CN113748946B - 一种陆地棉的抗冷性鉴定方法 - Google Patents

一种陆地棉的抗冷性鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种陆地棉的抗冷性鉴定方法。本发明提供的抗冷性鉴定方法包括棉苗和棉芽低温处理获得冷胁迫棉苗和棉芽，对所述冷胁迫棉苗和棉芽进行分析。本发明改变陆地棉子叶期以往低温处理的低温高湿状态，通过提供更接近于自然低温胁迫的条件，准确鉴定了陆地棉子叶期的抗冷性。本发明明确了TM‑1叶片的抗冷关键基因，对所述关键基因进行联合荧光定量分析，可以有效筛选出抗冷性较强的棉花材料，为TM‑1的进一步利用提供了有力的背景支撑和基因资源。本发明提供的抗冷性鉴定方法具有，简单易控制，更接近自然低温胁迫条件，鉴定结果准确的优点，可用于陆地棉的抗冷性鉴定，加快抗逆育种进程。

Description

一种陆地棉的抗冷性鉴定方法
技术领域
本发明涉及植物冷胁迫技术领域，具体涉及一种陆地棉的抗冷性鉴定方法。
背景技术
棉花(Gossypium sp.)是世界第一大纤维作物，棉纤维是纺织工业中最重要的天然和可再生资源。TM-1是陆地棉遗传标准系，本研究对其农艺性状及纤维品质进行研究，对其芽期和苗期的抗冷性进行研究。棉花的芽期是指棉花种子萌发后到出苗前这段时间，苗期是指种子萌发出土成苗后，对其在低温胁迫条件下抗冷相关基因进行荧光定量分析，为利用该种质的育种利用供理论依据。
低温是影响植物生长、发育、产量以及地理分布的重要环境因子之一，也是作物生长发育中经常遇到的自然灾害之一。植物在其长期的进化过程中形成了复杂而高效的应答机制，以抵御和适应低温胁迫。棉花起源于热带亚热带，在整个生育期特别是在生育期前期中的芽期和苗期易遇到低温危害，造成绝收或减产，对棉花现有种质资源材料进行抗冷性鉴定和抗逆相关机理进行研究，有利于对抗冷材料进行充分利用，加快抗逆育种进程。
发明内容
本发明的目的是提供一种陆地棉的抗冷性鉴定方法。现有技术中提供的棉花子叶期抗冷性鉴定的方法不能提供适宜的冷胁迫环境，本发明提供了棉花子叶期稳定适宜的冷胁迫处理环境，并对棉花芽期的抗冷指标进行了丰富。具体方案如下。
第一方面，本发明提供一种陆地棉的子叶期抗冷性鉴定方法，包括棉苗低温处理获得冷胁迫棉苗，对所述冷胁迫棉苗进行分析；所述低温处理的条件为：培养基质水份含量20％-23％、空气温度1-4℃、空气湿度为50％-65％，在接近自然条件的开放环境下培养3-7d。
现有技术中，为了使冷胁迫程度加强，通常选择在植株低温处理时加上密封盖，在密闭环境下进行低温处理，由于棉花植株处于相对密闭的环境，容易在空气中形成缺氧胁迫，现有技术中土壤水分含量呈饱和状态，也易形成缺氧胁迫，并且与自然低温条件不符合。
本发明对子叶期抗冷性鉴定方法进行了优化，采用开放的环境进行低温处理，更贴近自然低温条件。降低了缺氧胁迫的风险，使逆境条件只剩下低温这一个因子，对结果的影响也是由这个逆境因子造成的，结果更准确可靠，更能说明棉花的抗冷性和抗冷机理。
同时由于低温处理为开放环境，需要将低温处理中沙土含水量由原来的饱和状态，设为沙土最大持水量的80％左右(即沙土含水量约20.00％-23.00％)，将低温处理时间也由原来的24h变为3-7d，空气湿度由原来的接近饱和状态(空气湿度约95％-99％)调整为50％-65％。
在本发明提供的抗冷性鉴定方法中，所述低温处理后的棉苗，正常条件下恢复生长7-15d，以棉苗的子叶伤害指数、子叶的叶绿素含量和株高作为抗冷性鉴定指标。
其中，子叶和真叶的叶绿素含量均可以作为目测鉴定指标对棉花抗冷性进行指示性筛选指标。低温处理后继续恢复生长10天以上，肉眼可见冷敏感材料真叶变黄，叶绿素含量降低，而抗冷材料叶片变黄不明显。所以低温处理后继续恢复生长10天以上的植株的叶绿素含量可以作为筛选抗冷性的鉴定指标。
低温处理子叶期4d并在正常温度恢复生长7-15d时的株高可以作为鉴定棉花子叶期的鉴定指标，若株高经低温处理后比对照处理下降50％以上，该材料可以鉴定为冷敏感材料；反之，若所检测材料经低温处理后，株高下降低于50％，所述材料鉴定为抗冷性材料。
