CN107581061B - 一种油菜种子灌浆期高温耐受性高效筛选鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种油菜种子灌浆期高温耐受性高效筛选鉴定方法，包括以下步骤：油菜材料选择；将各待筛选的油菜材料在常规条件下种植；标记同一天开花的花朵，并取若干偶数个角果；每个油菜材料所取角果混合后，平均分为两组，并将所有组角果分别以角果柄插入植物培养基，装有各油菜材料角果的容器分别放入适温组和高温组植物生长箱或生长室中；角果培养环境设置；测量各处理样品灌浆期高温耐受性相关生物学指标；耐高温油菜材料筛选。本发明操作性强、准确性高、重复性好、鉴定效率高、省时省能耗，在耐热性品种选育和预测品种的生态适应性中具有广泛的应用前景，为油菜种子灌浆期高温耐受性遗传改良提供技术基础。

Description

一种油菜种子灌浆期高温耐受性高效筛选鉴定方法

技术领域

本发明涉及作物育种技术领域，特别涉及一种油菜种子灌浆期高温耐受性高效筛选鉴定方法。

背景技术

高温胁迫严重影响作物生长发育，是作物稳产高产的主要威胁。油菜种子发育期日平均温度与含油量呈负相关，油菜成熟期气温在20℃以上、光照充足、昼夜温差大、土壤湿度适宜有利于油分积累，产量和含油量高；而温度过高，会导致“高温逼熟”，植株衰老加速、灌浆期缩短，千粒重和含油量降低。近百年来，全球气候变暖趋势明显，我国长江中下游地区初夏高温热浪日趋提前，油菜灌浆期经常会遭遇短期高温，高温胁迫对油菜等作物的不利影响日渐显现，生产的不稳定性显著增加。提高油菜等作物的高温耐受性，建立高效、可靠的油菜种子灌浆期高温耐受性高效筛选技术是油菜耐高温基因型筛选和遗传改良的基础，对快速准确地鉴定和筛选油菜耐热材料、提高育种效率具有重要意义。然而到目前为止，尚未建立稳定、重复性好的的油菜种子灌浆期高温耐受性高效筛选技术，这不仅阻碍了耐热油菜品种的培育，也削弱了对育成的油菜品种生态适应性的预判。

现有的作物高温耐受性鉴定方法主要可分为田间直接鉴定、人工模拟直接鉴定和间接鉴定等3类。田间直接鉴定法是在自然高温条件下，以作物较为直观的性状变化指标为依据来评价作物品种的高温耐受性。该方法具有评价客观的特点,但试验结果易受其他环境因素的影响，重复性较差，为获得可靠的结果，须进行多年多点的重复鉴定，费工费时。人工模拟直接鉴定法是在模拟的高温胁迫条件下通过直观性状变化指标对作物高温耐受性进行评价，这种方法能克服田间鉴定的缺点，逆境条件容易控制，但受设备投资和能源消耗等因素的限制，难以对大批量的材料进行鉴定，尤其不适合对油菜这样植株高大作物的大规模筛选鉴定。间接鉴定法是利用植物产生的应激性生理反应，高温耐受性不同的作物品种在高温胁迫下会在许多生理生化指标上存在显著差异，这些可以作为评价作物高温耐受性的间接指标。现已报道诸多作物高温耐受性间接鉴定方法，如通过测定电解质渗透率、细胞膜的热稳定性，丙二醛、脯氨酸含量、SOD活性、POD活性、CAT活性等生理指标，从而间接鉴定作物高温耐受性。虽然这些方法在植物营养生长期高温耐受性筛选鉴定中发挥了重要作用，但由于植物的生殖生长阶段与营养生长阶段在基因表达、生理生化反应以及生长发育调节等诸方面均有着显著差别，植物营养生长期的高温耐受性并不一定与生殖生长期高温耐受性一致，对油菜这样以收获种子为生产目标的作物，更需要建立油菜种子灌浆期高温耐受性高效筛选技术。

