CN104865212A - 一种花椰菜作物渍害等级的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种花椰菜作物渍害等级的测定方法，为探索花椰菜受到渍害的等级判定方法，本发明采用氯化三苯基四氮唑(TTC)还原法测定花椰菜根系活力，采用Li-6400测定花椰菜叶片光合参数，FMS-2型便携脉冲调制式荧光仪测定花椰菜叶片荧光参数，综合花椰菜光合以及生理指标，优化计算参数，确定花椰菜渍害等级。可以快速、准确测定最大净光合速率、最大光化学效率以及根系活力的大小，操作可行性高，测定的精密度较高，相对误差较小，能够满足花椰菜渍害胁迫指标的准确计算以及渍害等级的判定。

Description

一种花椰菜作物渍害等级的测定方法

技术领域

本发明属于作物水分胁迫测定的技术领域，具体涉及一种花椰菜作物渍害等级的测定方法。

背景技术

水分是影响作物生长发育的关键因子之一，只有在水分适合的条件下，植物才能进行正常的生命活动，水分不足或过多都会对作物的生理及其形态带来影响。研究表明：当土壤水分过多时，造成植株根际缺氧，有氧呼吸受到抑制，根系腐烂，甚至造成烂根死苗(赵可夫，2003)，即发生渍害。根系活力下降，土壤水分和营养物质的吸收受到限制，根部生长停止，影响植株正常的生长发育(Kozlowski，1997)。水淹胁迫下，叶片气孔关闭，蒸腾作用受到限制，CO₂向叶片扩散受阻，叶片中总叶绿素和叶绿素a含量下降，与光合相关酶类也受到影响，光合能力下降生物量合成减少(Edwards et al，2003；Ashraf M，2005；MIELKEKE，2010)。

国内外对水淹胁迫的研究主要集中于水生植物水淹机理。生理指标包括：根系活力、超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、可溶性蛋白Pr含量、叶片水势、叶绿素含量等。光合指标包括最大净光合速率、光饱和点、光补偿点以及叶片荧光参数等。研究植物的生理以及光合过程有利于我们进一步探讨植物在逆境胁迫下的响应机制，对于提高作物产量有重大意义。

花菜(Brassica oleracea L.var.botrytis L.)又名花椰菜，由于其独特的风味及其丰富的营养价值收到消费者广泛欢迎。花菜喜湿润环境，根系较浅，不耐干旱，耐涝能力也较弱，对水分的供应要求比较严格。生长发育最适宜的土壤温度为田间持水量的70％一80％，最适宜的空气湿度为85％～90％，在整个生长时期，对水分的要求又不一样(董伟，2008)。

花菜栽培过程中经常受到水分胁迫的影响，容易发生渍害，给花菜的品质及其产量构成造成影响。花菜生理指标的测定包括：TTC方法测定根系活力(高俊凤，2006)、氮蓝四唑(NBT)还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性(王爱国，1983)、硫代巴比妥酸(TBA)反应法测定丙二醛(MDA)含量(林植芳，1984)、分光光度计法测定叶绿素含量，光合参数采用Li-6400测定、荧光参数采用FMS-2型便携脉冲调制式荧光仪测定等。单独研究水淹对某一指标的影响具有一定局限性，而目前关于确定花椰菜的渍害指标的综合测定方法前人研究较少，尚未有相适宜的测定方法研究成果。本发明综合评估多种生理和光合指标，主要确定水淹胁迫下花椰菜发生渍害指标，对花椰菜耐涝旱性品种的选育、科学田间管理以及渍害防御具有重要的指导意义。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种花椰菜作物渍害等级的测定方法，通过研究生理和光合指标，综合考虑水淹对花菜根系、光合、荧光等指标，确定花椰菜的渍害指标，为花椰菜的栽培管理和渍害防御提供科学的指导作用。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种花椰菜作物渍害等级的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)花椰菜样品水淹试验预处理，包括正常培养的对照组，和水淹培养的水淹组；

