CN105550162A - 一种葡萄植株高温胁迫等级的确定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种葡萄植株高温胁迫等级的确定方法，包括以下步骤：（1）将处于苗期的葡萄分别进行不同程度的高温处理，测定处理后的叶片相对电导率、叶绿素a含量和超氧化物歧化酶含量，比较不同处理下测得的参数，建立葡萄高温胁迫指数的回归方程；（2）通过步骤（1）建立的葡萄高温胁迫指数的回归方法，计算不同程度高温处理后的葡萄高温胁迫指数，结合不同程度高温处理后的葡萄植株生长状态，确定不同高温胁迫等级下高温胁迫指数的范围。采用本发明方法能有效确定葡萄植株高温胁迫等级，对于葡萄的栽培管理和高温灾害防御具有重要的指导意义。

Description

一种葡萄植株高温胁迫等级的确定方法

技术领域

本发明具体涉及一种葡萄植株高温胁迫等级的确定方法。

背景技术

温度是作物生长的重要环境因子，温度的变化直接影响作物的生理生特特征、分布、同化、呼吸以及蒸腾等各项生理活动、从而影响植株的生长发育与产量形成，最终影响产品的产量和质量(冯秀藻，1991)。研究表明：高温下细胞膜系统的稳定性同抗性成正相关(马旭俊，2003)。植物面对高温胁迫时，植株的细胞膜的脂质透性增加，细胞内电解质外渗，对植物造成了高温伤害(Martireau，1979)。在逆境胁迫下，植物通过应激性反应，激活抗氧化剂和诱导抗氧化酶的活性，减弱膜脂过氧化作用，保持膜的稳定性(王洪春，1985)。光合作用是植株对高温最敏感的部位之一，高温胁迫下，光合速率下降的程度与抗热性成负相关(马德华，1999)。高温对光合作用的抑制是由非气孔因素作用的，叶肉细胞气体扩散阻抗增加，CO₂的溶解度下降，Rubiso对CO₂的亲和力降低或光合机构关键成分的热稳性降低的原因所致(许大全，1998)。高温对植株最重要的伤害是对细胞酶的破坏，造成细胞的正常代谢受阻，导致生长发育中止甚至细胞死亡等。国内外关于高温胁迫对植物的影响的研究主要集中于对植物生理机制、光合作用以及生物量的累积等，并已取得一定进展，这对于我们进一步探讨高温胁迫对作物伤害以及如何采取相应的防御措施具有重要的意义。

葡萄(Vitisvinifera)属落叶藤本植物，有“水果之神”的称号，是世界上四大水果之一。近年来，中国葡萄栽培发展十分迅速，2014年全国葡萄栽培面积已达到300余万亩，然而近年来，由于温室效应引起的全球气温持续升高，由此造成的农业生产损失也越来越严重。在中国，最近几年的夏秋季节，多个地区发生了35℃—40℃的长时间高温天气，有些地区甚至发生了40℃以上的短时间极端高温天气，夏秋季节正值葡萄开花坐果时期，高温胁迫抑制葡萄正常的生长和发育，降低了产量和品质。国内外研究主要集中在高温对葡萄生长及品质影响机理方面，而关于葡萄的灾害等级预报等方面研究较少。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种能有效确定葡萄的高温胁迫等级的方法。

为了达到上述目的，本发明提供了一种葡萄植株高温胁迫等级的确定方法，包括以下步骤：

(1)将处于苗期的葡萄分别进行不同程度的高温处理，测定处理后的叶片相对电导率、叶绿素a含量和超氧化物歧化酶含量，比较不同处理下测得的参数，建立葡萄高温胁迫指数的回归方程；

(2)通过步骤(1)建立的葡萄高温胁迫指数的回归方法，计算不同程度高温处理后的葡萄高温胁迫指数，结合不同程度高温处理后的葡萄植株生长状态，确定不同高温胁迫等级下高温胁迫指数的范围。