在本发明提供的抗冷性鉴定方法中，所述正常条件为25-28℃，14h/12h光照/黑暗培养7-15d，其中对照处理一直处于正常条件下培养。
本发明提供的抗冷性鉴定方法，还包括，在棉花三叶期，进行低温处理，提取倒二叶的RNA，进行荧光定量PCR，所用荧光定量PCR引物为SEQ ID No.1-22所示；
所述低温处理条件为，培养基质水份含量20％-23％、空气温度1-4℃、空气湿度为50％-65％，开放环境下培养24-48h。
陆地棉三叶期，倒二叶4℃24h低温胁迫后，受到的伤害呈中间状态，比倒一叶轻，比倒三叶重，所以倒二叶进行基因的荧光定量表达分析最为合适，而且更易提取出RNA。本发明提供的抗冷性鉴定方法，可以用于TM-1、豫2067、衡棉3号、中棉所44、GK50或冀棉616的抗冷性鉴定。本发明所提及的棉花品种均为公开报道出来的陆地棉材料，相关科研人员均可以从不同渠道找到这些品种材料用来验证其抗冷性或对其进一步利用。
第二方面，本发明提供一种棉花芽期抗冷性鉴定的方法，其特征在于，1-4℃低温处理棉花芽期3-7d后，进行正常恢复生长7-15d，以芽期子叶的叶绿素含量、株高和侧根生长量作为芽期抗冷性鉴定指标。
具体地，由于恢复生长后芽期耐冷性材料子叶的叶绿素含量明显高于不抗冷材料，可以使用低温处理后再恢复生长后叶片的叶绿素含量作为芽期抗冷性鉴定指标；由于抗冷性材料的侧根更发达，低温处理后恢复生长5-7d的棉花侧根可以鉴定棉花芽期的抗冷性，若低温处理后恢复生长的棉花侧根是正常发育的，则为抗冷植株；同样的，低温4℃处理芽期5d恢复生长10-15d的株高可以作为棉花芽期的抗冷性鉴定指标。
根据本领域技术人员的理解，本发明请求保护上述的抗冷性鉴定方法，在棉花种植资源创制中的应用。以及上述的抗冷性鉴定方法，在棉花育种中的应用。
具体地，在上述的应用中，采用上述的抗冷性鉴定方法进行鉴定，以抗冷性级别高的棉花品种作为育种材料、育种亲本材料或基因源的筛选材料。
第三方面，本发明提供一种陆地棉育种方法，在选择亲本及育种过程中，采用上述的抗冷性鉴定方法或上述的方法，对候选亲本材料及育种中产生的子代材料进行抗冷性鉴定，以叶绿素含量、叶片发黄程度、株高和侧根生长量作为抗冷性鉴定指标。
本发明还请求保护，基因CotAD_22633、CotAD_74365和CotAD_09571在陆地棉遗传标准系TM-1育种中的应用。
具体地，在TM-1育种中，将CotAD_22633、CotAD_74365和CotAD_09571在叶片中高表达的植株作为高抗冷性棉花植株。本发明的验证结果表明，对这3个基因进行联合荧光定量分析，可以有效筛选出抗冷性较强的TM-1棉花材料。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明中改变棉花的低温处理方法将低温高湿处理，调整为更接近与自然低温胁迫条件下，准确鉴定了陆地棉子叶期的抗冷性。
(2)本发明提供了棉花芽期抗冷性快速鉴定的指标，本发明通过实验验证了，低温处理后恢复生长5-7d的侧根生长量、叶绿素含量可以鉴定棉花芽期的抗冷性；恢复生长10-15d的株高可以作为棉花芽期的抗冷性鉴定指标。
(3)本发明提供了棉花子叶期抗冷性鉴定方法，在正常条件下恢复生长7-15d，检测棉苗恢复生长后的子叶伤害指数、子叶叶绿素含量和株高；其中，株高经低温处理后比对照处理下降50％以上，该材料可以鉴定为冷敏感材料；低温处理后继续恢复生长10天以上棉花植株的叶绿素含量可以作为筛选棉花抗冷性的鉴定指标。
(4)本发明发现，CotAD_22633、CotAD_74365、CotAD_09571这3个基因在TM-1叶片的抗冷中起着关键作用，可对这3个基因在叶片中进行联合荧光定量分析，可以有效筛选出抗冷性较强的棉花材料。
(5)本发明提供的抗冷性鉴定方法具有，简单易控制，更接近自然低温胁迫条件，鉴定结果准确的优点，可用于陆地棉的抗冷性鉴定，加快抗逆育种进程。
附图说明
