CN105052576A - 一种设施作物干旱胁迫等级的确定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种设施作物干旱等级的测定方法，将处于苗期的植株分别进行不同程度的干旱处理，测定不同处理下植株的叶片水势、根系活力以及丙二醛含量，比较不同处理下的参数，建立作物干旱胁迫指数的回归方程，判定作物干旱等级，从而确定所务受灾情况。本发明采用TTC方法测定根系活力，TBA反应法测定MDA含量，WP4-T露点水势仪测定叶片水势，综合作物各生理指标优化计算参数，确定作物干旱等级。快速、准确测定叶片水势、MDA含量以及根系活力的大小，操作可行性高，测定精密度较高，相对误差较小，能够满足设施作物干旱胁迫指标的准确计算以及干旱等级的判定。

Description

一种设施作物干旱胁迫等级的确定方法

技术领域

本发明属于作物检测技术领域，具体涉及一种设施作物干旱胁迫等级的确定方法。

背景技术

水分是作物进行光合作用最重要的底物之一，水分含量的高低直接影响作物的生长发育。只有在适合作物生长的水分环境下，才能进行正常的生命活动，水分不足或过多都会对作物的生理及其形态带来影响。研究表明：当作物遭受土壤干旱时，根系首先感受到胁迫，进而影响叶片的光合作用(左文博，2010；王磊，2007)。干旱胁迫下光合作用降低受到气孔因素和非气孔因素作用的限制，首要的表现为气孔关闭(Ephrath，1991)，气孔关闭抑制植株对CO₂的吸收，导致光系统II的活性和卡尔文循环电子需求间的不平衡，超出光合机构吸收的光能所利用的范围，叶片光合机构出现光抑制现象(ArocaR，2003、BakerNR，2004)，从而影响植株正常生长发育。土壤水分受到胁迫条件下，作物叶片蒸腾速率、气孔导度和叶片水势明显下降，细胞液浓度显著升高(EmilioN，2005；陈金平，2006)。干旱胁迫下，苜蓿叶水势、蒸腾速率(Tr)、气孔导度(Gs)均随水分胁迫加剧而降低，最低叶片水势随土壤水分降低而降低(罗永忠，2011)。迄今为止，国内外对于干旱胁迫的研究主要集中于对作物光合及其生理作用的影响，光合以及生理过程的研究有利于我们进一步探讨植物在逆境胁迫下的响应机制，对于提高作物产量有重大意义。

我国是一个降水时空分布不均的国家，随着全球气候变化的加剧，干旱灾害呈现出频度增高、危害加重、复杂多变的趋势，给作物生长带来极其重要的影响。同时也严重影响设施作物的生长发育以及产量构成。设施作物生理指标的测定包括：TTC方法测定根系活力、硫代巴比妥酸(TBA)反应法测定丙二醛(MDA)含量、WP4-T露点水势仪测定叶片水势、分光光度计法测定叶绿素含量，光合参数采用Li-6400测定等。然而单独研究干旱对某一指标的影响具有一定局限性，目前关于确定设施作物干旱指标的综合测定方法前人研究较少，尚未有相适宜的测定方法研究成果。本发明综合评估多种生理指标，主要确定干旱胁迫下设施作物发生干旱指标，对设施作物耐旱性品种的选育、科学田间管理以及干旱防御具有重要的指导意义。

发明内容

发明目的：为了克服现有技术中存在的不足，为了研究干旱在设施作物生长发育过程中的影响，本发明提供一种设施作物干旱等级的测定方法，通过研究生理指标，综合考虑干旱对设施作物根系、水势以及叶片保护酶等指标，确定设施作物的干旱指标，为设施作物的栽培管理和干旱防御提供科学的指导作用。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种设施作物干旱胁迫等级的确定方法，包括以下步骤：

