥兰）的叶绿素荧光参数测定

（1）芥兰CK1盐处理

试验于拟于2019年3月至2019年12月在江苏省农业科学院蔬菜研究所进行。选择CK1籽粒饱满的种子进行催芽，待种子露白后种植于穴盘中，选株型大小一致、健壮的40 d苗龄芥兰幼苗进行200 mM NaCI盐胁迫处理，以不含NaCI的处理为空白对照（即NaCl浓度为0 mM）。设对照组和处理组，3个重复。

（2）叶绿素荧光参数测定

选取CK1植株完全展开的叶片，用便携式调制叶绿素荧光仪（MINI-PAM-II）分别对盐处理植株1、3、5、7、14、21 d及对照进行叶绿素荧光参数测定。首先将MINI-PAM叶夹上下两部分打开夹住叶片，暗处理20 min，在室温下（25 ℃左右），读取Fo，qP，NPQ，Fv/Fm，Y(II)值，来研究不同处理对芥兰叶绿素荧光参数的影响。每个指标测定重复3次，取平均值。

（3）盐处理下CK1（中花芥兰）叶片叶绿素荧光参数变化

如图1-A所示，盐胁迫处理下，CK1在1-21 d的Fo变化范围为180~250。初始荧光（Fo）先下降，PSII中心受到抑制，热耗散增加，减少了对PSII中心的损伤，CK1表现出较好的抗盐能力；然后快速上升到250，而后又下降到207，短暂的上升说明PSII中心遭到轻微的破坏，但很快就下降了，且处理组Fo数值普遍低于对照组，第7天时差距最大，说明盐胁迫下CK1抗性较好。

如图1-B所示，盐处理下CK1在1-21 d的Fv/Fm的变化范围为0.75~0.83。CK1先轻微下降了0.07后上升，且在0.8处保持稳定，与对照组变化趋势相似。一般高等植物在最适宜条件下Fv/Fm最高为0.84，受到环境胁迫时低于0.8，表Fv/Fm在胁迫下第一次降低，说明在经受盐胁迫时，植物可以作出一定的适应性调节反应，植物叶片内并没有发生光抑制，但随着盐处理时间延长，Fv/Fm值总体上升并稳定在0.8附近，说明盐胁迫诱导光化学活性提高，证明CK1抗性较好。

如图1-C所示，盐处理下CK1在1-21 d的Y(II)变化范围为0.15~0.3。Y(II)在环境胁迫条件下较早开始下降，下降越小表明抗逆性越好，而CK1的PSII的光化学效率呈波动性下降，14天达到最低小于0.15，但随后又上升到0.2以上。说明盐处理对CK1光合作用有一定影响，但CK1还是具有较好抗性。

如图1-D、E所示，盐胁迫处理下，CK1在1-21 d的qP变化范围为0.25~0.5，总体呈下降趋势，在14天达到最低0.3，但随后又上升到0.4，植物qP下降变化越小抗逆性越好，说明PSII反应中心开放成度和电子传递活性下降后又上升，说明盐处理对CK1影响不大。而非光化学猝灭（NPQ）1-21 d处理组的变化范围为0.6~1.4，在第5天突然下降到0.7，随后又上升到1.4保持稳定，且处理组5天以后高于对照组并随着处理时间延长差距也在扩大，说明CK1叶片内有越来越多的光能通过非光化学的途径被耗散，用于光合作用的能量减少，植物进行自我保护，表明CK1抗性好。

实施例2

盐胁迫下芥兰CK2（黄花芥兰）的叶绿素荧光参数测定

（1）芥兰CK2盐处理

与实施例1中CK1处理方法一致。

（2）叶绿素荧光参数测定

与实施例1中叶绿素荧光参数测定方法一致

（3）盐处理下CK2（黄花芥兰）叶片叶绿素荧光参数变化

如图2-A所示，盐胁迫处理下，CK2在1-14 d的Fo变化范围为180~210。初始荧光（Fo）呈波动性下降，热耗散增加，减少了对PSII中心的损伤，CK2抗性较好。