2)花椰菜生理指标的测定，包括光合参数、荧光参数和根系活力的测定；

3)花椰菜渍害胁迫指数的计算，渍害胁迫指数Q计算公式如下：

Q＝a×K_1ck/K₁+b×K_2ck/K₂+c×K_3ck/K₃

其中：Q为渍害胁迫指数，K₁、K_1ck分别为水淹组与对照组的最大净光合速率，K₂、K_2ck为水淹组与对照组的最大光化学效率，K₃、K_3ck为水淹组与对照组的根系活力；a、b、c为试验常数，其中a+b+c＝1；a、b、c常数由水淹胁迫对花椰菜各项指标(光合参数、荧光参数和根系活力)的影响不同而决定，且与试验品种有关；

4)花椰菜渍害等级的划分，根据Q值确定花椰菜渍害等级，Q值越大，渍害胁迫程度越深。

进一步的，在本发明中，步骤1)中，在装有培养土壤的盆内进行培养，所述对照组正常管理，所述水淹组设置为水分淹没盆内土壤高度1cm，水淹处理依次为3d、6d、9d、12d、15d，其他条件一致。

进一步的，在本发明中，步骤2)中，所述光合参数测定方法为：

1-1)光响应曲线的测量：利用Li-6400光合作用测定系统的6400-02B红蓝光源，设定参比室中CO₂的浓度为400μL·L^-1，叶室温度设置为25℃，按照由强到弱的顺序设定光辐射强度分别为2000、1800、1600、1400、1200、1000、800、600、400、200、150、100、50、0μmol·m^-2·s^-1；

1-2)进行光合作用光响应曲线拟合，并计算试验组叶片的最大净光合速率。

进一步的，在本发明中，步骤2)中，所述荧光参数的测定方法为：

2-1)荧光稳定时测定光适应状态下的荧光参数，包括F_s、F_o’、F_m’；

2-2)使叶片暗适应20分钟，测量暗适应荧光参数，包括F_o、F_m；

2-3)计算得到相应的荧光参数，包括光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(qN)、光电子传递速率(ETR)、最大光化学效率(Fv/Fm)。

进一步的，在本发明中，步骤2)中，所述根系活力的测定方法为：

3-1)取0.4％TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na₂S₂O₄粉摇匀后产生红色的TTF，乙酸乙酯定容至刻度，摇匀；然后分别取此液0.5ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml、3.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF50μg、100μg、150μg、200μg、300μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线；

3-2)称取根样品0.5g，放入小烧杯中，空白组先加入硫酸再加入根样品，其他操作相同；

3-3)加入0.4％TTC溶液和0.1mol·L-1磷酸缓冲液等量混合液10ml，把根样品充分浸没，37℃条件下暗处保温1～2h；

3-4)加入1mol·L-1硫酸2ml，以停止反应；

3-5)把根样品取出，吸干水分后与乙酸乙酯和石英砂研磨，提取TTC。

3-6)将提取液用分光光度计在485nm下比色，以空白作参比测得光密度，查步骤3-1)绘制的标准曲线，计算得到四氮唑还原量，再公式计算得四氮唑还原强度即根系活力大小，公式如下：

$R_a=\frac{MT}{M\×t}$

其中：Ra：四氮唑还原强度，MT：四氮唑还原量(μg)，M：根重(g)，t：保温时间(h)，取值为1h。

进一步的，在本发明中，步骤4)中，所述花椰菜渍害等级的划分方法为：在花椰菜适宜生长的水分条件下即无渍害，胁迫指数Q＝1，Q值越大，渍害胁迫程度越深，根据Q值的变化，将花椰菜渍害灾害分为轻度、中度、重度、特重度四个等级，具体如下：

有益效果：本发明提供的花椰菜作物渍害等级的测定方法，与现有技术相比，本发明综合评估多种生理和光合指标，主要确定水淹胁迫下花椰菜发生渍害指标，对花椰菜耐涝旱性品种的选育、科学田间管理以及渍害防御具有重要的指导意义。本发明采用Li-6400测定花椰菜叶片光合参数，FMS-2型便携脉冲调制式荧光仪测定花椰菜叶片荧光参数，紫外可见分光光度计下测定TTC还原量，可以快速、准确测定最大净光合速率、最大光化学效率以及根系活力的大小，操作可行性高，测定的精密度较高，相对误差较小，能够满足花椰菜渍害胁迫指标的准确计算以及渍害等级的判定。

