CN105274238A - 氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟内参基因的筛选方法及应用 - Google Patents

氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟内参基因的筛选方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种杀虫剂氯虫苯甲酰胺胁迫条件下二化螟内参基因的筛选方法，以及该内参基因的用途。该方法包括以未用药处理的二化螟为对照材料，氯虫苯甲酰胺胁迫后的二化螟为实验材料进行荧光定量PCR检测，将所有备选内参基因的Ct值输入ΔCt，RefFinder，BestKeeper，GeNorm，NormFinder内参基因稳定性分析软件进行分析，筛选出在氯虫苯甲酰胺胁迫条件下二化螟体内最稳定的内参基因TF4。这样，可以采用该基因作为内参基因来准确研究与氯虫苯甲酰胺胁迫下相关基因的表达。

Description

氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟内参基因的筛选方法及应用
技术领域
本发明属于分子生物学中实时荧光定量PCR内参基因表达稳定性的技术领域，尤其涉及一种不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟内参基因的筛选方法及应用。
背景技术
二化螟Chilosuppressalis属于鳞翅目螟蛾科，是我国水稻上重要害虫，为害水稻形成枯鞘、枯心、白穗、枯孕穗和虫伤株等症状，造成巨大经济损失。随着水稻耕作制度的更新和水稻品种的改变，二化螟的种群数量逐年增加。
近年来，稻田二化螟的防治很大程度上依赖于化学农药氯虫苯甲酰胺。但是由于长期大量使用该药剂，使得二化螟在氯虫苯甲酰胺不断选择胁迫下产生严重抗药性。因此，研究二化螟对氯虫苯甲酰胺抗性机理对于田间二化螟抗性发展过程、抗性治理及其综合防控具有重要意义。
研究二化螟与对氯虫苯甲酰胺胁迫后体内相关基因的种类及功能，其中最基本的技术方法就是对功能基因进行简单、快速、准确的表达定量分析。与传统的印记杂交，半定量RT-PCR等定量分析方法比较，实时荧光定量PCR具有操作简单、特异性强、灵敏度高、线性关系好、成本低等优点，是近年来最受科研工作者青睐的基因表达定量的方法。实时荧光定量PCR是一种在PCR扩增反应中，以荧光化学物质测每次PCR循环后产物总量的方法。它是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时监测和检测。一般通过内参法即利用内参基因对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，Ct变异小是内参基因的必须满足的首要条件，所以合适内参基因的选择成为定量的依据。因此，实时荧光定量PCR检测的准确性很大程度上取决于内参基因的选择。理想的内参基因在各个外界因素的胁迫下，在各组织和细胞中的表达是恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正样品量以及实验过程中存在的误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正样品量之间的误差，这样获得的实验结果才更为可信。昆虫中常用的内参基因有Rps3,Actin,GAPDH,Tublin,Rpl10,18SrRNA,28SrRNA等，但实际上没有任何一个内参基因mRNA表达水平在所有外在或内在的条件下都是恒定的，理想的内参基因是不存在的。所以，一般要选择一个在处理因素作用的条件下表达相对稳定的基因作内参基因或内参标准，这是实时荧光定量PCR成功与否的关键所在。
因此，有必要进行二化螟与对氯虫苯甲酰胺胁迫后，进行一些功能基因的研究，期望可以获得一些内参基因，从而为采用实时荧光定量PCR研究二化螟体内其他功能基因提供帮助。
发明内容
昆虫体内的P450基因是与杀虫剂解毒代谢相关的重要基因。在本发明小组的工作中，我们通过转录组测序技术获得了二化螟细胞色素P450基因包括CYP306a1，CYP6a2等，但这些基因在二化螟体内对氯虫苯甲酰胺胁迫的反应尚未见报道，也无研究关于氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟体内稳定的内参基因的相关报道，同时也无报道在氯虫苯甲酰胺胁迫下，利用合适的内参基因来考察P450的表达的报道。
本发明提供一种氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟内参基因的筛选方法及应用，为二化螟在不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下进行实时荧光定量PCR反应时合适内参基因的选择提供依据。
一方面，TF4基因用作不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟实时荧光定量PCR中的内参基因的用途。
优选的，TF4基因作为考察氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟体内与杀虫剂解毒代谢相关的基因表达量的内参基因的用途。
