CN103125371B - 一种作物抗旱突变体田间快速辅助筛选的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种作物抗旱突变体田间快速辅助筛选的方法，包括步骤：1)热红外图像采集；2）温度分布特征参数提取：对采集的热红外图像进行图像处理；3）特征参数指标筛选：在步骤2）提取出的特征参数中，筛选出表征作物抗旱性差异的特征参数；4）阈值确定；5）被筛选作物的抗旱性等级计算：查看步骤3）所得参数的对应的抗旱等级区间，确定该突变体的抗旱等级。本发明应用了红外热成像技术，建立基于红外热成像的作物抗旱突变体筛选方法，此方法可以实现田间的快速、无损筛选。相对于传统的作物抗旱突变体筛选方法，系统携带方便、简单易操作、测量周期短、检测成本低、鉴定精度高。
Description
技术领域
本发明属于作物育种方法及技术手段的领域，具体涉及一种选择抗旱的育种材料的方法。
背景技术
随着全球气候变暖，干旱缺水现象日益加重，干旱成为限制作物生产的主要环境因子之一。目前，世界上干旱地区约占土地面积的36%，占总耕地面积的42.9%，其它地区也常因受季节性干旱或难以预测的不定期干旱而减产。据统计，世界性干旱导致的减产可超过其它因素造成减产的总和。在我国，干旱、半干旱地区占国土面积的47%，占总耕地面积的51%。近40年来，我国受干旱缺水而少产的粮食总计近1亿吨。作为我国重要粮食作物的玉米、小麦、水稻，近年来由于持续的干旱天气，其产量和质量受到严重影响。据气象专家预测，到2050年前，我国将处于一个大范围的、干旱频数显著增多的时期，干旱缺水将是我国粮食生产面临的最严重的问题之一，解决这个问题的有效途径之一是培育和利用优良的耐旱作物品种。
利用理化因素诱变处理是改良植物的一种行之有效的方法，在农作物、园艺、花卉等的改良中已广泛应用，并育成大量优良品种。化学诱变是人工获取突变体常用的手段之一，化学诱变与物理诱变相比，具有相对的专一性，它的作用对象是碱基，例如碱基的替换、颠倒。利用化学诱变和细胞培养技术相结合筛选抗旱性突变体越来越受到人们的重视，已在烟草、苜蓿、油菜等物种中筛选出耐受高浓度PEG的突变体。甲级磺酸乙酯（EMS）是较为常见的化学诱变剂，在植物诱变育种中已得到广泛的应用，目前已成为作物诱变育种中最广泛、应用效果最好的一种诱变剂。在对育种材料进行诱变处理后，会得到一系列突变体，如何从中筛选出耐旱的突变体，是抗旱育种中的关键步骤。因此，研究作物抗旱突变体的抗旱性筛选方法，提高育种材料抗旱性鉴定的准确性，对于作物育种和保障粮食安全具有重要意义。
现有的抗旱突变体筛选方法包括：田间形态鉴定法、生理生化测试法、分子标记法。例如，王瑾、刘桂茹等（EMS诱变小麦愈伤组织选择抗旱突变体的研究.植物生理科学.2005,21(12):190-193）介绍了一种诱发筛选抗旱品种的方法。此方法首先提出在离体培养条件下诱变筛选抗旱突变体，以EMS为诱变剂，明确了诱变剂处理的适宜浓度和适宜处理时间，将诱变植株在高浓度PEG胁迫下进行抗旱性筛选检测；
张娇娇、江力等（拟南芥抗旱突变体的筛选和鉴定.合肥工业大学学报（自然科学版）.2012,35(4):531-535）使用田间形态鉴定法，采用不同浓度的甘露醇模拟干旱胁迫，以发芽率为筛选指标在拟南芥突变体中筛选抗旱突变体的方法，筛选出2株候选突变体，最终得到1株稳定突变体，主要通过表型形态（包括叶长、叶宽、叶片萎焉程度）鉴定，并结合最终的收获产量，确定抗旱突变体，该研究为抗旱基因克隆及功能分析奠定基础，对于揭示植物抗旱性的机理具有重要意义；
