CN109819714A

CN109819714A - 一种可大量筛选水稻苗期耐盐种质的方法

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Publication number: CN109819714A
Application number: CN201910265735.XA
Authority: CN
Inventors: 陈刚; 蒋秋情; 王昆仑; 董姿伶; 左示敏; 陈宗祥
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2019-04-03
Filing date: 2019-04-03
Publication date: 2019-05-31

Abstract

一种可大量筛选水稻苗期耐盐种质的方法，属于生物科学、农业科学技术领域，方法包括器材准备、浸种、播种、培养、盐处理和测定评价，整个过程全程在实验室培养的条件下，所用器材简单易得，实验周期短；可以根据样本容量的大小选择不同的测试指标，不仅可以研究地上部生长情况，还可以研究根系生长。若是大量样本筛选，可选择死叶率和死苗率等可快速测定的指标；本发明既可用于水稻耐盐种质资源筛选及耐盐QTL遗传解析、基因定位，也可广泛用于植物其他抗逆种质资源的筛选与评价，如抗高温、低温、耐重金属、抗干旱、耐缺素等，具有较好的社会和经济效益。

Description

一种可大量筛选水稻苗期耐盐种质的方法

技术领域

本发明属于生物科学、农业科学技术领域，涉及一种水稻耐盐碱性的鉴定与评价方法，特别是涉及一种可大量筛选水稻苗期耐盐种质的方法。

背景技术

土壤盐碱化是制约农作物生长及产量的重要因素，目前全世界的盐碱地有1×10⁹hm²，约占农业用地的20％，仅仅在中国，盐碱地面积就达到1亿hm²。水稻是中度耐盐的作物，曾被作为盐碱地开发利用的先锋植物。但水稻在盐碱地种植一般都会减产，严重时甚至不能完成生活史。

耐盐性属于复杂的数量性状遗传，受多基因控制。对于水稻耐盐碱性的机理与分子机制，前人已经做了大量的研究，总结出了不同耐盐碱性的鉴定与评价方法，同时也筛选出了一些较好反映耐盐碱程度的相关指标。这为水稻耐盐种质的鉴定及耐盐相关性状的遗传机制研究奠定了基础。目前，从水稻中已克隆到一些耐盐基因，如SKC1、AVP1、TPP、DST、OsNHX1、OsCIPK15、转录因子OsDREB2A、NAC等。然而，由于这些基因多数是在过量表达或抑制表达情况下表现出较强的耐盐特性，其同时也严重影响到植株的农艺综合性状，因而其育种利用价值有限。育种实践中更关注那些蕴藏在耐盐种质中的耐盐基因/QTL，尽管当前已经定位到了较多的耐盐QTL，但迄今克隆的还很少。近年的初步研究显示，通过对多个耐盐基因/QTL聚合可进一步提高水稻耐盐性，选育更强耐盐性的水稻。利用分子标记构建高密度的遗传连锁图谱，对选择个体利用分子标记与目标基因分离或紧密连锁筛选优势基因，降低了连锁累赘，从而获得优良的目标个体，育种效率、准确度会大大地提高。因此，除了通过泡田洗盐、暗管排水等合理的水肥管理和化学、生物改良可以减轻对水稻的盐害之外，从现有资源中挖掘具有强耐盐碱能力的水稻种质，发掘其中的优良耐盐基因/QTL，进而通过常规育种与分子标记辅助选择相结合的方法，选育具有广泛适应性的水稻耐盐品种是当前及今后耐盐新品种选育的最主要方向与策略。

苗期是水稻整个生育周期中比较重要的时期，这个时期水稻对各种逆境条件相对比较敏感，如盐胁迫会使水稻幼苗生长受阻，叶片发黄甚至干枯，分蘖变少，根少且发黄，严重影响其生长发育及产量形成。因此，苗期耐盐性鉴定也是水稻耐盐性种质资源筛选的一个重要方面。如果一次性从大量种质资源中筛选耐盐种质，用传统的方法不仅需要大量的栽培器具及栽培空间，而且费时又费力。