优选的，考察二化螟体内与杀虫剂解毒代谢相关的基因表达量的方法为实时荧光定量PCR。
优选的，本发明提供TF4基因作为内参基因在采用实时荧光定量PCR进行检测氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟体内与杀虫剂解毒代谢相关的基因表达量上的用途。
优选的，TF4基因为SEQIDNO:10所示的片段。
优选的，与杀虫剂解毒代谢相关的基因包括P450基因。
优选的，所述的P450基因包括CYP6a2。
优选的，P450基因为SEQIDNO:12所示的片段。
优选的，P450基因的引物序列为：正：TGACACCAAAAGGAGCGGAA，反：TGCACTCATCATCCGTTGCT。
另一方面，本发明提供一种方法，采用该方法可以筛选出合适的内参基因，该内参基因可以作为氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟体内相关功能基因表达量的研究。优选的，该功能目的基因为P450基因。该方法包括：提供备选的内参基因；以未处理的二化螟为对照，采用三个不同浓度的氯虫苯甲酰胺剂量对二化螟3龄幼虫进行胁迫处理，处理后收集二化螟样品，立即提取总RNA，测定RNA浓度，将RNA反转录合成cDNA，然后以各样品cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR对备选内参基因进行验证，采用△Ct，RefFinder，BestKeeper，GeNorm，NormFinder软件进行数据分析，从而筛选出二化螟3龄幼虫体内在氯虫苯甲酰胺胁迫条件下最稳定表达的内参基因。
优选的，所述备选的内参基因为β-微管蛋白(Beta-tubulin，TUB)，延伸因子-1α(Elongationfactor-1α，EF1)，E2F转录因子4(E2Ftranscriptionfactor4，TF4)，3-磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)，精氨酸激酶(ArgininaseKinase，AK)，核糖体蛋白S2(RibosomalproteinS2，RPS2)，核糖体蛋白S3(RibosomalproteinS3，RPS3)，核糖体蛋白S5(RibosomalproteinS5，RPS5)，核糖体蛋白L10(RibosomalproteinL10，RPL10)，β-肌动蛋白Beta-Actin(ACTB)，肌动蛋白A1(ActinA1，ACTA1)。优选的，所述的进行实时荧光定量PCR方法对备选的11个基因所对应的引物为：Beta-tubulin(TUB)：正：CTCCGACTTACAGTTAGAGC，反：AGTACTGAATCGACAAGCTC；Elongationfactor-1α(EF1)：正：CTGGGTATTGGACAAACTGA，反：GAGGTTCCTGTGATCATGTT；E2Ftranscriptionfactor4(TF4)：正：TTTGATTACTAACGGGTGCA，反：TTCTTCAACTTCAAGCGAGA；Glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase(GAPDH)：正：GGGTATTCTTGACTACAC，反：CTGGATGTACTTGATGAG；ArgininaseKinase(AK)：正：CTGAAGAAGTACCTTACC，反：CAATCCAGCAGAGTTGAG；RibosomalproteinS2(RPS2)：正：CATACCCAGCGAGTTGATTA，反：CAAAAGAGCAGCAAGACAAA；RibosomalproteinS3(RPS3)：正：CGGAGATCATCATTATGG，反：GAGTTTGTATCTGAGAGAC；RibosomalproteinS5(RPS5)：正：GAGTAGGAAGAGGAGGTTCT，反：TTGGCTGAACTCCTAATTCC；RibosomalproteinL10(RPL10)：正：GACTTGGGTAAGAAGAAG，反：GATGACATGGAATGGATG；Beta-Actin(ACTB)：正：GATCATGTTTGAGACCTT；反：GATCTTCATGAGGTAGTC；ActinA1(ACTA1)：正：GTATTGTCCGGTGGTACTAC，反：GGAGCGATGATCTTGATCTT。
优选的，P450基因的引物序列为：正：TGACACCAAAAGGAGCGGAA，反：TGCACTCATCATCCGTTGCT。
优选的，三个不同浓度的氯虫苯甲酰胺剂量对二化螟3龄幼虫进行胁迫处理的方法为：分别利用浓度为50ppm，100ppm，200ppm的氯虫苯甲酰胺处理3天及0.1％TritonX-100水处理的二化螟3龄幼虫为实验材料，提取总RNA，测RNA浓度，反转录合成cDNA进行实时荧光定量PCR分析；
优选的，二化螟cDNA按5倍等比稀释成5个不同浓度。
优选的，二化螟的饲养条件从稻田采集的二化螟幼虫，在人工气候室：温度25℃，湿度75％，光照：黑暗＝14小时：10小时的条件下，用人工饲料饲养2代后，利用3龄幼虫进行氯虫苯甲酰胺胁迫处理；