图1是本发明实施例1中陆地棉TM-1的芽期的抗冷性鉴定的过程及结果图；其中，A的左边为萌发3d的芽(CK)，右边为将萌发3d的芽经4℃低温处理5d；B为对低温处理前或低温处理后的芽进行恢复生长时部分播种示意图，芽摆放完成后还需加盖沙土2cm左右；C的左边为对照(既未经过低温处理的芽)在正常条件下恢复生长7d后的苗；C的右边为经过4℃低温处理5d的芽在正常条件下恢复生长7d后的苗；D为C图中两种处理恢复生长7d后陆地棉的裸露根系。
图2是本发明实施例2中，TM-1子叶期的抗冷性鉴定结果图；其中A为对照组，左边为低温处理前对照；右边为对照恢复7d；B为4℃低温处理组：左边为低温处理前，右边为4℃低温处理4d后再正常条件下恢复7d；C为未进行低温处理(对照)在正常条件下生长7d和4℃低温处理4d后在正常条件下恢复生长7d的叶片对比图，其中上半部分为对照，下半部分为4℃低温处理；在A、B、C图中从左到右分别为TM-1、豫2067、衡棉3号。
图3是本发明验证叶片叶绿素含量可以作为棉花苗期抗冷性鉴定的指标。
图4是本发明实施例3中TM-1在三叶期经过4℃低温处理24h后表型结果图。
图5是本发明实施例3中4℃低温处理TM-1 24h后基因表达量结果图。
图6是本发明实施例4中TM-1响应低温胁迫调控网络的模型图。
图7是本发明实施例5验证株高可以作为棉花芽期抗冷鉴定指标。
图8是本发明实施例6验证叶绿素含量可以作为棉花芽期抗冷性鉴定指标。
图9是本发明实施例6验证叶侧根发育可以作为棉花芽期抗冷性鉴定指标。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
本发明实施例所用陆地棉品种及来源，见表1。
表1供试材料来源及系谱
Figure BDA0003261996290000051
其中，中棉所41为转基因棉花，TM-1和中棉所35属于非Bt转基因棉花，不抗棉铃虫。
TM-1植株塔形，株型松散，果枝夹角大；叶片深绿，较大，掌状，缺刻中等深；茎杆上绒毛稀少，杆硬，抗倒伏；铃卵圆形，吐絮畅，絮色洁白，含絮力好。始节高平均为8.10cm，始节位约5-6，平均株高94.60cm，单株果枝数平均12.80个，单株结铃数为10.40个，铃重6.55克左右，衣分44.42％，平均亩产186.10Kg/亩；株高高于中棉所35，但比中棉所35晚熟，产量中棉所35提高15.92％，果枝数和单株铃数均高于中棉所35，其他农艺性状与中棉所35接近。
经农业部棉花品质监督检验测试中心测定(HVICC校准)，2019和2020年两年TM-1纤维品质平均值：上半部平均长度28.20mm，长度整齐度指数84.20％，断裂比强度31.30cN/tex，马克隆值5.50，断裂伸长率6.80％；中棉所35纤维品质为上半部平均长度29.10mm，整齐度指数84.60％，断裂比强度29.70cN/tex，马克隆值4.80，断裂伸长率6.70％。TM-1断裂比强度好于中棉所35。
实施例1陆地棉TM-1芽期的抗冷性鉴定
本实施例提供对陆地棉TM-1芽期的抗冷性进行鉴定的方法，具体步骤如下：
(1)将TM-1种子光籽(如果是毛籽需经揉搓后)利用滤纸卷在28℃恒温下进行催芽2-3d，待芽长到2-3cm左右时每个材料选取生长均匀一致的发芽种子100-120粒，分3个重复置入双层滤纸的培养皿中进行4℃低温处理，低温处理0d为对照处理(CK)，处理5d为低温处理组；
(2)低温处理结束，在正常条件下恢复生长3d和7d后调查对照和低温处理的子叶平展率(％)、株高(从地面至生长点的高度)和子叶的叶绿素含量，叶绿素含量采用叶绿素计(SPAD.502Plus，日本)测定，用SPAD值代表，取平均值。
陆地棉TM-1芽期的抗冷性鉴定的过程及结果如图1和表2所示。
表2TM-1芽期的抗冷性鉴定
Figure BDA0003261996290000061
小写字母不同(a—b)表示差异显著(P＜0.05)，n＝3；大写字母不同(A—B)表示差异极显著。