张敏、杨艳等（EMS诱变南高丛越橘及抗旱突变体的筛选.西南师范大学（自然科学报）.2011,36(3):132-137）使用生理生化测试法介绍了一种利用理化因素诱变处理人工获取突变体行之有效的方法，其用化学诱变剂EMS对越橘茎尖进行处理，并对M0代植株进行干旱处理，测定部分生理指标（超氧化物歧化酶、丙二醛、脯氨酸、可溶性糖、叶绿素），文章中指出：在干旱胁迫状态下，超氧化物歧化酶（SOD）的活性与植物抗氧化胁迫能力呈正相关；可溶性糖的含量会增加，提高细胞液的浓度，提高植物的吸水能力；干旱初期会产生一定量的游离脯氨酸，用以维持植物各器官的渗透能力，维持细胞和组织吸水，提高植株对干旱逆境的适应能力，据此对抗旱突变体进行筛选，为越橘的抗旱育种提供基础研究数据；
发明专利“一种分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法”（申请号：CN201210388129.5），公开了一种分子标记辅助选育豇豆耐旱品种的方法，属于蔬菜生物技术育种技术领域。方法包括：(1)豇豆耐旱关联SNP分子标记位点1_1286的筛选；(2)SNP向CAPS标记的转化、扩增与酶切；(3)待检豇豆材料的准备；(4)待检豇豆材料苗期耐旱性的分子标记检测；和(5)待检成株茎杆持绿性Stg与农艺性状的表型复检等步骤。发明专利“玉米耐旱种质鉴定和筛选CAPS标记及其检测方法和应用”（申请号：CN201210235665.1），提供了玉米耐旱种质鉴定的分子标记，其分子标记包括dhnC397和rspC1090，该发明提供的分子标记可大大提高育种中耐旱的选择效率。
上述现有技术也存在一定的缺陷：田间形态鉴定法，以作物外在的形态参数为特征进行抗旱性植株的筛选，能够在一定程度上对作物的抗旱性进行鉴别与评价，但需要在不同的时期都需要观测和测定，耗费大量的人力、物力，而且需要结合其他的抗旱指标才能测定；此外，这种鉴定方法主要依靠人工肉眼进行观测，主观性较大，不同育种家筛选的结果差异较大；
生理生化测试法，依据作物在干旱胁迫下的生化组分变化来表征抗旱性大小，需要采样后拿回实验室，使用特定的生化实验仪器进行测定，很难满足对育种材料的大量、快速、无损筛选的需求；
分子标记法，使用分子技术进行抗旱性的筛选，结果很准确，但操作复杂，成本较高，难以对大量材料进行筛选；
产量测定是一种综合的、使用最广泛、结果相对比较准确的一种鉴定方法，目前主要应用在育种中的高代品系或种质资源的抗旱性鉴定，对于育种过程中大量的早代分离世代材料，难以大量应用。因此，迫切需要探索新的作物抗旱性检测方法。
发明内容
针对现有的抗旱突变体筛选方法的缺陷，本发明的目的是提供一种基于红外热成像技术的作物抗旱性检测方法，实现抗旱突变体的田间快速测量及辅助筛选。
实现本发明目的的具体技术方案为：
一种作物抗旱突变体田间快速辅助筛选的方法，包括步骤：
1)热红外图像采集：分别在一天中温度最低时刻以及一天中温度最高时刻在田间对被筛选的作物进行热红外图像采集；
2）温度分布特征参数提取：对采集的热红外图像进行图像处理，包括提取叶片温度的最大值、最小值、平均值；计算温度最低时以及温度最高时的叶片温度差异；提取同一叶片的叶尖、叶中、叶基的温度差异及分布特征；提取冠气温差；
3）特征参数指标筛选：在步骤2）提取出的特征参数中，筛选出表征作物抗旱性差异的特征参数；
4）阈值确定：提取对照品种的图像特征参数，根据其抗旱性等级，对对照品种的图像特征参数进行分级，从而确定被筛选的作物抗旱性的图像特征参数的阈值，划分抗旱等级区间。