优选的，氯虫苯甲酰胺胁迫方法如下：(1)、将氯虫苯甲酰胺原药用丙酮配制成500ppm的母液，再将母液用含0.1％TritonX-100蒸馏水稀释成50ppm，100ppm和200ppm的工作液；(2)、将高20cm稻苗倒置浸入配制好的药液中，浸渍到稻苗基部10s，取出晾干至无明水，将稻茎齐根剪下，去除上部叶片，留下5cm的茎秆；放入事先准备好的中号培养皿(每皿底部垫入四层滤纸，加入3mL无菌水保湿)中，每皿10根茎秆；按试验设计剂量从低到高的顺序重复上述操作，每处理3个重复，以含0.1％TritonX-100的蒸馏水溶液作空白对照；(3)、用毛笔将试虫接入培养皿中，每皿10头，用两层黑棉布覆盖后再盖上培养皿盖，处理后的二化螟幼虫放置于温度为28±1℃，光周期为16h﹕8h(L﹕D)条件下饲养和观察3天后，收集试虫活体样品提取总RNA；每个处理设置3个生物学重复。
优选的，实时荧光定量PCR的体系和条件分别为：实时荧光定量PCR的反应体系：定量PCR反应体系共20μL，包含1μL的cDNA(含有总RNA3μg)，10μLSYBR荧光试剂(iTaqUniversalSYBRGreenSupermix)，正/反向引物各1μL，双蒸水7μL；实时荧光定量PCR的反应条件：95℃30S，95℃10S，55℃30S共40个循环。融解曲线：55℃到95℃，每0.5℃收集一次荧光信号。每个样本设置2个技术重复。
另一方面，本发明提供利用内参基因来检测P450基因在二化螟被氯虫苯甲酰胺胁迫后的定量表达量的方法，该方法包括：3龄幼虫为实验材料，以筛选出的最稳定的TF4基因为内参基因，二化螟P450基因为目的基因分析P450在氯虫苯甲酰胺胁迫后二化螟体内的表达规律。
优选的，氯虫苯甲酰胺胁迫浓度为：50ppm，100ppm，200ppm，处理时间为3天。
优选的，优选的，TF4基因为SEQIDNO:10所示的片段。
优选的，与杀虫剂解毒代谢相关的基因包括P450基因。
优选的，所述的P450基因为CYP6a2。
优选的，P450基因为SEQIDNO:12所示的片段。
优选的，P450基因的引物序列为：正：TGACACCAAAAGGAGCGGAA，反：TGCACTCATCATCCGTTGCT。
优选的，TF4基因引物序列为:正：TTTGATTACTAACGGGTGCA，反：TTCTTCAACTTCAAGCGAGA。
优选的，实时荧光定量PCR技术来检测目的基因和内参基因的表达量。
本发明使用的内参基因稳定性分析软件共5种。其中，△Ct法较为简单，通过比较每一对持家基因在每个样品的相对表达来确定适合的内参基因。BestKeeper通过原始Ct值和引物扩增效率(E)决定出最适内参基因，并依次排序。可以比较100个样品中多个内参基因和多个目的基因的表达水平。操作时把原始Ct值数据输入BestKeeper软件的Excel表格中，运行后内参基因和目的基因进行单独分析。该程序在每个基因之间产生配对的相关系数和BestKeeper指数，即每个候选基因Ct值的几何平均数)，根据其值的大小进行比较，其优点是不但可以分析内参基因的稳定性，而且可以比较目的基因的表达水平。GeNorm程序可用于筛选任何条件下任意数量内参基因，选择出两个以上内参基因，而不是传统地使用单一内参基因。这将有利于系统偏差的校正，得到更可靠的基因准确定量结果，对于细微表达差异的生物学研究具有极其重要的意义。此外，GeNorm可通过标准化因子配对差异分析得出两两比较的变异值V，最终选择适合的内参基因数量，这有利于校正系统偏差，得到更准确的基因表达定量结果。当Vn/n+1值小于阈值0.15时，说明最合适的基因内参数目为n，即选择前n个基因作为内参基因。NormFinder程序运行原理与GeNorm程序类似，可直接运算出各基因的表达稳定值(M)，然后根据M值的大小排序，M值越小，稳定性越高。其缺点是只能选择1个合适的内参基因作标准。RefFinder(http://www.leonxie.com/referencegene.php？type＝reference)是一个免费的网络综合评价内参基因稳定性的工具，可从大量的实验数据集评估和筛选内参基因。它能综合BestKeeper，geNorm，NormFinder和△Ct四种方法的结果来对候选内参基因作出最终的稳定性排序。
有益效果
本发明提供了二化螟在不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫条件下内参基因筛选的方法，为不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟体内基因表达谱分析提供了稳定的内参基因参考，为其他物种在特定实验条件下实时荧光定量PCR内参基因的筛选提供了借鉴。应用本发明可建立在不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下，利用实时荧光定量PCR检测二化螟体内各基因的方法。
附图说明
图1不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫后二化螟各样品(各个备选基因)的Ct值。