结果显示，TM-1的芽经过5d的4℃低温处理后，胚根变软变黄，下胚轴无肉眼可见变化；恢复生长3d后，与对照相比，子叶平展率极显著下降；恢复生长7d后，与对照相比，子叶平展率无显著差异，说明经过5d的4℃低温处理后比对照出苗晚；低温处理后下胚轴缩短，株高比对照下降46.43％，子叶发黄且皱缩，有的叶片上有黄色小斑，或部分叶片边缘枯烂，子叶叶绿素含量极显著降低，说明芽期经过低温胁迫后子叶的叶绿素合成受到了损伤；但是低温处理后主根受到了伤害，侧根却比较发达，侧根生长优于对照。
由此可以看出，4℃低温处理芽期5d，正常恢复生长7d后，子叶的叶绿素含量和侧根生长量均可以作为芽期抗冷性鉴定指标。TM-1的芽经过5d的4℃低温处理后恢复生长7d的子叶相对平展率为94.74％，依据王俊娟等(2016)制定的棉花芽期抗冷标准，TM-1芽期的抗冷性达到高抗冷级别。
实施例2陆地棉子叶期的抗冷性
本实施例提供对陆地棉(TM-1、抗冷材料豫2067和冷敏感材料衡棉3号)的子叶期的抗冷性进行鉴定，不进行冷胁迫的植株，作为空白对照组。对照组与处理组的设置及结果见图2，具体步骤如下：
将实验材料正常种植后7-8d的苗(以子叶平展为准)，进行4℃低温处理4d，正常条件下恢复生长7d，调查子叶面积的受伤指数，再计算出抗冷指数。
现有技术中，为了使冷胁迫程度加强，通常选择在植株低温处理时加上密封盖，土壤含水量呈饱和状态。在密闭空气环境下进行低温处理，由于棉花植株处于相对密闭的环境，且土壤含水量呈饱状态，容易在空气和土壤中形成缺氧胁迫，并且与自然低温条件不符合。
本发明对子叶期抗冷性鉴定方法进行了优化，采用开放的环境进行低温处理，更贴近自然低温条件。降低了缺氧胁迫的风险，使处理逆境条件只剩下低温这一个因子，对结果的影响也是由这个逆境因子造成的，结果更准确可靠，更能说明棉花的抗冷性和抗冷机理。
同时由于低温处理为开放环境，需要将低温处理中沙土含水量由原来的饱和状态，设为沙土最大持水量的80％左右(即沙土含水量约20.00％-23.00％)，将4℃低温处理时间也由原来的24h变为72h-96h(3-4d)，空气湿度由原来的接近饱和状态(空气湿度约95％-99％)调整为50％-65％。
采用上述抗冷性鉴定方法，得到的结果如下：
(1)在将TM-1、抗冷材料豫2067和冷敏感材料衡棉3号播种后7-9d的子叶期的苗进行了1-4d 4℃低温处理后，在1-2d时，3个材料无明显差别，低温处理第3d时，冷敏感材料叶片稍微发软，茎稍显弯曲，但品种间症状差异不明显。低温处理第4d时，与对照相比，3个品种均有明显差异，子叶变软，茎杆变软，冷敏感材料症状尤为明显；三个材料的叶绿素无显著变化。
(2)将TM-1、豫2067、衡棉3号材料，从冷胁迫环境拿出置入正常条件下(28℃，14h/12h光照/黑暗)的生长箱中恢复生长，7d后调查发现：
3个品种叶面积与对照组相比均显著缩小，且有不同程度的伤斑，冷敏感材料衡棉3号叶片受伤最为严重。
3个品种株高均显著降低，对照处理恢复生长后TM-1、豫2067、衡棉3号的平均株高分别为12.66cm、12.75cm、13.12cm，低温处理后3个品种的株高分别为8.22cm、7.75cm、6.45cm，分别比对照降低35.07％、39.22％、50.84％，说明低温处理显著抑制了棉花下胚轴的伸长，特别是对冷敏感材料抑制更为强烈，所以子叶期经低温处理后恢复正常生长7-15d的株高可以作为鉴定棉花抗冷性的一个指标，与对照相比，株高经低温处理后下降50％以上，该材料可以鉴定为冷敏感材料。
TM-1和豫2067子叶受低温胁迫后恢复生长后与处理前叶绿素含量基本不变，衡棉3号子叶的叶绿素含量降低，平均降低了19.53％，说明低温主要抑制了冷敏感材料叶片的叶绿素含量；但是3个品种低温处理后子叶的叶绿素与对照恢复后子叶的叶绿素相比，TM-1和豫2067和衡棉3号的叶绿素均降低了，尤其是衡棉3号，极显著降低，说明苗期在正常条件下，随着生育期的延长，在一段时间内子叶的叶绿素含量呈增强趋势，光合能力也在变强，而低温胁迫抑制了陆地棉叶片的叶绿素合成，减弱了叶片的光合能力，特别对冷敏感材料光合能力的破坏尤为显著。