5）被筛选作物的抗旱性等级计算：查看步骤3）所得参数的对应的抗旱等级区间，确定该突变体的抗旱等级。
在所述步骤1）之前还包括作物田间种植及管理的步骤：在田间种植被筛选的作物，在作物的关键生育期分别进行干旱胁迫处理。
其中，所述对照材料为抗旱性已知的品种，其种植条件与被筛选的作物相同。
其中，所述步骤1）中热红外图像采集时，使用遮阳装置、挡风装置和背景装置中的一种或多种辅助图像的采集。
其中，所述步骤1）中热红外图像采集在作物的关键生育期进行，所述关键生育期为苗期、拔节期、抽雄期、吐丝期、灌浆期、成熟期中的部分或全部。
其中，所述步骤1）中一天中温度最低时刻为早晨，具体为上午6-9点；所述一天中温度最高时刻为午后，具体为下午1-4点。根据筛选地区日照时间不同，具体选择适宜的图像采集时间。
其中，所述步骤2）中提取的叶片温度为倒一叶、倒二叶、倒三叶中的一种或多种的叶片温度。
其中，所述步骤3）中通过T检验和/或方差分析的方法，筛选差异最显著的特征参数为表征作物抗旱性差异的特征参数。
所述步骤4）中,还可结合产量等指标对阈值进行修正、优化，从而划分若干抗旱等级区间。
其中，所述被筛选的作物是经过诱变剂处理的作物突变体材料。
本发明的有益效果在于：
本发明提出的方法能够在大田环境下实现热红外图像的准确采集，拍出来的图像清晰、可辨认，便于后续在计算机上的处理；把温度最低时以及温度最高时的叶片温度差异（称为上、下午的温度差）作为表征抗旱性差异的一个特征参数，避免了不同测量时期、太阳辐射、土壤含水量等不同造成的绝对温度差异，并且避免不同年份气候条件不同造成的影响，提高了鉴定精度。
作物的抗旱性是一个极其复杂的数量性状，涉及到生长发育、形态特征、生理生化和产量等多个方面，因此抗旱性鉴定与抗旱材料的筛选需要进行综合考虑，传统方法中大量的工作需要人工完成，工作量大。本发明提出的方法应用了红外热成像技术，实现了创新性的检测，建立了基于红外热成像的作物抗旱突变体筛选方法，此方法可以实现田间的快速、无损筛选。相对于传统的作物抗旱突变体筛选方法，系统携带方便、简单易操作、测量周期短、检测成本低、鉴定精度高。
附图说明
图1为本发明筛选方法的流程图。
图2为玉米小区的热红外图像；
图3为单株玉米的温度特征提取的图像。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明结合玉米抗旱突变体的筛选实例，对一种作物抗旱突变体田间快速筛选方法的实施方式进行说明。具体如下。
实施例1：
实验地选在新疆农科院综合试验场。新疆地处干旱少雨、昼夜温差大，比较适合进行育种材料抗旱性的田间筛选试验。待筛选的作物为玉米，对照品种为郑单958（高抗旱性品种）以及糯玉米（不抗旱品种）。诱变剂为EMS（甲级磺酸乙酯）。筛选过程参见图1。
1）作物田间种植及管理。种子处理：将玉米种子经过EMS十二个不同浓度诱变剂处理后，编号EMS1、EMS2、……、EMS24，单粒播种。植株长至苗期再单株编号，如：1-1、1-2、1-3、……1-20、……2-1、2-2、2-3、……。
按照常规管理玉米的方式进行田间管理，在玉米生长期内，正常灌溉、施肥。
2）干旱胁迫处理。
干旱处理可以分为：温室内人工控制水分和自然条件下的干旱。本实验选在干旱少雨的新疆，主要依赖于灌溉，若不灌溉则玉米会受到干旱胁迫。本实验在玉米的关键生育期进行水分控制处理，如表1，拔节期浇水后即开始停水直至吐丝期结束。
表1：干旱胁迫处理方式
3）图像采集
分别在玉米的关键生育期（苗期、拔节期、抽雄吐丝期、灌浆期、成熟期），采集各组玉米植株材料的热红外图像。每日采集两次数据，分别是早上温度最低时（AM9：00）、午后温度最高时（PM3：00），并记录当时的大田气温。