其中，步骤(1)中葡萄高温胁迫指数的回归方程为：

$R=r_1\×\frac{|A_{CK}-A_E|}{\left|A_{CK}\right|}+r_2\×\frac{|B_{CK}-B_E|}{\left|B_{CK}\right|}+r_3\×\frac{|C_{CK}-C_E|}{\left|C_{CK}\right|};$

其中，R为高温胁迫指数，A_E、B_E、C_E分别为不同程度高温处理后的叶片相对电导率、超氧化物歧化酶含量、叶绿素a含量，Ack、B_CK、C_CK分别为对照处理下的叶片相对电导率、超氧化物歧化酶含量、叶绿素a含量，r₁、r₂、r₃分别为叶片相对电导率、超氧化物歧化酶含量、叶绿素a含量的权重；对照处理为：日最高温度28℃，日最低温度18℃，环境相对湿度为70％，光合有效辐射为800μmol·m^-2·s^-1；r₁、r₂、r₃通过层次法确定。

确定的最佳葡萄高温胁迫指数的回归方程为：

$R=5\×\frac{|A_{CK}-A_E|}{\left|A_{CK}\right|}+3\×\frac{|B_{CK}-B_E|}{\left|B_{CK}\right|}+2\×\frac{|C_{CK}-C_E|}{\left|C_{CK}\right|}.$

上述高温胁迫等级包括轻度、中度、重度、特重度；当高温胁迫指数大于5但不超过10时，为轻度胁迫；当高温胁迫指数大于10但不超过15时，为中度胁迫；当高温胁迫指数大于15但不超过20时，为重度胁迫；当高温胁迫指数大于20时，为特重度胁迫。

上述步骤(1)中的高温处理设置为4个，昼温/夜温分别为：34℃/24℃、36℃/26℃、38℃/28℃、40℃/30℃，每个高温处理的持续时间均分别进行2天、4天、6天和8天的处理，环境相对湿度为70％，光合有效辐射为800μmol·m^-2·s^-1，每个处理设置三盆重复。

叶片相对电导率采用数字电导仪法测定；叶绿素a含量采用分光光度计法测定(Hugo，2004、张立军，2004)；超氧化物歧化酶含量采用氮蓝四唑还原法测定(王爱国，1983)。

本发明相比现有技术具有以下优点：高温胁迫下，植株叶片细胞膜透性增加，电解质外渗，叶片相对电导率增大，逆境胁迫下植株抗氧化酶活性增强，从而减弱膜脂过氧化作用，降低高温对植株的伤害。同时高温同时使得植株叶片叶绿素含量下降，光合速率下降。本发明采用氮蓝四唑(NBT)还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性、分光光度计法测定叶绿素含量、数字电导仪法测定叶片相对电导率的方法，综合评估高温胁迫对不同生理指标的影响，确定葡萄植株的高温胁迫等级，对于葡萄耐热性品种的选育、葡萄的栽培管理和高温灾害防御具有重要的指导意义。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

本发明葡萄植株高温胁迫等级的确定方法具体步骤如下：

第一步：葡萄植株高温试验

将处于3年生的葡萄植株移栽至塑料盆中，放入人工气候室(TPG—2009，Australian)，试验期间，设置4个高温处理，昼温/夜温分别为34℃/24℃(T1)、36℃/26℃(T2)、38℃/28℃(T3)、40℃/30℃(T4)，持续时间分别处理2、4、6、8天；以日最高28℃/日最低18℃为对照(CK)，试验期间，环境相对湿度为70％，光合有效辐射为800μmol·m^-2·s^-1，每个处理设置三盆重复。