低温处理后继续恢复生长10天以上，肉眼可见冷敏感材料真叶变黄，叶绿素含量降低，而抗冷材料叶片变黄不明显。因此，低温处理后继续恢复生长10天以上植株的叶绿素含量可以作为筛选棉花抗冷性的鉴定指标。
对此，本发明另外提取了前期鉴定出的抗冷性差异显著的材料进行了验证，将抗冷品种中棉所44(子叶期抗冷指数为85.27％)和不抗冷材料GK50(子叶期抗冷指数为32.40％)进行正常种植至子叶平展，进行4℃低温处理时间4d，恢复生长7-10d时，冷敏感材料子叶发黄，继续培养15d时，冷敏感材料GK50真叶和子叶均发黄(图3)，对2个品种的子叶和真叶绿素含量分别进行了测量，其中中棉所44子叶和真叶的SPAD值分别为42.1和35.23，GK50真叶和子叶的SPAD值分别为20.12和18.51，低温处理后子叶和真叶的叶绿素含量均与其抗冷性呈正相关，所以低温处理后继续恢复生长10天以上的叶绿素含量可以作为筛选棉花抗冷性的鉴定指标。
依据王俊娟等(2016)按叶片受伤面积算出TM-1、豫2067、衡棉3号的伤害指数，计算出相应的抗冷指数，分别为85.32％、76.55％、21.62％，同时依据王俊娟等(2016)对陆地棉子叶期抗冷性级别的划分标准，可知陆地棉TM-1、豫2067、衡棉3号分别达到抗冷、抗冷、冷敏感，其中豫2067、衡棉3号与前期鉴定结果是一致的，说明本发明提供的鉴定方法在开放环境下，环境湿度为50％-65％，保持沙土含水量约20.00％-23.00％，同时4℃低温处理时间延长为72h-96h(3-4d)是可靠的和可行的。
本发明提供的低温处理更接近自然低温生长条件，并将空气湿度由原来的接近饱和状态为50％-65％，土壤湿度也由原来的接近饱和状态为20％-23％，使被鉴定的苗情除了低温一种胁迫外，将其它胁迫如缺氧胁迫消除，获得的抗冷性结果更接近真实的低温逆境胁迫结果，对这样处理条件下筛选出的抗冷相关基因更能代表棉花响应低温胁迫后基因表达的真实状态。其中，TM-1子叶期的抗冷性略高于豫2067，二者的抗冷指数达差异显著水平，TM-1与冷敏感材料衡棉3号的抗冷指数达差异极显著，说明TM-1的子叶期的抗冷性高于豫2067，远远高于衡棉3号。
实施例3陆地棉三叶期抗冷相关基因的表达
本实施例对陆地棉三叶期抗冷相关基因的表达进行分析，具体步骤如下：
(1)将陆地棉材料TM-1、豫2067和衡棉3号的光籽(如果是毛籽经揉搓后)播种于经高温灭菌后的沙土中，沙土水分含量保持在20％-23％(质量比)，加盖保湿，放置于28℃、光照14h/黑暗10h恒温生长箱中。
(2)播种后7d左右出苗，7d出苗后将子叶未平展、烂苗、倒置苗、弱苗及畸形苗拔除，每盒留下均匀的、健壮的苗25-30棵继续生长2d后用于子叶期的抗冷鉴定；生长到三叶一心时进行4℃低温胁迫处理，24h后取样，低温处理前作为对照进行取样，用于RNA的提取和基因的荧光定量分析，每个处理设3个生物学重复和3个技术重复。
(3)在棉花功能基因组网站筛选得到与抗冷性相关的11个基因，利用Primer5软件设计实时荧光定量特异引物(表3)。为了验证11个基因在陆地棉TM-1、豫2067和衡棉3号叶片中的表达情况，进行了实时荧光定量分析。
表3 10个抗冷相关基因实时灾光定量引物
Figure BDA0003261996290000091
Figure BDA0003261996290000101
以Histone-3(Accession No.:AF024716)和18S(Accession No.:L24145)基因作为反应中的内参基因进行11个与抗冷相关基因的荧光定量PCR，PCR程序设定为：94℃，30s；94℃，5s；55℃，34s；72℃，34s，共40个循环。目标基因的相对定量分析采用2–ΔΔCT法(Afrin等，2015)，每处理设3个生物学重复，3个技术重复，最后用平均数统计表达量。
本实施例得到的实验材料三叶期形态特征及抗冷相关基因的表达如下：