1)设施作物干旱试验：将处于苗期的作物进行不同田间持水量的灌溉培养处理；

2)作物生理指标的测定：包括叶片水势、根系伤害力、丙二醛含量；

3)设施作物干旱胁迫指数Q的计算：根据作物生理指标数据计算；

4)设施作物干旱等级的划分：根据干旱胁迫指数Q划分。

进一步的，在本发明中，步骤1)中，设置4个水分处理组，分别为：正常灌溉T₁，作为对照组，灌溉量为田间最大持水量的70％～80％；轻度胁迫T₂，灌溉量为田间最大持水量的60％～70％；中度胁迫T₃，灌溉量为田间最大持水量的50％～60％；重度胁迫T₄，灌溉量为低于田间最大持水量的50％。

进一步的，在本发明中，步骤2)中，所述叶片水势的测定方法为：采用WP4-T露点水势仪，设施作物的室温为25℃，作物与室温之间的温差＜1℃，测定其叶片水势。

进一步的，在本发明中，步骤2)中，所述根系活力的测定方法为：

(2-1)取0.4％TTC溶液加Na₂S₂O₄生成TTF，用乙酸乙酯定容成一次溶液，分别取不同量的所述一次溶液用乙酸乙酯定容，得到含TTF浓度分别为0.5％、1％、1.5％、2％、3％的标准比色系列，以乙酸乙酯为空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线；

(2-2)设施作物的根洗净，吸干根部表面水分，置于烧杯中，其中空白对照组预先加入硫酸；加入0.4％TTC溶液和0.1mol·L^-1磷酸缓冲液等量混合液，37℃下暗处保温，再加入1mol·L^-1硫酸停止反应；

(2-3)把根取出吸干水分，与乙酸乙酯和石英砂研磨，提取TTC；收集红色提取液，在485nm波长下测定吸光度，以乙酸乙酯为空白作参比读出光密度，查步骤(2-1)所绘制的标准曲线得到四氮唑还原量，再经公式计算得到四氮唑还原强度，公式如下：

$R_a=\frac{MT}{M\×t}$

其中：Ra：四氮唑还原强度，MT：四氮唑还原量(μg)，M：根重(g)，t：保温时间(h)；

R_d＝100/R_a

其中：R_d为根系伤害力。

进一步的，在本发明中，步骤(2-2)中，所述37℃下暗处保温时间为1h。

进一步的，在本发明中，步骤2)中，所述丙二醛含量的测定方法为：

(3-1)取KH₂PO₄溶液和K₂HPO₄·3H₂O溶液混合，制备0.05MpH7.8磷酸缓冲液；

(3-2)取TBA，先用NaOH溶解，再用10％TCA定容，制备0.6％TBA；

(3-3)取设施作物，加入所述磷酸缓冲液，冰浴研磨匀浆；4℃冷冻离心20’，转速为4000r/min；收集上清液即所得MDA酶液，0-4℃下保存；

(3-4)取所述酶液和0.6％TBA液，封口沸水浴15min，迅速冷却，进行4000r/min离心10min，取上清液分别在600、532、450nm波长下测定吸光度；

丙二醛含量的计算公式如下：

MDA＝(6.45×(D₅₃₂-D₆₀₀)-0.56×D₄₅₀)×0.015/W

其中：D₆₀₀为样品在600nm处的吸光度值，D₅₃₂为样品在532nm处的吸光度值，D₄₅₀为样品在450nm处的吸光度值；W为样品重。

进一步的，在本发明中，步骤3)中，所述干旱胁迫指数的计算方法为：

$Q=4\×\frac{|X_{ck}-X|}{\left|X\right|}+3\×\frac{Y_{ck}-Y}{Y}+3\×\frac{Z_{ck}-Z}{Z}$

