CN112179881B - 基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法，通过叶绿素荧光成像系统获取接菌不同天数的及未接菌绿豆叶片的叶绿素荧光参数，利用主成分分析(PCA)进行降维处理，选择解释率超99％的主成分作为输入，建立三次多项式支持向量机(Cubic Support Vector Machine，Cubic‑SVM)检测模型。本发明可以实现绿豆叶斑病的早期检测，且具有快速精准、无损且操作简便等优点，可为农业生产中精准防治该病害提供参考。

Description

基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法

技术领域

本发明涉及农作物病害无损检测领域，特别是涉及一种基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法。

背景技术

绿豆叶斑病是我国及亚洲地区绿豆生产上危害最严重的真菌病害之一，该病害是由变灰尾孢菌(Cercospora canescens Ell.et Martin)引起的，病原菌主要侵染植株的叶片，以开花结荚期受害最严重。病害的发展一般分为侵入期、潜育期、发病期三个阶段，若可以在发病早期及时检测到病害，适时施药，可以有效地阻止病害的扩展，减少农药施用和环境破坏。传统的病害检测在实际的农业生产中有很多的不足。肉眼观测无法准确客观的对植物病害作出评价，且难以成规模的检测。光学显微镜技术、透射电子显微镜技术、生物测定技术、血清学技术、PCR技术等虽然能够进行精确的检测，但是需要专业人员操作，且费时费力，因此这些技术难以应用到实时的农田病害在线检测。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种基于叶绿素荧光成像技术的绿豆叶斑病早期检测方法，方法中Cubic-SVM算法模型预测精度较高，提供了一种绿豆叶斑病的早期快速无损检测手段。

技术方案：本发明关于一种基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法，包括如下步骤：

(1)选取同等种植条件下的绿豆植株，并设置试验组和对照组，试验组在复叶期进行致病菌菌丝块接种；对照组为未接菌绿豆植株；其中，试验组接种包括在绿豆长出第一组复叶时，选择健康复叶进行变灰尾孢菌菌丝块的接种；

(2)采用叶绿素荧光成像系统(FluorCam FC800)获取试验组和对照组的叶绿素荧光数据；

其中，荧光成像前对植株进行暗处理，暗处理时间大于25分钟；且分别取试验组接种1天、2天、3天及相应对照组的绿豆叶片进行数据获取。

(3)采用主成分分析(PCA)的方法对数据进行降维处理，以主成分分析降维后的数据作为输入进行模型训练；

(4)对试验样本获取的响应最敏感的荧光参数和荧光图像随接种天数的变化趋势进行了分析；

(5)利用MATLAB2019a软件Classification Learner工具箱构建绿豆叶斑病机器学习模型，采用Cubic-SVM算法模型对采集的叶绿素荧光数据进行训练及预测。

其中，步骤(1)中，绿豆统一种植在温度和湿度可控的人工气候室中。接种用变灰尾孢菌菌块先在V8培养基上28℃培养7d。接菌时，利用无菌的6mm打孔器取新鲜培养的变灰尾孢菌边缘部分，将菌丝一面贴于绿豆叶片的中央且偏离叶脉的位置。最后将接种好的绿豆植株移至25℃人工气候室并进行保湿处理，保证叶片发病条件。

本发明主要检测在绿豆叶片未形成明显可见病斑及可见微小病斑时期，采用接种后1、2、3d的绿豆叶片各150片及正常未接种叶片100片作为供试样本。

步骤(2)中，本系统中荧光成像前需要对植株进行充分的暗处理(25min以上)，保证光合反应中心PSII处于完全开放状态，叶绿素中的原初电子受体完全失去电子，处于最大氧化态。

测量过程中，通过FluorCam 7控制成像系统，将光化光阶段的光强设置为200μmol·m^-2·s^-1，设置饱和光强为1500μmol·m^-2·s^-1。开始测量后，灯源发出光强为0.1μmol·m^-2·s^-1的测量光闪，测量出叶片的最小荧光(Fo)。随后灯光发出第一个饱和光闪，叶片立刻被激发出最大荧光(Fm)，随后荧光强度猝灭到最小荧光附近。

测量期间，测量光频率变为每2s一次进行测量，初始升高的最大荧光为Kautsky诱导效应下最大荧光(the peak rise in fluorescence，Fp)。系统共开启5次饱和光闪，前4次饱和光闪获取光适应下的瞬时荧光(the instantaneous fluorescence during lightadaptation，Ft-Ln)和光适应最大荧光(the maximum fluorescence during lightadaptation，Fm-Ln)。在第5次的饱和光闪下得出光适应稳态荧光(the steady-statefluorescence in light，Ft-Lss)和光适应稳态最大荧光(the steady-state maximumfluorescence in light，Fm-Lss)。之后进入暗驰豫阶段，暗驰豫阶段测量共发出三次饱和光闪，间隔时长为3s。测量得到暗驰豫即时荧光(the instantaneous fluorescenceduring dark relaxation，Ft-Dn)和暗驰豫最大荧光(the maximum fluorescence duringdark relaxation，Fm-Dn)。