发明内容

本发明的目的是为了克服传统筛选方法的不足，提出一种可大量筛选水稻苗期耐盐种质的方法，特别是在实验室培养的条件下，如何快速地筛选苗期耐盐水稻种质的方法。

本发明的技术方案是：一种可大量筛选水稻苗期耐盐种质的方法，其特征在于，包括如下操作步骤：

(1)器材准备：96孔去底PCR板、有机玻璃架、塑料周转箱；

(2)浸种：将水稻种子用H₂O₂溶液浸泡，清水冲洗几遍后再换清水继续浸种至48h；

(3)播种：选取饱满一致的待鉴定水稻种子，将种胚朝下放入PCR管中，一管一粒，PCR板放入周转箱内的有机玻璃架上，8个板/箱，加蒸馏水至接近种子的位置，PCR板上覆盖用蒸馏水浸湿的纱布，待种子长出根后移去纱布；

(4)培养：将种子移入光照培养箱中，设置12h/12h光暗处理，温度设置白天28℃，晚上22℃，光照强度4000lx，待幼苗长至1叶1心时，加入IRRI营养液培养；

(5)盐处理：待幼苗长至3叶1心时，用NaCl进行盐处理，以不加NaCl的营养液培养作为对照；

(6)测定评价：分别测定盐处理后2天、4天、6天、8天幼苗的死叶率和相对叶绿素含量、6天和8天的死亡率等指标，进行幼苗耐盐性评价。

步骤(2)中所述H₂O₂溶液的质量分数为4％，浸泡时间为24h。

步骤(5)中所述NaCl的浓度为0.8％。

步骤(6)中所述的测定评价是以各指标的相对盐害率作为分级标准，将供试水稻的苗期耐盐性分为极强、强、中、弱和极弱五个级别。

所述极强级别的相对盐害率为0～20％，强级别的相对盐害率为20.1％～40％，中级别的相对盐害率为40.1％～60％，弱级别的相对盐害率为60.1％～80％，极弱级别的相对盐害率为80.1％～100％。

本发明的有益效果为：本发明提供的一种可大量筛选水稻苗期耐盐种质的方法，整个过程全程在实验室培养的条件下，所用器材简单易得，实验周期短；可以根据样本容量的大小选择不同的测试指标，不仅可以研究地上部生长情况，还可以研究根系生长。若是大量样本筛选，可选择死叶率和死苗率等可快速测定的指标；本发明既可用于水稻耐盐种质资源筛选及耐盐QTL遗传解析、基因定位，也可广泛用于植物其他抗逆种质资源的筛选与评价，如抗高温、低温、耐重金属、抗干旱、耐缺素等，具有较好的社会和经济效益。

附图说明

图1为本发明中水稻幼苗培养装置结构示意图。

图2为本发明中盐处理前水稻幼苗的生长情况示意图。

图3为本发明中盐处理4天时盐敏感和耐盐表型。

图4为本发明中盐处理6天时盐敏感和耐盐表型。

图5为本发明中盐处理8天时盐敏感和耐盐表型。

图6为本发明中盐处理后不同天数死叶率的品种分布频率。

图7为本发明中盐处理后6天和8天幼苗死亡率的品种分布频率。

图8为本发明中盐处理后不同天数叶绿素含量的品种分布频率。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步说明：

1.材料准备

以来自全国各地的198份水稻品种为试验材料。96孔PCR板(每个PCR小管用剪刀或砂轮磨去管底，保证每个孔口直径均匀一致，且小于种子直径)，周转箱(可根据培养条件选择不同尺寸的周转箱)，自制有机玻璃架(尺寸适合PCR板和周转箱)。如本实施例中选择内径为390mm×270mm×11mm的周转箱，有机玻璃架的高度为80mm，长度380mm,内宽115mm，每个周转箱可放置2个有机玻璃架。每个有机玻璃架可放置4个PCR板。每个周转箱共可放置8个PCR板(图1所示)。