其中：Q为干旱胁迫指数，X、X_ck分别为干旱组与对照组的叶片水势，Y、Y_ck为干旱组与对照组的丙二醛含量，Z、Z_ck为干旱组与对照组的根系伤害力。

进一步的，在本发明中，步骤4)中，所述干旱等级的划分方法为：

在设施作物适宜生长的水分条件下，作物正常生长，0＜Q≤1。当Q值大于1时，作物即受到干旱胁迫，Q值越大，干旱胁迫程度越深。根据Q值的变化，将干旱灾害分为轻度、中度、重度、特重度四个等级，设施作物具体的干旱灾害等级划分标准如下：

表1设施作物干旱胁迫等级划分

有益效果：本发明提供的，与现有技术相比，本发明采用TTC方法测定根系活力，硫代巴比妥酸(TBA)反应法测定丙二醛(MDA)含量，WP4-T露点水势仪测定叶片水势，综合设施作物各项生理指标，优化计算参数，确定作物干旱等级。可以快速、准确测定叶片水势、丙二醛MDA含量以及根系活力的大小，操作可行性高，测定的精密度较高，相对误差较小，能够满足设施作物干旱胁迫指标的准确计算以及干旱等级的判定。

附图说明

图1为本发明方法的工艺流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作更进一步的说明。

为探索设施作物的干旱等级判定方法，本发明采用TTC方法测定根系活力，硫代巴比妥酸(TBA)反应法测定丙二醛(MDA)含量，WP4-T露点水势仪测定叶片水势，综合植株各项生理指标，优化计算参数，确定作物干旱等级。技术方案如下：

如图1所示，将处于苗期的植株分别进行不同程度的干旱处理，测定不同处理下植株的叶片水势、根系活力以及丙二醛含量，比较不同处理下测得的参数，建立作物干旱胁迫指数的回归方程，判定花椰菜干旱等级，从而确定花椰菜受灾情况。

实施例1

第一步：设施作物干旱试验

将处于苗期的作物移栽至塑料盆中，试验期间，设置4个水分处理，正常灌溉T1(田间最大持水量的70％～80％)为对照组，轻度胁迫T2(田间最大持水量的60％～70％)，中度胁迫T3(田间最大持水量的50％～60％)，重度胁迫T4(田间持水量<50％)，每个处理设置三盆重复。

第二步：仪器设备与药品准备

(1)仪器设备

10-1000μL、1000-5000μLDRAGONLAB可调式移液枪，上海万岛仪器科技有限公司；

紫外分光光度计，日本岛津公司；

WP4-T露点水势仪，北京力高泰科技有限公司；

数显恒温水浴锅，国华电器有限公司；

电子天平，奥豪斯仪器(上海)有限公司；

Sigma台式高速冷冻离心机3K15，北京五洲东方科技发展有限公司；

医用低速离心机，江苏正基仪器有限公司。

(2)药品试剂

红四氮唑，分析纯，上海科峰化学试剂有限公司，上海；

乙酸乙酯，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

浓硫酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

琥珀酸钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

低亚硫酸钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

磷酸二氢钾，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

十二水合磷酸氢二钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

硫代巴比妥酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

氢氧化钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

三氯乙酸，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司，上海；

磷酸氢二钾，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；

石英砂，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海。

第三步：花椰菜生理指标的测定

(1)叶片水势的测定

采用WP4-T露点水势仪(DecagonDevices,Inc.,USA)，设施样品室温度为25℃，样片与样品室温度差＜1℃，在上午10:00左右，选取生长良好的新鲜花椰菜功能叶，测定其叶片水势LWP并记录。

(2)根系活力的测定

(2-1)取0.4％TTC(红四氮唑)溶液0.2ml放入10ml量瓶中，加少许Na₂S₂O₄粉摇匀后产生红色的TTF(三苯甲腙)。乙酸乙酯定容至刻度，摇匀。然后分别取此液0.5ml、1.00ml、1.50ml、2.00ml、3.00ml置10ml容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度，即得到TTF浓度分别为0.5％、1％、1.5％、2％、3％的标准比色系列，以空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线；