第二步：仪器设备与药品准备

(1)仪器设备

10-1000μL、1000-5000μLDRAGONLAB可调式移液枪，上海万岛仪器科技有限公司；

紫外分光光度计，日本岛津公司；

CT-3030电导率仪，上海天垒仪器仪表有限公司；

电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；

(2)药品试剂

磷酸二氢钾，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

三水合磷酸氢二钾，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

石英砂，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

乙二胺四乙酸二钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

氯化硝基四氮唑蓝，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

L-甲硫氨酸，分析纯，中国惠兴生化试剂有限公司，上海；

核黄素，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

第三步：葡萄植株生理指标的测定

(1)相对电导率的测定

将环境控制试验的高温处理后的葡萄植株叶片样品取出解冻，并用蒸馏水擦拭干净，晾干。利用仪器(DDSJ308，上海)测定叶片电导率，测定时取一洁净小烧杯，加入40ml蒸馏水，用数字电导仪测出其电导率R₀。选取经过高温处理的叶片，避开主叶脉，每组用打孔器取直径1.5cm叶肉组织三等分(即三次重复)，每份5片，置于小烧杯中，加入40ml蒸馏水浸泡5-6h(尽量避免叶片之间重叠)，测出其电导率R₁。再将小烧杯用保鲜膜封好放入水浴锅中蒸煮30min，取出冷却后再次测定其电导率R₂。相对电导率的计算方法如下：

$R\left(\%\right)=\frac{R_1-R_0}{R_2-R_0}*100\%\mathrm{...}\left(1\right)$

根据式(1)，计算得到的不同程度高温处理下的葡萄叶片相对电导率如表1所示：

表1葡萄叶片相对电导率随高温胁迫时间的变化

。

(2)叶片叶绿素含量测定

试验处理期间摘取葡萄功能叶片，采用Hugo、张立军等的方法来测定葡萄叶片叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量。将新鲜葡萄叶片置于96％乙醇中，直至叶片变为白色，叶绿素完全提取出，用分光光度计在665、649、470nm波长下对提取液比色，计算得到叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量。每个处理进行3次重复实验。

计算得到的不同程度高温处理下的葡萄叶片叶绿素a含量如表2所示：

表2叶片的叶绿素a含量(mg/g)随胁迫时间的变化

。

(3)SOD含量的测定

取分析纯KH₂PO₄27.216g用蒸馏水定容到1000ml作为A液，另取分析纯K₂HPO₄·3H₂O45.644g，定容至1000ml，作为B液；21.25mlA液+228.25mlB液混合，定容至1000ml，得到0.05M磷酸缓冲液(PH7.8)；取1.9399g甲硫氨酸用磷酸缓冲液定容至100ml(Met)，取0.06133g氮蓝四唑用磷酸缓冲液定容至100ml(NBT)，取0.0372g乙二胺四乙酸二钠用磷酸缓冲液定容至100ml(EDTA-Na₂)，取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml(MFD)。其中Met、NBT、EDTA-Na₂需避光保存。SOD反应液的配置需：磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na₂：MFD：H₂O比例为：150：30：30：30：30：25。

称取0.5g样品放入研钵中，加入5mlPH7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，冷冻离心20分钟(转速为4000r/min，4℃)，上清液倒入试管，置于0-4℃下保存待用。

取型号相同的试管，吸取20μl酶液，加入3ml反应液，4000Lux照光30分钟，同时取4支试管，2支作对照，2支做空白(不加酶液，用缓冲液代替)；空白置暗处，对照(CK)与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟(反应室温度低可延长时间，高则短些)。遮光保存，以空白调零，560nm比色。计算公式如下：

SOD总活性(吸光度/g.FW)＝(A_CK-A_E)*V/(W*0.5*A_CK*V_E).............(2)

其中：W是样品重量，V是样液总体积(ml)，V_E是测定时酶液用量(ml)，A_CK是照光对照管的吸光度值，A_E是样品管的吸光度值。

根据式(2)，计算不同程度高温处理下的叶片SOD含量如表3所示：

表3葡萄叶片组织的超氧化物岐化酶SOD含量(吸光度/(h·g))随高温胁迫时间的变化

。

第四步：葡萄高温胁迫指数的计算

相对电导率是反映植物膜系统状况的一个重要的生理生化指标，是表征细胞膜透性指直接的指标。叶绿素a是植株进行光合作用最重要的色素，其含量的高低直接影响光合作用的正常进行。SOD是目前在植物或其他组织中被发现的唯一能把超氧离子还原为H₂O₂，同时将它氧化为O₂的抗氧化酶。它作为超氧自由基清除剂，在适度逆境条件下其活性有所提高，以增强植物的抗逆能力。根据实验过程中各指标受影响状况，选取叶片相对电导率、超氧化物岐化酶SOD含量、叶绿素a含量作为确定葡萄高温胁迫的判定指标，R为高温胁迫指数，计算公式如下：