采集时，用罩子或者遮阳网将被测植株与周围环境隔离开，以避免周围复杂环境影响采集红外图像的质量，将热像仪竖直置于植株的正上方，调整热像仪的温度控制面板以及镜头焦距，使得植株的图像清晰、可辨的显示在热像仪的显示屏上，按照同一拍摄方式对所有已编号植株进行拍摄，将拍摄的图像的编号与植株编号对应，并将图像保存在内存卡中。
4)温度分布特征提取
利用热红外图像处理软件对采集的玉米红外图像进行分析。由于测量环境的复杂性以及人为操作因素，采集的图像的质量难免受到外界因素的影响，所以在进行分析之前要对图像进行预处理，首先采用滤波的方式对图像进行去噪，然后进行图像分割将复杂的背景和目标分离开，初步提取出玉米图像温度最大值、最小值、均值、直方图等参数，并将图像数据导出。
植物的抗旱特性与其冠层及以下两叶片的特性紧密相关，因此对玉米植株的冠层、倒一叶、倒二叶、玉米茎秆进行温度提取，通过计算得出如下特征参数：冠气温差、叶片不同区域（叶基和叶中、叶中和叶尖、叶尖和叶基）之间的温差、不同叶位之间的温差（倒一叶、倒二叶）、叶片和茎杆之间的温差等，并计算气温最高、最低时的作物叶片温度差，称为上下午温差。用T检验分析确定差异最显著的数值列于表2，表2列出了本次试验观测的全部植株中有代表性的12株抗旱植株和12株不抗旱植株。对同一抗旱突变体植株上下午温差进行分析，通过对比发现，上下午温度差能较好的表征玉米的耐旱性，对12个植株在苗期、拔节期、抽雄期、吐丝期等各个时期，通过红外图像处理计算得到叶片的上下午温度差，抗旱和不抗旱品种表现出明显的差异性（T检验的P值小于0.05），说明上下午温度差能够表征不同抗旱性等级之间的差异，因此将上下午温度差作为特征参数用于后续突变体的筛选。
表2：不同时期玉米上下午温度差的T检验结果
5）阈值确定与等级评价
参照对照品种郑单958（高抗旱性品种）以及糯玉米（不抗旱品种）的上下午温差，对所有突变体的上下午温差进行分析，靠近郑单958上下午温差的抗旱突变体为一个区间，同理，靠近不抗旱糯玉米品种上下午温差的品种为另一个区间。用n1、n2、.....n12表示各个生育期的12个不抗旱植株的上下午温差，用m1、m2、....m12表示各个生育期的12个抗旱植株的上下午温差。
用N表示12个不抗旱植株的平均温度：
用M表示12个抗旱植株的平均温度：
定义域值：
选择若干未知抗旱性的植株为被筛选的作物，在各个关键生育期，求其上下午温度差，与对应时期的K值比较（表3），若大于K，则不抗旱；若小于K则抗旱。
表3：不同时期抗旱与不抗旱玉米的上下午温度差的划分阈值
| 生育期 | 苗期（6-20） | 拔节期（6-29） | 抽雄期（7-10） | 吐丝期（7-20） |
| N（不抗） | 14.5975 | 13.63666667 | 9.945 | 18.0725 |
| M（抗） | 11.615 | 11.83083333 | 7.8675 | 14.6925 |
| K（阈值） | 13.10625 | 12.73375 | 8.90625 | 16.3825 |
对于在各个生育期多次采集的热红外图像，利用上述方法分别求得上下午的温度差△K，比较△K和K值的大小，结合育种家的经验及人工观测的表型参数，若4个时期中有多个时期的△K>K，说明此植株不抗旱，反之，△K<K，此植株抗旱。
6）筛选抗旱突变体