附图说明

图1为本发明方法的流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

为探索花椰菜受到渍害的等级判定方法，本发明采用氯化三苯基四氮唑(TTC)还原法测定花椰菜根系活力，采用Li-6400测定花椰菜叶片光合参数，FMS-2型便携脉冲调制式荧光仪测定花椰菜叶片荧光参数，综合花椰菜光合以及生理指标，优化计算参数，确定花椰菜渍害等级。如图1所示为一种的方法的流程示意图，具体技术方案如下：

将处于苗期的花椰菜分别进行不同的水淹处理，测定不同处理下花椰菜的光合参数、根系活力以及叶片荧光参数，比较不同处理下测得的参数，建立花椰菜水淹胁迫指数的回归方程，判定花椰菜渍害等级，从而确定花椰菜受灾情况。

本实验采用Li-6400测定花椰菜叶片光合参数，FMS-2型便携脉冲调制式荧光仪测定花椰菜叶片荧光参数，紫外可见分光光度计下测定TTC还原量，可以快速、准确测定最大净光合速率、最大光化学效率以及根系活力的大小，操作可行性高，测定的精密度较高，相对误差较小，能够满足花椰菜渍害胁迫指标的准确计算以及渍害等级的判定。

实施例1

第一步：花椰菜水淹试验

将大小均匀、长至3-5片真叶的处于苗期的花椰菜移栽入塑料盆中。试验期间，水淹组设置为水分淹没盆内土壤1cm，适当加水，保持试验期间盆内水面高度一致；CK组设置为正常管理，保持土壤湿润即可，试验期间环境温度为23℃/17℃，相对空气湿度为72％，光合有效辐射为800μmol·m^-2·s^-1。每个处理设置3盆重复。

第二步：仪器设备与药品准备

(1)仪器设备

10-1000μL、1000-5000μL DRAGONLAB可调式移液枪，上海万岛仪器科技有限公司；

紫外分光光度计，日本岛津公司；

Li-6400便携式光合仪，北京力高泰科技有限公司；

FMS-2便携脉冲调制式荧光仪，英国汉莎科学仪器有限公司；

数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；

电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司。

(2)药品试剂

红四氮唑，分析纯，上海科峰化学试剂有限公司，上海；

乙酸乙酯，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

浓硫酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

琥珀酸钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

低亚硫酸钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

磷酸二氢钾，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

十二水合磷酸氢二钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

石英砂，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海。

第三步：花椰菜生理指标的测定

(1)光合参数的测定

采用Li-6400便携式光合作用测定系统(LI-COR Biosciences Inc.,USA)在上午9:00-11:00间进行，每个处理重复3次，测量花椰菜叶片净光合速率(Pn,μmol CO₂·m^-2·s^-1)。光响应曲线的测量利用Li-6400光合作用测定系统的6400-02B红蓝光源，设定参比室中CO₂的浓度为400μL·L^-1，叶室温度设置为25℃，按照由强到弱的顺序手动设定光辐射强度(PAR)分别设定为2000、1800、1600、1400、1200、1000、800、600、400、200、150、100、50、0μmol·m^-2·s^-1。使用Photosynthesis Work Bench程序进行光合作用光响应曲线拟合。从拟合曲线上读出试验组叶片的最大净光合速率。

(2)荧光参数的测定

选取生长良好的花椰菜功能叶，采用FMS-2型便携脉冲调制式荧光仪(Hansatech，UK)测定初始荧光(F₀)、最大荧光(F_m)等。在上午10：00左右荧光基本稳定时测定光适应状态下的荧光参数F_s、F_o’、F_m’等，然后再让叶片暗适应20分钟，测量暗适应荧光参数F_o、F_m等。计算可以得到相应的荧光参数光化学猝灭系数(qP)、非光化学猝灭系数(qN)、光电子传递速率(ETR)、最大光化学效率(Fv/Fm)。每个处理进行3次重复试验。计算公式如下：

qP＝(Fm'-Fs)/(Fm'-Fo')

qN＝1-(F'_m-F'_o)/(F_m-F_o)＝1-F'_v/F_v

F_v/F_m＝(F_m-F_o)/F_m

(3)根系活力的测定

取0.4％TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na2S2O4粉摇匀后产生红色的TTF。乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.5ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml、3.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF50μg、100μg、150μg、200μg、300μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线。