如图2-B所示，盐处理下，CK2在1-14 d的Fv/Fm变化范围为0.8~0.83，大于0.8，说明CK2抗性较好。

如图2-C所示，盐处理下，CK2在1-14 d的Y(II)变化范围为0.16~0.3。PSII的光化学效率呈下降趋势，且普遍低于对照组，在第14天达到最低小于0.2，与对照组差距最大。说明盐胁迫可能造成PSII反应中心部分关闭或受损，实际光合效率一般，盐处理对CK2光合作用有较大影响。

如图2-D、E所示，盐处理下，CK2在1-14 d的PSII变化范围为0.25~0.5，处理组光化学猝灭（qP）呈波动性下降，第14天达到最低0.25。非光化学猝灭（NPQ）的处理组变化范围为1~1.4，呈先上升后下降趋势，到第5天最高为1.4而后下降趋势稳定在1，第14天CK2处理组NPQ低于对照组，说明5天内CK2叶片内有越来越多的光能通过非光化学的途径被耗散，5天后自我保护能力下降。

实施例3

盐胁迫下芥兰CK3（红脚芥兰）的叶绿素荧光参数测定

（1）芥兰CK3盐处理

与实施例1中CK1处理方法一致。

（2）叶绿素荧光参数测定

与实施例1中叶绿素荧光参数测定方法一致

（4）盐处理下CK3（红脚芥兰）叶片叶绿素荧光参数变化

如图3-A所示，盐胁迫处理下，CK3在1-21 d的Fo变化范围为185~205，初始荧光（Fo）波动较小，且小于CK1和CK2，Fo降低是PSII中心受到抑制，热耗散能量增加，是植物自我保护的表现，说明CK3抗性较好。

如图3-B所示，盐处理下，CK3在1-21 d的Fv/Fm变化范围为0.8~0.82，大于0.8，说明CK3抗性较好。

如图3-C所示，盐处理下，CK3在1-21 d的Y(II)变化范围为0.18~0.35，PSII的光化学效率先快速下降到0.2后保持稳定，在第21天后达到最低0.18，CK2在14天达到最低0.16，说明CK3与CK1抗性较CK2好。

如图3-D、E所示，盐处理下，CK3在1-21 d的qP变化范围为0.3~0.5，呈下降趋势，在21天达到最低0.3大于CK2小于CK1，说明抗逆性：CK1﹥CK3﹥CK1。而非光化学猝灭（NPQ）变化范围为1~1.6，有较大波动，第3天和第7天最高达到1.5，14天后在1.2处保持稳定，与CK1在14天后稳定在1.4，和CK2在7天后稳定在1相比，NPQ数值越大抗性越好，说明CK1比CK3抗性好，而CK3比CK2抗性好。

根据CK1除第5天为250外，其余1-21 d变化范围为180~207，CK2在1-14 d变化范围为180~210，CK3在1-21 d变化范围为185~205，3种材料5天后均有呈下降趋势，Fo降低是PSII中心受到抑制，非化学能量耗散增加造成，减少了对PSII中心的损伤，表现较强的抗旱能力。从Fo参数分析，三种材料均有较好抗性，故判定叶绿素荧光参数Fo变化范围为180~210时，材料的耐盐性较好。

根据CK1除在第5天为0.75外，其余1-21 d变化范围为0.8~0.83，CK2在1-14 d变化范围为0.8~0.83，CK3在1-21 d变化范围为0.8~0.82，因而得出三种材料的Fv/Fm变化范围为0.8~0.83。故从Fv/Fm参数分析，当材料的Fv/Fm﹤0.8时，表明芥兰受盐胁迫影响。

根据CK1在1-21 d的Y(II)变化范围为0.15~0.3，第14天达到最低0.15，随后又上升到0.21；CK2在1-14 d的Y(II)变化范围为0.16~0.3，第14天达到最低0.16后苗子死亡；CK3在1-21 d的Y(II)变化范围为0.18~0.35，低21天达到最低0.18。因而得出三种材料的Y(II)变化范围在0.15~0.35，故从Y(II)参数分析，当材料的Y(II)﹥0.18时，表明该芥兰具有较好的耐盐性。