在进行实验的过程中同时记录玉米突变体的田间形态参数，包括：生育期、光周期反应特性、苗色、叶长、叶宽、叶片茸毛、株形、叶姿、粒色、粒大小、饱满度、籽粒整齐度、千粒重等。将测定的热红外温度特征参数与这些田间表型参数对比。如表4所示，经红外图像处理得到的数据，与根据上下午温度差确定的阈值进行比较，然后确定的抗旱性等级，与生理指标很吻合，验证了上下午温度差确实能反映作物的抗旱性。
表4：热红外图像鉴定结果与表型参数的对比分析
通过多次验证，还可以优化阈值，然后将所有的待测突变体的图像的温度差参数与上一步确定的阈值进行比较，选择温度差小于K值的抗旱突变体，即为抗旱性较好的突变体，然后结合具体的育种目标，根据育种家的需求进行最终决策，挑选出抗旱的突变体。通过上述方法可以辅助育种家对玉米植株的抗旱性进行筛选，由于热红外图像采集操作方便、处理简单，还可以在收获前对抗旱性进行早期判断，因而在育种材料的抗旱性辅助筛选中具有重要应用前景。
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种作物抗旱突变体田间快速辅助筛选的方法，其特征在于，包括步骤：
1)热红外图像采集：分别在一天中温度最低时刻以及一天中温度最高时刻在田间对被筛选的作物突变体进行热红外图像采集；
2)温度分布特征参数提取：对采集的热红外图像进行图像处理，包括提取叶片温度的最大值、最小值、平均值；计算温度最低时以及温度最高时的叶片温度差异；提取同一叶片的叶尖、叶中、叶基的温度差异及分布特征；提取冠气温差；其中，所述提取的叶片温度为倒一叶、倒二叶、倒三叶中的一种或多种的叶片温度；
3)特征参数指标筛选：在步骤2)提取出的特征参数中，筛选出表征作物抗旱性差异的特征参数；
4)阈值确定：提取对照品种的图像特征参数，根据其抗旱性等级，对对照品种的图像特征参数进行分级，从而确定被筛选的作物抗旱性的图像特征参数的阈值，划分抗旱等级区间；
5)被筛选作物突变体的抗旱性等级计算：查看步骤3)所得参数的对应的抗旱等级区间，确定该突变体的抗旱等级；
其中，在所述步骤1)之前还包括作物突变体的田间种植及管理的步骤：选取被筛选的作物突变体，进行田间种植，并在作物的关键生育期进行干旱胁迫处理。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述对照材料为抗旱性已知的品种，其种植条件与被筛选的作物相同。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中热红外图像采集时，使用遮阳装置、挡风装置和背景装置中的一种或多种辅助图像的采集。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中热红外图像采集在作物的关键生育期进行，所述关键生育期为苗期、拔节期、抽雄期、吐丝期、灌浆期、成熟期中的部分或全部。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中一天中温度最低时刻为早晨，具体为上午6-9点；所述一天中温度最高时刻为午后，具体为下午1-4点。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中通过T检验和/或方差分析的方法，筛选差异最显著的特征参数为表征作物抗旱性差异的特征参数。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述被筛选的作物突变体是经过诱变剂处理的作物突变体材料。
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