$R=r_1\×\frac{|A_{CK}-A_E|}{\left|A_{CK}\right|}+r_2\×\frac{|B_{CK}-B_E|}{\left|B_{CK}\right|}+r_3\×\frac{|C_{CK}-C_E|}{\left|C_{CK}\right|}\mathrm{...}\left(3\right)$

式(3)中：R为高温胁迫指数，A_E、Ack分别为高温处理组(T1、T2、T3、T4)与对照组(CK)的相对电导率，B_E、Bck为高温处理组与对照组的SOD含量，C_E、Cck为高温处理组与对照组的叶绿素a含量；r₁、r₂、r₃分别为叶片相对电导率、超氧化物歧化酶含量、叶绿素a含量的权重。

r₁、r₂、r₃的采用层次法进行计算的具体过程如下：

(1)r₁为叶片相对电导率的权重、r₂为超氧化物歧化酶含量的权重、r₃叶片叶绿素a含量的权重，表4为r₁相对于其他指标的重要程度比值。

表4指标r₁相对于其他指标的重要程度比值

通过对r₁、r₂和r₃的两两比较后作出的判断矩阵R如表5：

表5判断矩阵R₁(增加标号以区别于高温胁迫指数R)

(2)将判断矩阵R₁的歌横向量进行几何平均，然后归一化，得到的行向量就是权重向量。

设R₁的最大特征跟为λ_max，其相应的特征向量为W，则R₁W＝λ_maxW。计算过程如下：

①判断矩阵每一行元素的乘积

②计算Mi的n次方根

③对向量 $w={\[\stackrel{\‾}{W_1},{\stackrel{\‾}{W}}_1,\mathrm{...},\stackrel{\‾}{W_1}\]}^T$ 归一化， $w_i={\stackrel{\‾}{W}}_i/\underset{i=1}{\overset{n}{\Σ}}{\stackrel{\‾}{W}}_i,$ w_i即为指标权重。

④计算判断矩阵的最大特征根

⑤计算结果为：w_i＝0.5，w_i＝0.3，w_i＝0.2，λ_max＝3

(3)判断矩阵一致性检验：

为了度量不同阶数判断矩阵是否具有一致性，需引入判断矩阵的平均随机一致性指标RI值。1～15阶判断矩阵的RI值如表6所示，当阶数大于2，判断矩阵的一致性比率CR＝CI/RI<0.10时，即认为判断矩阵具有满意的一致性，否则需要调整判断矩阵，以使之具有满意的一致性。

表6平均随机一致性指标RI值

一致性检验计算得出CI＝0，查表6，n＝3时，RI＝0.52，CR＝0/0.52＝0＜0.1，表明该判断矩阵具有令人满意的一致性，不再需要作调整。

优化后计算公式为：

$R=5\&times;\frac{|A_{CK}-A_E|}{\left|A_{CK}\right|}+3\&times;\frac{|B_{CK}-B_E|}{\left|B_{CK}\right|}+2\&times;\frac{|C_{CK}-C_E|}{\left|C_{CK}\right|}\mathrm{...}\left(4\right).$

根据式(4)，计算计算不同程度高温处理下的葡萄叶片高温胁迫指数R如下表7所示：

表7葡萄叶片高温胁迫指数随高温胁迫时间的变化

。

第五步：葡萄植株高温胁迫等级的划分

结合表7及葡萄植株在不同程度高温处理下的生长发育情况，对高温胁迫等级进行划分：

当葡萄植株在适宜生长的温度环境下生长时，各项生理指标正常，当处于高温环境时，植株叶片受害，出现明显干枯，同时叶绿素合成受到抑制，主要进行光合作用的叶绿素a含量显著下降；高温激发叶片保护机制，超氧化物歧化酶的含量增加。根据葡萄植株在不同生长环境下表现出的各项形态生理指标，在正常生长环境下，高温胁迫指数较小，R值在0-5之间，R值越大，高温胁迫程度越深，根据R值的变化，将高温胁迫等级划分为：轻度、中度、重度、特重度四个等级，具体如下：