步骤(3)中，叶绿素荧光测量完成后，使用FluorCam7分析软件图像进行预处理。该软件可以实现对光源的选择和参数的调整，通过成像预处理可对测量后的绿豆叶片进行兴趣区域(ROI)的选区与荧光动力学曲线分析，并导出数据集。本发明利用SPSS22.0软件中的主成分分析对数据进行降维处理。识别算法分析采用MATLAB2019a完成，以PCA降维后数据为输入，模型的验证采用K折交叉验证(K-Fold cross-validation)，为兼顾试验模型的准确率与效率，本次试验将K值设为5。

步骤(4)中，叶绿素荧光参数代表叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面，因此植物在遇到胁迫时，这些参数值将会发生变化，相应图像的荧光变化也能直观表现病害变化趋势。

本发明分析了非光化荧光猝灭参数(qN)、光化学猝灭参数(qP与qL)和荧光衰减率(Rfd)随着接种天数的变化趋势及其对应荧光图像的变化。利用SPSS22.0以接种变灰尾孢菌时间为可控因素，以接种时间为自变量，以不同的叶绿素荧光参数指标作为观测变量进行单因素方差分析(ANOVA)与克鲁斯卡尔-沃利斯单因素秩方差分析(Kruskal-Wallis检验)。

步骤(5)中，本发明的模型评价采用预测准确率和AUC值为指标。预测准确率是最直观的评价指标，同时AUC值也是评价模型整体预测效果的标准，AUC值在0-1间变动，当其越接近1时表示模型整体效果越好。兴趣区域(ROI)选择与数据的导出利用FluorCam 7软件完成。

本发明的关键创新点在于将叶绿素荧光成像技术用于绿豆叶斑病的早期检测技术中，并结合Cubic-SVM检测模型，以实现绿豆叶斑病的早期精准检测。

叶绿素荧光成像技术具有可获取植物内部信息、受温湿度影响小、不局限于晴天采集、价格合理等优点。该技术与植物光合作用密不可分，其原理主要基于Butler等人在1978年提出的能量竞争模型，该模型认为植物通过光合作用得到的光能主要以热辐射、光合系统II的光化学反应以及释放光子产生叶绿素荧光三种方式被利用，叶绿素荧光成像技术就是对以上三种能量分配的研究分析。绿豆叶斑病病害的发展一般可分为侵入期、潜育期和发病期，早期病斑尚未显现，或微小病斑周围未见褪绿现象，人眼难以察觉，因而易被忽视，导致病害扩展。

本发明以绿豆叶斑病高感品种‘V1197’作为供试样本进行样品制备，通过叶绿素荧光成像系统获取接菌不同天数的及未接菌绿豆叶片的叶绿素荧光参数。利用主成分分析(PCA)进行降维处理，选择解释率超99％的主成分作为输入，建立三次多项式支持向量机(Cubic Support Vector Machine，Cubic-SVM)检测模型。其中，Cubic-SVM可避开高维空间的复杂性，直接用此空间核函数，再利用在线性可分的情况下的求解方法直接求解对应的高维空间的决策问题。利用Cubic核函数，我们可以把平面投射成曲面，进而大大提高SVM的适用范围。SVM是基于小样本统计理论的基础上的，这符合机器学习的目的，而且支持向量机比神经网络具有较好的泛化推广能力。

采用本发明的方法，可以实现绿豆叶斑病的早期检测，且具有快速精准、无损且操作简便等优点，可为农业生产中精准防治该病害提供参考。

附图说明

图1是本发明的检测方法的流程图；

图2是不同品种绿豆叶片接种变灰尾孢菌7d后感病性验证；

图3是样品处理及数据采集流程示意图；

图4是响应敏感的叶绿素荧光参数随接种天数的变化趋势；

图5是绿豆叶斑病病叶的叶绿素荧光成像图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步地详细描述。

本实施例中使用到的叶绿素荧光成像系统(FluorCam FC800)主要包括PAM荧光调制仪、CCD成像元件、镜头组、滤波镜片组和LED光源等。有效成像面积约为40cm²。灯组一共4盏，包含2盏红橙光LED灯(620nm)和2盏蓝光LED灯(470nm)，两组灯源相同光色的光源对称排布。灯组与平面呈45度夹角的设计可以使样品均匀受光。