根据CK1在1-21 d的qP变化范围为0.25~0.5，第21天为0.4；CK2在1-14 d的PSII变化范围为0.25~0.5，第14天为0.25；CK3在1-21 d的qP变化范围为0.3~0.5，第21天为0.3，比较发现材料的抗盐能力越强，qP值下降越小。因而得出三种材料的qP变化范围在0.25~0.5，故从Y(II)参数分析，当材料的qP﹥0.3时，材料的耐盐性较好。

根据CK1在1-21 d处理组的变化范围为0.6~1.4，14天后稳定在1.4；CK2在1-14 d的变化范围为1~1.4，第14天达到1；CK3在1-21 d的变化范围为1~1.6，14天后稳定在1.2，比较发现随着处理时间延长，材料的NPQ数值越大越抗盐。因而得出三种材料的NPQ变化范围在0.5~1.6，故从NPQ参数分析，当材料的NPQ﹥1.2时，且NPQ数值越接近1.5，其耐盐性越强。

故优选鉴定芥兰耐盐叶绿素荧光参数，芥兰材料叶绿素荧光参数Fo，qP，NPQ，Fv/Fm，Y(II)变化范围：当材料的叶绿素荧光参数Fo变化范围为180~210时，其耐盐性较好；当Fv/Fm﹤0.8时，则其受盐胁迫影响；当Y(II)﹥0.18时，则其具有较好的耐盐性；当qP﹥0.3时，其耐盐性较好；当NPQ﹥1.2时，且NPQ数值越接近1.5，其耐盐性越强。

以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种利用叶绿素荧光技术鉴定芥兰耐盐性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）芥兰材料准备：选择籽粒饱满的芥兰种子进行催芽，待种子露白后种植于穴盘中，待芥兰材料长成幼苗，将幼苗作为实验材料进行后续实验；

2）盐胁迫诱导：收集健壮的芥兰植株进行盐胁迫处理，作为处理组，同时以进行盐胁迫处理为空白对照分；

3）叶绿素荧光参数检测：用叶绿素荧光仪分别对处理组的盐胁迫处理1-21d的芥兰植株及对照进行叶绿素荧光参数测定绿素荧光参数Fo、qP、NPQ、Fv/Fm和Y(II)来评估不同盐胁迫处理对芥兰叶绿素荧光参数变化的影响；其中，所述Fo为初始荧光，所述qP为光化学淬灭系数，所述NPQ为非光化学淬灭系数，所述Fv/Fm最大光化学产量，所述Y(II)为实际光化学产量值。

2.根据权利要求1所述的一种利用叶绿素荧光技术鉴定芥兰耐盐性的方法，其特征在于，所述步骤1）中芥兰为中花芥兰、黄花芥兰和红脚芥兰中的一种及一种以上。

3.根据权利要求1所述的一种利用叶绿素荧光技术鉴定芥兰耐盐性的方法，其特征在于，所述步骤1）中幼苗的苗龄为40 天。

4.根据权利要求1所述的一种利用叶绿素荧光技术鉴定芥兰耐盐性的方法，其特征在于，所述步骤2）盐胁迫处理所用溶液为200 mM NaCI。

5.根据权利要求1所述的一种利用叶绿素荧光技术鉴定芥兰耐盐性的方法，其特征在于，所述步骤3）叶绿素荧光参数检测的具体步骤如下：

第一步，将待测材料放入封闭黑暗的纸箱中，叶夹上下两部分打开夹住待测叶片，暗适应20 min，记录开始测量的时间，数据采样时间为5 min，测一株整个时间为25 min，结束后取出纸箱里的测完材料放入待测材料，关闭纸箱保持黑暗环境20 min后直接开始测量，并记录时间，重复此步骤测量接下来的材料；

第二步，提供一个直径为1厘米圆形测量面，并确保光纤尖端与测量区域之间的标准距离为8 mm，光纤与测量平面呈60°角；最后读取数据，得到参数Fo、qP、NPQ、Fv/Fm和Y(II)，其中，所述Fo为初始荧光，所述qP为光化学淬灭系数，所述NPQ为非光化学淬灭系数，所述Fv/Fm最大光化学产量，所述Y(II)为实际光化学产量值。

Images