表8葡萄植株高温胁迫等级划分标准

。

第六步：葡萄植株高温胁迫等级确定

通过测定葡萄植株高温胁迫下的相对电导率、超氧化物岐化酶SOD含量以及叶绿素a含量，计算葡萄的高温植株胁迫指数。

实施例2：

根据实例1中的方法，利用葡萄进行高温试验，按上述步骤测定生理指标，计算出高温胁迫指数，利用高温指标判定受灾等级，结果见表9。可知随着高温胁迫程度的加重和胁迫时间的延长，R值增大越显著，T1处理下8天、T2处理6天，葡萄仍然处于轻度灾害Ⅰ；当T2处理8天、T3处理2-4天以及T4处理的初期，葡萄已经处于中度灾害Ⅱ；当T3处理超过6天，T4处理4天时，R值在15～20之间，植株受到重度灾害Ⅲ；当T4处理超过6天，葡萄植株受到特重度灾害Ⅳ。在实际生产过程中，当葡萄植株受到高温胁迫初期时，可以采取适当遮阴、合理灌溉等高温防御方式进行灾害防御，降低灾害损失，提高葡萄产量。

表9葡萄植株的高温胁迫等级随高温胁迫时间的变化

Claims (6)

1.一种葡萄植株高温胁迫等级的确定方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将处于苗期的葡萄分别进行不同程度的高温处理，测定处理后的叶片相对电导率、叶绿素a含量和超氧化物歧化酶含量，比较不同处理下测得的参数，建立葡萄高温胁迫指数的回归方程；

（2）通过步骤（1）建立的葡萄高温胁迫指数的回归方法，计算不同程度高温处理后的葡萄高温胁迫指数，结合不同程度高温处理后的葡萄植株生长状态，确定不同高温胁迫等级下高温胁迫指数的范围。

2.根据权利要求1所述的确定方法，其特征在于：所述步骤（1）中葡萄高温胁迫指数的回归方程为：；

其中，R为高温胁迫指数，A_E、B_E、C_E分别为不同程度高温处理后的叶片相对电导率、超氧化物歧化酶含量、叶绿素a含量，Ack、B_CK、C_CK分别为对照处理下的叶片相对电导率、超氧化物歧化酶含量、叶绿素a含量，分别为叶片相对电导率、超氧化物歧化酶含量、叶绿素a含量的权重；所述对照处理为：日最高温度28℃，日最低温度18℃，环境相对湿度为70%，光合有效辐射为800μmol·m^-2·s^-1；所述通过层次法确定。

3.根据权利要求2所述的确定方法，其特征在于：所述步骤（1）中葡萄高温胁迫指数的回归方程为：。

4.根据权利要求3所述的确定方法，其特征在于：所述高温胁迫等级包括轻度、中度、重度、特重度；当高温胁迫指数大于5但不超过10时，为轻度胁迫；当高温胁迫指数大于10但不超过15时，为中度胁迫；当高温胁迫指数大于15但不超过20时，为重度胁迫；当高温胁迫指数大于20时，为特重度胁迫。

5.根据权利要求1所述的确定方法，其特征在于：所述高温处理设置为4个，昼温/夜温分别为：34℃/24℃、36℃/26℃、38℃/28℃、40℃/30℃；所述对照处理的昼温/夜温为28℃/18℃；每个高温处理及对照处理的持续时间均分别进行2天、4天、6天和8天的处理，环境相对湿度为70%，光合有效辐射为800μmol·m^-2·s^-1，每个处理设置三盆重复。

6.根据权利要求1所述的确定方法，其特征在于：所述叶片相对电导率采用数字电导仪法测定；所述叶绿素a含量采用分光光度计法测定；所述超氧化物歧化酶含量采用氮蓝四唑还原法测定。