如图1所示为本发明的检测方法的流程图，主要包括绿豆植株种植并完成复叶期菌丝块接种；利用叶绿素荧光成像系统对接种后1、2、3天后的绿豆感病叶片及对照未接种健康叶片感兴趣区域选择；绿豆健康感病叶片叶绿素荧光参数采集，构建数据库；初始荧光数据主成分分析降维处理；降维后的荧光数据为输入，利用Cubic-SVM算法判别植株叶片健康状况。

本实施例中的基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法，具体包括如下步骤：

(1)试验菌株及致病性验证

试验用菌株为变灰尾孢菌，病原菌由绿豆叶斑病病叶分离得到，经过测序分析及序列比对验证正确。测序引物为Cer-F TTGTTGCTTCGGGGGCGAC，Cer-RCGCGCTCCGAAGCGATTAAT。致病性验证采用绿豆叶片离体菌丝块接种方法。结果如图2所示，1号品种表现为抗病，2、3、4号品种均表现出感病，表明分离得到的变灰尾孢菌对于绿豆叶片存在致病性。接种用菌块先在V8培养基上28℃培养7d。

(2)制备试验组和对照组

如图3所示为样品处理及数据采集流程示意图，在温度湿度可控的人工气候温室统一种植绿豆易感叶斑病品种‘V1197’800余株，先穴盘育苗再移栽。待长出第一片复叶时进行接菌，利用无菌的6mm打孔器取新鲜培养的变灰尾孢菌边缘部分，将菌丝一面贴于绿豆叶片的中央且偏离叶脉的位置。最后将接种好的绿豆植株移至25℃人工气候室并进行保湿处理，保证叶片发病条件。分别取接菌后1、2、3d的病叶作为待测样品，对照组为同等生长条件下未接菌叶片。实验组每个时间点各选取150个样品进行测试，对照组选取100个样品进行测试。

(3)叶绿素荧光参数采集。

为保证采集图像及参数的准确性，每次采集只测量一株绿豆的叶片。在叶绿素荧光成像数据采集之前绿豆植株暗适应25min以上。

测量过程中，通过FluorCam 7控制成像系统，将光化光阶段的光强设置为200μmol·m^-2·s^-1，设置饱和光强为1500μmol·m^-2·s^-1。开始测量后，灯源发出光强为0.1μmol·m^-2·s^-1的测量光闪，测量出叶片的最小荧光(Fo)。随后灯光发出第一个饱和光闪，叶片立刻被激发出最大荧光(Fm)，随后荧光强度猝灭到最小荧光附近。

测量期间，测量光频率变为每2s一次进行测量，初始升高的最大荧光为Fp。此后系统共开启5次饱和光闪，前4次饱和光闪获取Ft-Ln和Fm-Ln。在第5次的饱和光闪下得出Ft-Lss和Fm-Lss。之后进入暗驰豫阶段，暗驰豫阶段测量共发出三次饱和光闪，间隔时长为3s。测量得到Ft-Dn和Fm-Dn。测量完成后，系统相应的算法结合初始荧光参数可得出如QY-max、qP和NPQ等荧光参数。下表1为常用叶绿素荧光参数。

表1、常用叶绿素荧光参数

(4)数据处理

叶绿素荧光测量完成后，使用FluorCam 7分析软件图像进行预处理。本试验利用SPSS22.0软件中的主成分分析对数据进行降维处理。识别算法分析采用MATLAB2019a完成，以PCA降维后数据为输入，模型的验证采用K折交叉验证(K-Fold cross-validation)，为兼顾试验模型的准确率与效率，本次试验将K值设为5。本试验中共测到包含Fv/Fm、F₀、Fm等的101个参数指标。如下表2所示为降维后的主成分贡献值，可以看出降维处理结果表明前13个主成分解释率达到99.079％，基本完全可解释全部的叶绿素荧光参数指标。

表2、降维后的主成分贡献值

(5)叶绿素荧光参数及荧光成像图随接种时间的变化分析。

本试验中响应最敏感的参数(叶斑病的严重程度与参数变化呈现出明显相关性)有Rfd、qN、qL、qP等，如图4所示为变化趋势图，图4A为Rfd系列参数变化图，图4B为qN系列参数变化图，图4C为光化学猝灭系列参数变化；其中Lss表示稳态下，L1、L2和L3分别表示光适应下的第一次、第二次和第三次给光，D1和D2分别表示暗环境下的第一次和第二次给光。Rfd和qL、qP指数随着接种天数的增加而出现下降趋势，qN随着接种天数的增加均呈现出先增加后下降的趋势。