TM-1在三叶期经过4℃低温处理24h后，与对照相比，子叶及真叶均发软，有脱水萎蔫现象，可能因为处理时间短，主茎来不及有明显的变化，真叶和子叶叶柄均下垂，叶片发软，子叶发软颜色变灰暗，皱缩萎蔫情况比真叶严重，真叶中以倒一叶发软皱缩严重，倒二叶次之，倒三叶发软最轻(见图4)。总的来说，受4℃低温胁迫24h后，老叶受伤最重，幼嫩叶次之，倒三叶是功能最强的叶片，因为细胞内各系统组分均发育成熟，所以抗性最强。
陆地棉TM-1倒二叶4℃24h低温胁迫后，受到的伤害呈中间状态，比倒一叶轻，比倒三叶重，所以倒二叶进行基因的荧光定量表达分析最为合适，而且更易提取出RNA。由图5可知，4℃低温冷处理24h后，所选11个基因中与对照相比(对照基因表达量为1)，除了CotAD_12521和CotAD_76943在3个品种叶片中下调表达外，其余9个基因均上调表达，上调表达的倍数在3个品种中是有差异的，这9个基因在抗冷材料TM-1和豫2067叶片中的上调表达量均大于冷敏感材料衡棉3号，但是在两个抗冷材料中的表达模式是不同的。
其中CotAD_22633(late embryogenesis abundant protein 3L-1)、CotAD_74365(PREDICTED:calcium-binding protein PBP1)、CotAD_09571(mitogen-activatedprotein kinase 3)这3个基因在TM-1表达量极显著高于在衡棉3号叶片中的表达量，在TM-1叶片中的表达量是衡棉3号叶片中表达量的23.47、20.31、9.85倍，而在豫2067的表达量是衡棉3号的1.97、3.12、6.31，如果要深入研究这3个基因的功能，TM-1可作为首选材料；CotAD_45286、CotAD_55002在豫2067叶片中的表达倍数是衡棉3号的3.46和6.18，在TM-1叶片中这2个基因的表达量分别是衡棉3号的1.81和1.75，CotAD_50094、CotAD_58358、CotAD_17081、CotAD_56948这4个基因在TM-1和豫2067中的表达倍数近似，在TM-1叶片中的表达量是衡棉3号的4.69、2.69、1.26、4.48倍，在豫2067叶片中的表达量是衡棉3号的5.14、2.45、1.94、4.04倍，说明TM-1的抗冷机制与另外一个抗冷材料豫2067基因表达有相似的地方，也有不同的地方，且TM-1的抗冷性稍强于豫2067是因为相对比较多抗冷相关基因在叶片中表达量高于豫2067，且其上调表达倍数显著高于豫2067。
本发明预测CotAD_22633(late embryogenesis abundant protein 3L-1)、CotAD_74365(PREDICTED:calcium-binding protein PBP1)、CotAD_09571(mitogen-activated protein kinase 3)这3个关键基因在TM-1的抗冷中起着关键作用，其中CotAD_74365(PREDICTED:calcium-binding protein PBP1)可能作为调控蛋白起作用，调控转录因子CotAD_09571(mitogen-activated protein kinase 3)的转录，进行正调控功能蛋白基因CotAD_22633(late embryogenesis abundant protein 3L-1)，使CotAD_22633(lateembryogenesis abundant protein 3L-1)在TM-1叶片中高表达从而行使其抗冷功能，从而提高TM-1的抗冷性。
对此，本发明利用这3个基因在棉花抗冷性差异的品种中进行了验证筛选，本发明另外选两个子叶性抗冷性差异显著的品种，抗冷品种中棉所44(子叶期抗冷指数为85.27％)和不抗冷材料GK50(子叶期抗冷指数为32.40％，参考王俊娟等，中国农业科学，2016，17(49)：3332-3346)，对这两个棉花品种在三叶期进行4℃处理后提取叶片的RNA，反转录后进行这3个基因的荧光定量分析发现，中棉所44叶片这3个基因均上调表达，表达量分别是对照的35.12、53.25、18.22倍，与TM-1有着相似的表达模式，而不抗冷材料GK50这3个基因的表达明分别是对照的2.55、3.15、2.08倍，与冷敏感材料衡棉3号有着相似的表达模式，本发明的验证结果表明，对这3个基因进行联合荧光定量分析，可以有效筛选出抗冷性较强的棉花材料。