为此，迫切需要找到针对油菜种子灌浆期高温耐受性的高效筛选技术。本发明提供了一个可行的解决方案，为大规模、快速、准确的评价油菜品种、种质资源高温耐受性提供科学标准和方法，适合在油菜耐热种质资源挖掘，高温耐受性品种选育和预测品种的生态适应性中推广应用，为油菜种子灌浆期高温耐受性遗传改良提供技术基础。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明专利提供了一种灌浆期高温耐受性油菜种子高效筛选鉴定方法，此方法操作性强、省时省能耗、准确性高、重复性好、鉴定效率高，能有效地区分油菜品种、材料高温耐受性的差异，适合在油菜耐热种质资源挖掘，耐热性品种选育和预测品种的生态适应性中推广应用，为油菜种子灌浆期高温耐受性遗传改良提供技术基础。

为了实现上述发明目的，本发明的技术问题主要通过下述技术方案得以解决：一种油菜种子灌浆期高温耐受性高效筛选鉴定方法，包括以下步骤：

A、油菜材料选择：各待筛选油菜材料采用正常成熟的油菜种子；

B、油菜种植：将各待筛选的油菜材料在常规条件下种植，各油菜材料种植条件均相同；

C、取角果：油菜植株到达盛花期时，每个油菜品种选择10株以上形态、长势一致的植株，在晴好天气标记同一天开花的花朵，在开花后的一个或多个时期在标记花朵的植株上取由标记花朵生长而成的大小相似、带有角果柄的若干偶数个角果；

D、角果处理：将每个油菜材料所取的角果混合后，平均分为两组，并将所有组角果分别以角果柄插入植物培养基，将装有每个油菜材料角果的培养容器分别放入两个相同型号的植物生长箱或相同的生长室中，一组设为适温组，另一组设为高温组；

E、角果处理环境设置：光照时间设置为长日照，即大于12小时，较佳的为每天光照时间14～16小时，环境湿度50％～70％，适温组温度设置在18℃～25℃之间，光照时段的温度不低于黑暗时段；高温组的温度需始终不低于相应时间适温组的温度，并在光照时段进行35℃～42℃的高温处理，高温处理时间每天不少于5小时，各样品需连续处理2天以上，并以连续处理3天以上为佳；

F、测量各处理样品灌浆期高温耐受性相关生物学指标：温度处理结束后，从各培养角果中分离种子，将一定数量种子装入已称重滤纸包，烘干，并采用索氏抽提法测定各样品种子含油量(％)、单粒种子油脂量；

G、耐高温油菜材料筛选：根据高温组的种子含油量(％)、种子油脂量较适温组种子相应值的变化率，筛选出灌浆期高温耐受性强的油菜材料。

进一步的，所述索氏抽提法的抽提试剂为无水乙醚或低沸点石油醚。

进一步的，所述测量角果种子含油量的计算公式为：

其中，a为空滤纸包重(mg)，b为滤纸包加样品重(mg)，c为滤纸包加抽提后烘干残渣重(mg)。

进一步的，所述测量角果种子单粒种子油脂量的计算公式为：

其中，d为种子数量。

本发明的有益效果：本发明操作性强、省时省能耗、准确性高、重复性好、鉴定效率高，能有效地区分油菜品种、材料高温耐受性的差异，适合在油菜耐热种质资源挖掘，耐热性品种选育和预测品种的生态适应性中推广应用，为油菜种子灌浆期高温耐受性遗传改良提供技术基础。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

实施例

一种油菜种子灌浆期高温耐受性高效筛选鉴定方法，包括以下步骤：

A、材料选择：挑选经多年、多地种植筛选出的种子含油量和对环境反应均具有明显差异的甘蓝型油菜材料HS1～HS6共6种油菜；其中HS1～HS2为高含油量油菜，田间种质含油量约为50％；HS3～HS4为中含油量油菜，田间种质含油量为42％～47％；HS5～HS6为低含油量油菜，田间种质含油量为36％～41％；HS1、HS3、HS5对环境温度反应钝感，HS2、HS4、HS6对环境温度反应敏感；

B、油菜种植：将不同油菜材料在田间种植，各试验材料在相同条件下按常规油菜栽培技术进行管理。

C、取角果：油菜植株到达盛花期时，每个油菜材料选择10株以上形态、长势一致的植株，在晴好天气标记同一天开花的花朵，在开花后的一个或多个时期在标记植株上取由标记花朵生长而成的大小相似、带有角果柄的若干偶数个角果；

D、角果处理：将每个油菜材料所取的角果混合后，平均分为两组，并将所有组角果分别以角果柄插入植物培养基，将装有每个油菜材料角果的培养容器分别放入两个相同型号的植物生长箱或相同的生长室中，一组设为适温组，另一组设为高温组；