(2-2)把根仔细洗净，用吸水纸吸干根部表面水分，称取根样品0.5g，分别放入小烧杯中(空白试验先加入硫酸再加入根样品，其他操作相同)，加入0.4％TTC溶液和0.1mol·L^-1磷酸缓冲液等量混合液10ml，把根充分浸没在溶液中，37℃条件下暗处保温1h，此后加入1mol·L^-1硫酸2ml，以停止反应；

(2-3)把根取出，吸干水分后与乙酸乙酯(共10ml)和少量石英砂研磨，提取TTC；将红色提取液移入试管中，用分光光度计在485nm下比色，以空白作参比读出光密度，查(2-1)所绘制标准曲线得到四氮唑还原量，再经公式计算得到四氮唑还原强度，公式如下：

$R_a=\frac{MT}{M\&times;t}---\left(1\right)$

其中：Ra：四氮唑还原强度，MT：四氮唑还原量(μg)，M：根重(g)，t：保温时间(h)；

R_d＝100/R_a(2)

其中：R_d为根系伤害力。

(3)丙二醛MDA含量的测定

(3-1)取分析纯KH₂PO₄27.216g用蒸馏水定容到1000ml作为A液，另取分析纯K₂HPO₄·3H₂O45.644g，定容至1000ml，作为B液；取21.25ml的A液+228.25ml的B液混合，用蒸馏水定容至1000ml，得到0.05M磷酸缓冲液(PH7.8)；

(3-2)取0.6gTBA(硫代巴比妥酸)，先用少量NaOH溶解，再用10％TCA(三氯乙酸)定容至100ml；(10％TCA：取10gTCA用蒸馏水定容至100ml)；

(3-3)称取0.5g样品放入研钵中，加入5mlPH7.8的磷酸缓冲液，冰浴研磨，匀浆倒入离心管中，冷冻离心20’(转速为4000r/min，4℃)，上清液即所得MDA酶液，倒入试管，置于0-4℃下保存待用；

(3-4)取1mL酶液和2mL0.6％TBA反应液(含0.6g硫代巴比妥酸，10％三氯乙酸)于离心管中，封口沸水浴15min，迅速冷却，之后进行4000r/min离心10min，取上清液分别在600、532、450nm波长下比色；MDA含量的计算公式如下：

MDA＝(6.45×(D₅₃₂-D₆₀₀)-0.56×D₄₅₀)×0.015/W(3)

其中：D₆₀₀为样品在600nm处的吸光度值，D₅₃₂为样品在532nm处的吸光度值，D₄₅₀为样品在450nm处的吸光度值；W为样品重。

第四步：设施作物干旱胁迫指数的计算

叶片水势LWP是反映植物缺水程度的最灵敏的指标，可以反映土壤—植物—大气系统(SPAC)中水分的流动。MDA是膜脂过氧化分解的主要产物之一，其含量与植物受伤害程度呈正相关。根部是植株吸收土壤水分以及营养元素最重要的通道，根系伤害力Rd则是植株根系受伤害程度，是反映根系生命力的综合指标，根据实验过程中各指标受影响状况，选取叶片水势LWP、丙二醛MDA含量、根系伤害率Rd作为确定花椰菜受灾的判定指标，Q为干旱胁迫指数，综合比较干旱胁迫下各指标变化趋势以及变化程度，计算公式如下：

$Q=4\&times;\frac{|X_{ck}-X|}{\left|X\right|}+3\&times;\frac{Y_{ck}-Y}{Y}+3\&times;\frac{Z_{ck}-Z}{Z}---\left(4\right)$

其中：Q为干旱胁迫指数，X、Xck分别为干旱组与对照组的叶片水势，Y、Yck为干旱组与对照组的MDA含量，Z、Zck为干旱组与对照组的根系伤害力。

第五步：设施作物干旱等级的划分

在设施作物适宜生长的水分条件下，作物正常生长，0＜Q≤1。当Q值大于1时，作物即受到干旱胁迫，Q值越大，干旱胁迫程度越深。根据Q值的变化，将干旱灾害分为轻度、中度、重度、特重度四个等级，设施作物具体的干旱灾害等级划分标准如下表1所示。