实施例4陆地棉TM-1苗期响应低温胁迫调控网络
本实施例结合实施例1-3的结果，推导TM-1响应低温胁迫的部分基因的调控网络，具体如下：
陆地棉TM-1在三叶期时进行4℃低温处理，11个与抗冷相关基因中有9个上调表达，2个下调表达。11个基因的类型包括钙离子信号转导、转录因子、结构蛋白以及诸如LEA和脱水素等，由此推导出TM-1响应低温胁迫的部分基因的调控网络如图6所示。
TM-1接受到冷胁迫信号后，激活了部分与钙离结合蛋白基因的表达，使一些转录因子表达上调，从而调控了脱水素、LEA等抗冷功能基因，使TM-1提高了耐冷性；同时冷胁迫也使促进生长的expansin、促进水分吸收的PIP protein受到抑制，从而抑制了植株的生长。
实施例5株高作为陆地棉芽期抗冷性验证
选取前期鉴定出的两个芽期抗冷性差异显著的品种中棉所44和冀棉616(芽期子叶相对平展率分别为51.52％和38.29％，参考王俊娟等，中国农业科学，2016，17(49)：3332-3346)，在28℃条件下催芽3d，然后进行4℃低温处理时5d，正常恢复生长10d，其株高分别为11.2cm和6.2cm(图7)，所以低温4℃低温处理芽期5d恢复生长10-15d的株高可以作为棉花芽期的抗冷性鉴定指标。
实施例6叶绿素含量和侧根作为陆地棉芽期抗冷性指示性鉴定指标的验证
选取前期鉴定出的两个芽期抗冷性差异显著的品种中棉所44和冀棉616(芽期子叶相对平展率分别为51.52％和38.29％，参考王俊娟等，中国农业科学，2016，17(49)：3332-3346)，在28℃条件下催芽3d，然后进行4℃低温处理时5d，正常恢复生长5-7d，测量子叶的叶绿素含量(SPAD值)，由图8可以看出，恢复生长后芽期耐冷性材料子叶叶片发绿，其叶绿素含量明显高于不抗冷材料冀棉616(目测其叶片明显发黄)，两个品种叶绿素含量平均值分别为40.23和28.21，与芽期的抗冷性呈正相关，所以说低温处理后再恢复生长后子叶的叶绿素含量作为陆地棉芽期抗冷性指示性鉴定指标。将恢复生长后的苗洗出后发现，抗冷性材料中棉所44的侧根比较发达，而冀棉616的根系发黑，且侧根基本没有正常发育(图9)，所以说低温处理后恢复生长5-7d的侧根生长量也可以鉴定棉花芽期的抗冷性。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> 一种陆地棉的抗冷性鉴定方法
<130> KHP211118394.0
<160> 22
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aacggagaac caaccaccag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cccaaggctt gtccgattga 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gttagcggtg aaggagcagt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
actcggttac gatcacctcc 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctacggtgg ccaagaaaac 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttgggacagt tctcgggtct 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cttgaagagg aacgctgctg 20