E、角果处理环境设置：植物生长箱每天5：00～19：00设为白天，19：00～5：00设为夜间，环境湿度均为60％，夜间温度均设为18℃，适温组白天温度设为23℃，高温组5：00迅速升温至23℃，10:00升温至37℃，维持37℃高温7小时到17：00，然后迅速降温至23℃，到19：00开始夜间培养时迅速降温到18℃；

F、测量经处理的油菜材料种子含油量(％)和单粒种子油脂量：经温度处理3天后，从各油菜样品角果中取出种子，按100粒/包将种子放入已称重的滤纸包，烘干后称重；将称重过的样品包放入索氏抽提器充分抽提出油脂，对抽油后的样品包称重，计算出各油菜样品的种子含油量(％)、单粒种子油脂量，每一处理样品重复测定4次；

角果高温处理对种子含油量(％)和单粒种子油脂量的影响分别如表1和表2所示；

表1 角果高温处理对种子含油量(％)的影响

表2 角果高温处理对单粒种子油脂量的影响

G、筛选耐热油菜材料：根据各油菜材料角果高温处理后的种子含油量(％)、单粒种子油脂量较适温组变化程度，筛选出灌浆期高温耐受性强的油菜材料。

所述索氏抽提法的抽提试剂为无水乙醚或低沸点石油醚。

所述测量角果种子含油量的计算公式为：

其中，a为空滤纸包重(mg)，b为滤纸包加样品重(mg)，c为滤纸包加抽提后烘干残渣重(mg)。

所述测量角果种子单粒种子油脂量的计算公式为：

其中，d为种子数量。

为了验证对比，采用人工模拟直接鉴定的方法，鉴定HS1～HS6共6种油菜在种子灌浆期的高温耐受性。实验的步骤如下：

A、油菜材料选择：挑选经多年、多地种植筛选出的种子含油量和对环境反应均具有明显差异的甘蓝型油菜材料HS1～HS6共6种油菜；其中HS1～HS2为高含油量油菜，田间种质含油量约为50％；HS3～HS4为中含油量油菜，田间种质含油量为42％～47％；HS5～HS6为低含油量油菜，田间种质含油量为36％～41％；HS1、HS3、HS5对环境温度反应钝感，HS2、HS4、HS6对环境温度反应敏感；

B、盆栽种植：将不同品种的油菜材料种入盆中，每盆1株，每1材料种植20株，在常规条件下盆栽种植，盆大小、盆中土质和土量、定期施加的水量和肥量、光照强度等均相同；

C、植株分组：在油菜灌浆期，每个油菜材料各取8株形态、长势一致的植株，平均分成2组；

D、生长环境设置：将挑选出的2组植株分别移入2个面积相同的人工气候室，人工气候室的湿度均设置为湿度60％，光照强度设置为300mE·m-2·s-1，每天5：00～19：00设为白天，19：00～5：00设为夜间；一个人工气候室作为高温组，5：00～10：00从23℃逐渐升温至35℃，维持35℃高温4小时到14：00，14：00到19：00期间从35℃逐渐降温至23℃；另一个人工气候室作为适温组，白天温度设为23℃；两个人工气候室的夜间温度均设为18℃；

E、继续培植：在人工气候室生长15天后，将所有植株从人工气候室移出，在相同的常规条件下继续培植至各油菜植株正常成熟；

F、测量植株种子含油量和单株产油量：各油菜植株分单株收获种子，测量成熟种子含油量和单株产油量，植株高温处理对各油菜材料种子含油量和单株产油量的影响分别如表3和表4所示；

表3 植株高温处理对油菜种子含油量的影响

表4 植株高温处理对油菜单株产油量的影响

G、筛选油菜材料：根据高温处理的植株上种子含油量、单株产油量较适温组变化程度筛选出灌浆期高温耐受性强的油菜材料。

由表1、表2可以看出，各角果经3天离体高温处理后，种子含油量和单粒种子油脂量较其相应的适温组材料均显著下降，表明油菜灌浆期角果即便经历短期的高温胁迫处理也会对油菜种子油脂积累造成明显的不良影响。对比表1和表2中高、中、低含油量温度钝感和温度敏感型油菜角果高温处理后种子含油量和单粒种子油脂量测量结果可以发现，不论是种子含油量还是单粒种子油脂量，HS1的高温处理下降率均低于HS2，HS3的高温处理下降率均低于HS4，HS5的高温处理下降率均低于HS6，说明HS1、HS3、HS5是高温钝感型油菜材料，HS2、HS4、HS6是高温敏感型油菜材料。