表1设施作物干旱胁迫等级划分

第六步：设施作物干旱等级确定

测定设施作物干旱胁迫下的叶片水势LWP、丙二醛MDA含量以及根系伤害率Rd，计算设施作物干旱胁迫指数。

实施例2

根据实施例1的方法，利用花椰菜进行干旱试验，设置4个水分处理，正常灌溉T₁(田间最大持水量的70％～80％)，作为对照组，轻度胁迫T₂(田间最大持水量的60％～70％)，中度胁迫T₃(田间最大持水量的50％～60％)，重度胁迫T₄(田间持水量<50％)。灌溉初期，各处理的10cm处土壤体积含水率分别为：T₁为48.5％，T2为32.4％，T₃为29.1％，T₄为21.6％。随着灌溉后天数的增加，土壤含水量缓慢下降，在灌溉后第3天，各处理的土壤含水量趋于平稳并且逐渐接近，各处理土壤含水率分别为:T₁为25.1％，T₂为21.0％，T₃为19.5％，T₄为17.9％；试验期间环境温度为23℃/17℃，相对空气湿度为72％，光合有效辐射为800μmol·m^-2·s^-1。每个处理设置3盆重复。按上述步骤测定生理指标，见表2-1，2-2，2-3，再根据公式计算出干旱胁迫指数，利用干旱指标判定受灾等级，结果见表3。

由表可知在干旱胁迫下，花椰菜叶片水势以及根系活力均出现显著下降，而丙二醛MDA含量则相反出现显著的增加。干旱胁迫指数Q变化与MDA相似，干旱胁迫时间的越长、胁迫程度愈严重，Q值越大。由表3可知，T2处理前9天内，Q＜3，属于轻度灾害Ⅰ，当干旱超过9天后，Q明显增大，为中度灾害Ⅱ，当T2处理持续时间超过15天时，为重度灾害Ⅲ；T3处理下，干旱胁迫前期前三天，Q＜3，为轻度灾害Ⅰ，干旱超过3天至第9天，为中度灾害Ⅱ，当干旱时间超过9天，Q显著增大，达到重度灾害Ⅲ；T4处理下，前三天为轻度灾害Ⅰ，干旱胁迫6天时，为中度灾害Ⅱ，当胁迫处理9～12天时，为重度灾害Ⅲ，当超过15天时，Q明显增加，为特重度灾害Ⅳ。

表2-1干旱胁迫对花椰菜叶片水势的影响

表2-2干旱胁迫对花椰菜根系伤害力的影响

表2-3干旱胁迫对花椰菜MDA含量的影响

表3干旱胁迫指数随时间的响应

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种设施作物干旱胁迫等级的确定方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)设施作物干旱试验：将处于苗期的作物进行不同田间持水量的灌溉培养处理；

2)作物生理指标的测定：包括叶片水势、根系伤害力、丙二醛含量；

3)设施作物干旱胁迫指数Q的计算：根据作物生理指标数据计算；

4)设施作物干旱等级的划分：根据干旱胁迫指数Q划分。

2.根据权利要求1所述的设施作物干旱胁迫等级的确定方法，其特征在于：步骤1)中，设置4个水分处理组，分别为：正常灌溉T₁，作为对照组，灌溉量为田间最大持水量的70％～80％；轻度胁迫T₂，灌溉量为田间最大持水量的60％～70％；中度胁迫T₃，灌溉量为田间最大持水量的50％～60％；重度胁迫T₄，灌溉量为低于田间最大持水量的50％。

3.根据权利要求1所述的设施作物干旱胁迫等级的确定方法，其特征在于：步骤2)中，所述叶片水势的测定方法为：采用WP4-T露点水势仪，设施作物的室温为25℃，作物与室温之间的温差＜1℃，测定其叶片水势。