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ttccatttca ctgagagccc c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtgtacgact gcagggtcaa 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
accagaaacg acggtgtcaa 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ctgcttggca ctccaactga 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgttgacgag ggtatgcagg 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agggtttggg accaacacag 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
agcaggcaag caccattttg 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
aggtatggtg ctttgggtgg 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cttggcatca gtggctgaga 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cctcgcttag cacgatggaa 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gccagagcga accctaagtt 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
acttcagtgc cgctgctatt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tcccccatct tggctttgtc 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tggaggacac accataggga 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ttgaggcacg aatgctgagt 20

Claims (5)

1.一种陆地棉子叶期的抗冷性鉴定方法，其特征在于，包括棉苗低温处理获得冷胁迫棉苗，对所述冷胁迫棉苗进行分析；所述低温处理的条件为：培养基质水份含量20%-23%、空气温度1-4℃、空气湿度为50%-65%，开放环境下培养3-7d；
所述低温处理后的棉苗，正常条件下恢复生长7 -15d，以棉苗的子叶伤害指数、子叶的叶绿素含量和株高作为抗冷性鉴定指标；株高经低温处理后比对照处理下降50%以上的材料为冷敏感材料；
所述正常条件为25-28℃，14h光照和12h黑暗培养。
2.权利要求1所述的抗冷性鉴定方法，在棉花育种中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，低温处理后，以抗冷性级别高的棉花品种作为育种材料、育种亲本材料或基因源的筛选材料。
4.一种陆地棉育种方法，其特征在于，在选择亲本及育种过程中，采用权利要求1所述的抗冷性鉴定方法对候选亲本材料及育种中产生的子代材料进行抗冷性鉴定，以叶绿素含量、叶片发黄程度、株高和侧根生长量作为抗冷性鉴定指标。
5.基因CotAD_22633、CotAD_74365和CotAD_09571在陆地棉遗传标准系TM-1育种中的应用。
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