2.浸种

将水稻种子用质量分数为4％的H2O2溶液浸泡24h。清水冲洗几遍后再换清水继续浸种至48h。

3.播种

选取饱满一致的待鉴定水稻种子，将种胚朝下放入PCR管中，一管一粒，每板4个品种，每个品种20粒。并对各个96孔板进行编号，记录各品种摆放顺序，PCR板放入周转箱内的有机玻璃架上，8个板/箱，加蒸馏水至接近种子的位置。PCR板上覆盖用蒸馏水浸湿的纱布，待种子长出根后移去纱布。

4.培养

将种子移入人工气候室中，设置12h/12h光暗处理，温度设置白天28℃，晚上22℃，光照强度4000lx。待幼苗长至1叶1心时，加入IRRI水稻营养液培养，每3天更换一次营养液。最初先用1/4营养液培养，然后过渡到1/2营养液，最后到全营养液培养(图2所示)。

5.盐处理

待幼苗长至3叶1心时，用浓度为0.8％的NaCl进行盐处理，以不加NaCl的营养液培养作为对照。处理时直接将NaCl加入营养液中搅拌混匀，NaCl的加入量根据每个周转箱中营养液的体积而定，本实验为6L/箱，在周转箱6L液面处标记。每天及时补充蒸馏水至标记液面。

6.测定评价

观察盐处理后各水稻品种表型差异。如图3-5所示，盐处理后4天开始，不同品种耐盐性可见明差异，盐处理后8天，大部分水稻幼苗死亡，少量耐盐性极强的品种仍生长较好。

分别测定盐处理后2天、4天、6天、8天幼苗的死叶率、6天和8天的死亡率，选取长势一致的幼苗的第2片叶为待测叶，用SPAD叶绿素计测定叶片上、中、下的叶绿素含量，计算平均值为该叶的叶绿素相对含量，另外，测定第8天各品种幼苗的株高和鲜重，每品种重复9次。如图6-8所示，盐处理后不同天数的死叶率、幼苗死亡率和叶绿素含量品种间差异明显。表1中也可看出，各品种的叶绿素含量和死叶率、死亡率之间相关性很高，苗鲜重和叶绿素含量、死叶率、死亡率也较高，但株高和各指标间的相关性不高。说明可以把叶绿素含量、死叶率、死亡率和苗鲜重作为水稻苗期耐盐性筛选的指标。

以各指标的相对盐害率作为分级标准，将供试水稻的苗期耐盐性分为极强(相对盐害率0-20％)、强(20.1％-40％)、中(40.1％-60％)、弱(60.1％-80％)、极弱(80.1％-100％)。

表1各指标间的相关系数

Claims

1.一种可大量筛选水稻苗期耐盐种质的方法，其特征在于，包括如下操作步骤：

(1)器材准备：96孔去底PCR板、有机玻璃架、塑料周转箱；

(2)浸种：将水稻种子用H₂O₂溶液浸泡，清水冲洗几遍后再换清水继续浸种至48 h；

2.根据权利要求1所述的一种可大量筛选水稻苗期耐盐种质的方法，其特征在于：步骤(2)中所述H₂O₂溶液的质量分数为4%，浸泡时间为24 h。

3.根据权利要求1所述的一种可大量筛选水稻苗期耐盐种质的方法，其特征在于：步骤(5)中所述NaCl的浓度为0.8 %。

4.根据权利要求1所述的一种可大量筛选水稻苗期耐盐种质的方法，其特征在于：步骤(6)中所述的测定评价是以各指标的相对盐害率作为分级标准，将供试水稻的苗期耐盐性分为极强、强、中、弱和极弱五个级别。

5.根据权利要求4所述的一种可大量筛选水稻苗期耐盐种质的方法，其特征在于：所述极强级别的相对盐害率为0～20%，强级别的相对盐害率为20.1%～40%，中级别的相对盐害率为40.1%～60%，弱级别的相对盐害率为60.1%～80%，极弱级别的相对盐害率为80.1%～100%。