4.根据权利要求1所述的设施作物干旱胁迫等级的确定方法，其特征在于：步骤2)中，所述根系活力的测定方法为：

(2-1)取0.4％TTC溶液加Na₂S₂O₄生成TTF，用乙酸乙酯定容成一次溶液，分别取不同量的所述一次溶液用乙酸乙酯定容，得到含TTF浓度分别为0.5％、1％、1.5％、2％、3％的标准比色系列，以乙酸乙酯为空白作参比，在485nm波长下测定吸光度，绘制标准曲线；

(2-2)设施作物的根洗净，吸干根部表面水分，置于烧杯中，其中空白对照组预先加入硫酸；加入0.4％TTC溶液和0.1mol·L^-1磷酸缓冲液等量混合液，37℃下暗处保温，再加入1mol·L^-1硫酸停止反应；

(2-3)把根取出吸干水分，与乙酸乙酯和石英砂研磨，提取TTC；收集红色提取液，在485nm波长下测定吸光度，以空白作参比读出光密度，查(2-1)所绘制标准曲线得到四氮唑还原量，再经公式计算得到四氮唑还原强度，公式如下：

$R_a=\frac{MT}{M\&times;t}$

其中：Ra：四氮唑还原强度，MT：四氮唑还原量(μg)，M：根重(g)，t：保温时间(h)；

R_d＝100/R_a

其中：R_d为根系伤害力。

5.根据权利要求4所述的设施作物干旱胁迫等级的确定方法，其特征在于：步骤(2-2)中，所述37℃下暗处保温时间为1h。

6.根据权利要求1所述的设施作物干旱胁迫等级的确定方法，其特征在于：步骤2)中，所述丙二醛含量的测定方法为：

(3-1)取KH₂PO₄溶液和K₂HPO₄·3H₂O溶液混合，制备0.05MpH7.8磷酸缓冲液；

(3-2)取TBA，先用NaOH溶解，再用10％TCA定容，制备0.6％TBA；

(3-3)取设施作物，加入所述磷酸缓冲液，冰浴研磨匀浆；4℃冷冻离心20’，转速为4000r/min；收集上清液即所得MDA酶液，0-4℃下保存；

(3-4)取所述酶液和0.6％TBA液，封口沸水浴15min，迅速冷却，进行4000r/min离心10min，取上清液分别在600、532、450nm波长下测定吸光度；

丙二醛含量的计算公式如下：

MDA＝(6.45×(D₅₃₂-D₆₀₀)-0.56×D₄₅₀)×0.015/W

其中：D₆₀₀为样品在600nm处的吸光度值，D₅₃₂为样品在532nm处的吸光度值，D₄₅₀为样品在450nm处的吸光度值；W为样品重。

7.根据权利要求1所述的设施作物干旱胁迫等级的确定方法，其特征在于：步骤3)中，所述干旱胁迫指数的计算方法为：

$Q=4\&times;\frac{|X_{ck}-X|}{\left|X\right|}+3\&times;\frac{Y_{ck}-Y}{Y}+3\&times;\frac{Z_{ck}-Z}{Z}$

其中：Q为干旱胁迫指数，X、X_ck分别为干旱组与对照组的叶片水势，Y、Y_ck为干旱组与对照组的丙二醛含量，Z、Z_ck为干旱组与对照组的根系伤害力。

8.根据权利要求1所述的设施作物干旱胁迫等级的确定方法，其特征在于：步骤4)中，所述干旱等级的划分方法为：

在设施作物适宜生长的水分条件下，作物正常生长，0＜Q≤1。当Q值大于1时，作物即受到干旱胁迫，Q值越大，干旱胁迫程度越深。根据Q值的变化，将干旱灾害分为轻度、中度、重度、特重度四个等级，设施作物具体的干旱灾害等级划分标准如下：

表1设施作物干旱胁迫等级划分