从表3、表4可以看出，不论高、中、低含油量油菜品种，植株经高温处理后，种子含油量和单株产油量均有所下降，且以单株产油量的下降幅度更为明显，证明高温胁迫确实是影响油菜油脂积累、降低其经济效益的重要环境因素。对比表3和表4中高、中、低温度钝感和温度敏感型油菜植株高温处理后种子含油量和单株产油量测量结果可以发现，不论是种子含油量还是单株产油量，HS1的高温处理下降率均低于HS2，HS3的高温处理下降率均低于HS4，HS5的高温处理下降率均低于HS6。

通过本发明的筛选鉴定方法与人工模拟直接鉴定的方法的对比可以发现，两种鉴定方法得到的HS1～HS6六种油菜材料高温处理影响趋势完全一致，表明本发明在油菜灌浆期采用角果离体高温处理后分析种子含油量和单粒种子油脂量的方法，可以准确反映各油菜材料的灌浆期高温耐受性，由于本发明角果高温离体处理只需3天，说明本发明的方法保证鉴定高效率的同时，不失鉴定准确性。

本发明的筛选鉴定方法与人工模拟直接鉴定方法能耗及电费消耗比较：本发明的筛选鉴定方法对6个油菜材料的处理需使用2个植物生长箱3天，每个植物生长箱耗电<3度，每次高温处理需用电<18度，所需电费<20元。采用人工模拟直接鉴定方法，对6个油菜材料的高温筛选使用了2个8m2的人工气候室，15天共耗电～4000度，所需电费>4000元。说明本发明的方法可大幅度减少能耗和电费。

本发明的有益效果：本发明操作性强、准确性高、重复性好、鉴定效率高，高温处理时间由人工模拟直接鉴定法的15～30天缩短为3天，效率提高了5～10倍，能有效地区分目前油菜材料高温耐受性的差异，适合在油菜耐热种质资源挖掘，耐热性品种选育和预测品种的生态适应性中推广应用，为油菜种子灌浆期高温耐受性遗传改良提供技术基础。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (2)

1.一种油菜种子灌浆期高温耐受性高效筛选鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

A、油菜材料选择：各待筛选油菜材料采用正常成熟的油菜种子；

B、油菜种植：将各待筛选的油菜材料在常规条件下种植，各油菜材料种植条件均相同；

C、取角果：油菜植株到达盛花期时，每个油菜品种选择10株以上形态、长势一致的植株，在晴好天气标记同一天开花的花朵，在开花后的一个或多个时期在标记花朵的植株上取由标记花朵生长而成的大小相似、带有角果柄的偶数个角果；

D、角果处理：将每个油菜材料所取的角果混合后，平均分为两组，并将所有组角果分别以角果柄插入植物培养基，将装有每个油菜材料角果的培养容器分别放入两个相同型号的植物生长箱或相同的生长室中，一组设为适温组，另一组设为高温组；

E、角果处理环境设置：每天光照时间为14～16小时，环境湿度50％～70％，适温组温度设置在18℃～25℃之间，光照时段的温度不低于黑暗时段；高温组的温度始终不低于相应时间适温组的温度，并在光照时段进行35℃～42℃的高温处理，高温处理时间每天不少于5小时，各样品连续处理3天以上；

F、测量各处理样品灌浆期高温耐受性相关生物学指标：温度处理结束后，从各培养角果中分离种子，将一定数量种子装入已称重滤纸包，烘干，并采用索氏抽提法测定各样品种子含油量、单粒种子油脂量；所述测量角果种子含油量的计算公式为：

其中，a为空滤纸包重，b为滤纸包加样品重，c为滤纸包加抽提后烘干残渣重；所述测量角果种子单粒种子油脂量的计算公式为：

其中，d为种子数量；

G、耐高温油菜材料筛选：根据高温组的种子含油量、种子油脂量较适温组种子相应值的变化率，筛选出灌浆期高温耐受性强的油菜材料。

2.根据权利要求1所述的一种油菜种子灌浆期高温耐受性高效筛选鉴定方法，其特征在于，所述索氏抽提法的抽提试剂为无水乙醚或低沸点石油醚。