把根仔细洗净，用吸水纸吸干根部表面水分，称取根样品0.5g，分别放入小烧杯中(空白试验先加入硫酸再加入根样品，其他操作相同)，加入0.4％TTC溶液和0.1mol·L^-1磷酸缓冲液等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液中，37℃条件下暗处保温1h，此后加入1mol·L^-1硫酸2ml，以停止反应。之后把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯(共10ml)和少量石英砂研磨，提取TTC。将红色提取液移入试管中，用分光光度计在485nm下比色，以空白作参比读出光密度，查上述绘制标准曲线，计算得到四氮唑还原量，公式如下：

$R_a=\frac{MT}{M\×t}---\left(1\right)$

其中：Ra：四氮唑还原强度，MT：四氮唑还原量(μg)，M：根重(g)，t：时间(h)。

第四步：花椰菜渍害胁迫指数的计算

最大净光合速率Pmax直接反映植物光合作用的强弱；F_v/F_m表示的是表示叶绿体光系统Ⅱ(PSⅡ)受到伤害的指标，对环境胁迫较为敏感，其大小可反映植物PSⅡ受伤害的程度；根系活力Ra是植株根部吸收、合成、氧化以及还原能力的综合体现，是反映根系生命力的综合指标。根据实验过程中各指标受影响状况，选取最大净光合速率Pmax、最大光化学效率Fv/Fm、根系活力Ra作为确定花椰菜受灾的判定指标，Q为渍害胁迫指数，计算公式如下：

Q＝a×K_1ck/K₁+b×K_2ck/K₂+c×K_3ck/K₃

其中：Q为渍害胁迫指数，K₁、K_1ck分别为水淹组与对照组的最大净光合速率、K₂、K_2ck为水淹组与对照组的最大光化学效率，K₃、K_3ck为水淹组与对照组的根系活力；a、b、c为试验常数，其中a+b+c＝1，综合分析水淹对花椰菜各项指标的影响可知，水淹胁迫下，作物最大净光合速率以及根系活力均出现大幅下降，而最大光化学效率变化相对较小，本实验中a＝c＝0.4，b＝0.2。

第五步：花椰菜渍害等级的划分

在花椰菜最适宜生长的水分条件下无灾害，渍害胁迫指数Q＝1，Q值越大，渍害胁迫程度越深。根据Q值的变化，将花椰菜渍害灾害分为轻度、中度、重度、特重度四个等级。花椰菜不同渍害等级划分见表1。

表1花椰菜渍害等级划分

第六步：花椰菜灾害等级确定

测定花椰菜渍害胁迫下的最大净光合速率Pmax、最大光化学效率Fv/Fm以及根系活力Ra，计算花椰菜渍害胁迫指数。

实施例2：

根据实施例1的方法，利用花椰菜进行水淹试验，按上述步骤测定生理指标，计算出渍害胁迫指数，利用渍害指标判定受灾等级，结果见表2。由表可知，水淹条件下花椰菜综合生长指标随时间的变化与单个指标变化趋势保持较高一致性。水淹时间越长，渍害胁迫指数越高、灾害等级越高，在水淹第3天花椰菜渍害程度为轻度，第6天时花椰菜的渍害胁迫指数Q＝2.05，渍害等级为中度胁迫，第9天以后，花椰菜各项指标急剧下降，Q＞4，达到渍害重度胁迫，水淹12d后，花椰菜根系活力较3天时下降超过90％。最大净光合速率几乎为0，此时Q＞10，为渍害等级为特重度胁迫水平。