相比较单一的数值，图像可以更加直观的显示植物的感病情况。如图5所示，RGB表示三原色图像，Rfd表示荧光衰减率成像图，Q1-D2表示暗环境下第二次给光的光适应光化学荧光猝灭成像图，Qp-D1表示暗环境下第一次给光的暗驰豫光化学荧光猝灭成像图，NPQ表示非光化荧光猝灭成像图；其中，字母D的意思是dark，暗环境下的，D1、D2分别表示暗环境下的第一次给光、第二次给光；L意思是light，光适应下的，L1、L2分别表示光适应下的第一次给光第二次给光；Lss表示光稳态下的参数值。均对参数有一定参考意义。通过图5可以看出，在接种1、2d时RGB图像未见明显病斑，而荧光成像图即可以检测到荧光差别，而在接种3d时，荧光成像图不仅可以显示出病斑所在位置，且可以观察到叶片病斑周围的荧光变化，对于病害的发展具有指示作用。

(6)Cubic-SVM模型训练和预测

借用MATLAB2019a软件Classification Learner工具箱构建绿豆叶斑病机器学习模型，采用Cubic-SVM算法模型对采集的叶绿素荧光数据进行训练及预测。模型评价采用预测准确率和AUC值为指标。预测准确率是最直观的评价指标，同时AUC值也是评价模型整体预测效果的标准，AUC值在0-1间变动，当其越接近1时表示模型整体效果越好。兴趣区域(ROI)选择与数据的导出利用FluorCam 7软件完成。本试验的检测结果如表3所示。

表3、绿豆叶斑病早期检测结果

本实施例以绿豆叶斑病高感品种‘V1197’作为供试样本进行样品制备，通过叶绿素荧光成像系统获取接菌不同天数的及未接菌绿豆叶片的叶绿素荧光参数。利用主成分分析(PCA)进行降维处理，选择解释率超99％的主成分作为输入，建立三次多项式支持向量机(Cubic-SVM)检测模型。通过上表可以看出，Cubic-SVM模型在接菌1、2和3天的检测准确率分别达到83.6％、94.0％和98.4％，AUC值分别为0.9、0.97和1。

Claims (3)

1.一种基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)选取同等种植条件下的绿豆植株，设置试验组和对照组，试验组在复叶期进行致病菌菌丝块接种；对照组为未接菌绿豆植株；

(2)采用叶绿素荧光成像系统获取试验组和对照组的叶绿素荧光数据；

(3)采用主成分分析的方法对数据进行降维处理，以主成分分析降维后的数据作为输入进行模型训练；对试验组获取的响应最敏感的荧光参数和荧光图像随接种天数的变化趋势进行分析；所述响应最敏感的荧光参数包括光适应荧光衰减率Rfd、非光化荧光猝灭qN、基于“Lake模型”的光适应化学荧光猝灭qL和暗驰豫光化学荧光猝灭qP；

(4)基于上述响应最敏感的荧光参数构建绿豆叶斑病机器学习模型，采用Cubic-SVM算法模型对采集的叶绿素荧光数据进行训练及预测；

步骤(1)中，试验组接种包括在绿豆长出第一组复叶时，选择健康复叶进行变灰尾孢菌菌丝块的接种；

步骤(2)中，荧光成像前对植株进行暗处理，暗处理时间大于25分钟；

步骤(2)中，测量得到的叶绿素荧光参数包括叶片的最小荧光Fo、最大荧光Fm、Kautsky诱导效应下最大荧光Fp、光适应下的瞬时荧光Ft-Ln、光适应最大荧光Fm-Ln、光适应稳态荧光Ft-Lss、光适应稳态最大荧光Fm-Lss、暗驰豫即时荧光Ft-Dn、暗驰豫最大荧光Fm-Dn、光适应荧光衰减率Rfd、非光化荧光猝灭qN、基于“Lake模型”的光适应化学荧光猝灭qL和暗驰豫光化学荧光猝灭qP。

2.根据权利要求1所述的基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法，其特征在于：步骤(2)中，分别取试验组接种1天、2天、3天及相应对照组的绿豆叶片进行数据获取。

3.根据权利要求1所述的基于叶绿素荧光成像的绿豆叶斑病的早期检测方法，其特征在于：叶绿素荧光测量完成后，使用FluorCam 7分析软件图像进行预处理；利用SPSS22.0软件中的主成分分析对数据进行降维处理，识别算法分析采用MATLAB2019a完成，以PCA降维后数据为输入，模型的验证采用K折交叉验证；模型评价采用预测准确率和AUC值为指标。

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