表2渍害胁迫指数及其生理指标随时间的响应

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种花椰菜作物渍害等级的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)花椰菜样品水淹试验预处理，包括正常培养的对照组，和水淹培养的水淹组；

2)花椰菜生理指标的测定，包括光合参数、荧光参数和根系活力的测定；

3)花椰菜渍害胁迫指数的计算，渍害胁迫指数Q计算公式如下：

Q＝a×K_1ck/K₁+b×K_2ck/K₂+c×K_3ck/K₃

其中：Q为渍害胁迫指数，K₁、K_1ck分别为水淹组与对照组的最大净光合速率，K₂、K_2ck为水淹组与对照组的最大光化学效率，K₃、K_3ck为水淹组与对照组的根系活力；a、b、c为试验常数，其中a+b+c＝1；

4)花椰菜渍害等级的划分，根据Q值确定花椰菜渍害等级，Q值越大，渍害胁迫程度越深。

2.根据权利要求1所述的花椰菜作物渍害等级的测定方法，其特征在于：步骤1)中，在装有培养土壤的盆内进行培养，所述对照组正常管理，所述水淹组设置为水分淹没盆内土壤高度1cm，水淹处理依次为3d、6d、9d、12d、15d，其他条件一致。

3.根据权利要求1所述的花椰菜作物渍害等级的测定方法，其特征在于：步骤2)中，所述光合参数测定方法为：

1-1)光响应曲线的测量：利用Li-6400光合作用测定系统的6400-02B红蓝光源，设定参比室中CO₂的浓度为400μL·L^-1，叶室温度设置为25℃，按照由强到弱的顺序设定光辐射强度分别为2000、1800、1600、1400、1200、1000、800、600、400、200、150、100、50、0μmol·m^-2·s^-1；

1-2)进行光合作用光响应曲线拟合，并计算试验组叶片的最大净光合速率。

4.根据权利要求1所述的花椰菜作物渍害等级的测定方法，其特征在于：步骤2)中，所述荧光参数的测定方法为：

2-1)荧光稳定时测定光适应状态下的荧光参数，包括F_s、F_o’、F_m’；

2-2)使叶片暗适应20分钟，测量暗适应荧光参数，包括F_o、F_m；

2-3)计算得到相应的荧光参数，包括光化学猝灭系数、非光化学猝灭系数、光电子传递速率、最大光化学效率。

5.根据权利要求1所述的花椰菜作物渍害等级的测定方法，其特征在于：步骤2)中，所述根系活力的测定方法为：

3-1)取0.4％TTC溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na₂S₂O₄粉摇匀后产生红色的TTF，乙酸乙酯定容至刻度，摇匀；然后分别取此液0.5ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml、3.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到含TTF50μg、100μg、150μg、200μg、300μg的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线；

3-2)称取根样品0.5g，放入小烧杯中，空白组先加入硫酸再加入根样品，其他操作相同；

3-3)加入0.4％TTC溶液和0.1mol·L^-1磷酸缓冲液等量混合液10ml，把根样品充分浸没，37℃条件下暗处保温1～2h；

3-4)加入1mol·L^-1硫酸2ml，以停止反应；

3-5)把根样品取出，吸干水分后与乙酸乙酯和石英砂研磨，提取TTC；

3-6)将提取液用分光光度计在485nm下比色，以空白作参比测得光密度，查步骤3-1)所得到的标准曲线，计算得到四氮唑还原量，再公式计算得四氮唑还原强度即根系活力大小，公式如下：

$R_a=\frac{MT}{M\×t}$

其中：Ra：四氮唑还原强度，MT：四氮唑还原量(μg)，M：根重(g)，t：3-3)中样品在混合液中在37℃条件下保温时间(h)。

6.根据权利要求1所述的花椰菜作物渍害等级的测定方法，其特征在于：步骤4)中，所述花椰菜渍害等级的划分方法为：在花椰菜适宜生长的水分条件下，无渍害胁迫渍害胁迫指数Q＝1，Q值越大，渍害胁迫程度越深，根据Q值的变化，将花椰菜渍害灾害分为轻度、中度、重度、特重度四个等级，具体如下：