图2△Ct方法分析不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟内参基因表达的稳定性，平均稳定值越小越稳定。
图3BestKeeper软件分析不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟内参基因表达的稳定性，平均稳定值越小越稳定。
图4GeNorm软件分析不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟内参基因表达的稳定性，平均稳定值越小越稳定。
图5NormFinder软件分析不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟内参基因表达的稳定性，平均稳定值越小越稳定。
图6RefFinder软件分析不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟内参基因表达的稳定性，平均稳定值越小越稳定。
图7GeNorm软件分析不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟内参基因表达最合适的内参基因数目。
图8以TF4为内参基因，利用实时荧光定量PCR方法分析不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫后二化螟体内P450基因(CYP6a2)的相对定量表达水平。
图9备选内参基因及目的基因序列。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图对本发明进行进一步说明。其中内参基因稳定性分析软件的使用按其使用说明进行。
一、二化螟的饲养。
从稻田采集的二化螟幼虫，在人工气候室：温度25℃，湿度75％，光照：黑暗＝14小时：10小时的条件下，用人工饲料饲养到第2代后，利用3龄幼虫进行氯虫苯甲酰胺胁迫处理。二、氯虫苯甲酰胺胁迫处理
1.将氯虫苯甲酰胺原药用丙酮配制成500ppm的母液，再将母液用含0.1％TritonX-100蒸馏水稀释成50ppm，100ppm和200ppm的工作液。
2.将高20cm稻苗倒置浸入配制好的药液中，浸渍到稻苗基部10s，取出晾干至无明水，将稻茎齐根剪下，去除上部叶片，留下5cm的茎秆；
3.5cm的茎秆放入事先准备好的中号培养皿(每皿底部垫入四层滤纸，加入3mL无菌水保湿)中，每皿10根茎秆；按试验设计剂量从低到高的顺序重复上述操作，每处理3个重复，以含0.1％TritonX-100的蒸馏水溶液作空白对照。
4.用毛笔将3龄幼虫接入培养皿中，每皿10头，用两层黑棉布覆盖后再盖上培养皿盖，处理后的二化螟幼虫放置于温度为28±1℃，光周期为16h﹕8h(L﹕D)条件下饲养和观察3天后，收集活体样品提取总RNA；每个处理设置3个生物学重复。
三、实时荧光定量PCR所分析的所有基因的引物设计及扩增效率。
1.引物的设计
从本发明小组前期工作所测的二化螟转录组数据中选择11种常用的内参基因作为备选基因和1种与杀虫剂解毒代谢相关的基因作为目的基因，利用primer3.0软件设计特异性扩增引物用于荧光定量PCR扩增(表1)。
2.RNA提取过程
取5头二化螟3龄幼虫放入2.0mL玻璃匀浆器中，加入500μLTrizol试剂，手动匀浆5min，此后步骤参照Trizol试剂(Invitrogen，批号：15596026)说明书完成。RNA质量和浓度检测：取1μLRNA样品，利用NanoDrop2000检测OD260/280和浓度，OD260/280值介于1.8-2.2为合格样品。第一链cDNA的合成：利用3μgRNA进行反转录，步骤参照ThermoFisher反转录试剂盒(ThemoFisher，批号：K1622)说明书进行。
表1用于实时荧光定量PCR扩增的二化螟体内备选内参基因及目的基因的引物序列及扩增效率。
3.反转录合成的cDNA的扩增。
以上述反转录合成的cDNA为模板，利用设计合成的特异性引物(表1)PCR扩增备选内参基因和目的基因，采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段长度是否与选取的目的片段一致，然后回收PCR产物并测序进行验证。发现利用以上设计的引物可以有效扩增出目的片段，与我们设计的目的片段大小一致，条带单一，无特异性扩增。PCR扩增体系：20μL反应体系包含10μL2XPCRbufferMix，正/反向引物各1μL，cDNA模板1μL，灭菌水7μL。
4.引物扩增效率的考察
以上述反转录合成的cDNA按5倍等比稀释成5个不同浓度的cDNA为模板，利用设计合成的特异性引物(表1)进行荧光定量PCR扩增备选内参基因和目的基因。实时荧光定量PCR的反应体系共20μL，包含1μL的cDNA(含有总RNA3μg)，10μL2XiTaqSYBRGreen荧光试剂(2XiTaqUniversalSYBRGreenSupermix)，正/反向引物各1μL，双蒸水7μL，其中SYBRGreen荧光试剂购于Bio-Rad公司；反应条件：95℃30S，95℃10S，55℃30S共40个循环。融解曲线：55℃到95℃，每0.5℃收集一次荧光信号。引物扩增效率由实时荧光定量PCR仪自带软件给出，以扩增效率E(％)是否在90％-110％之间判断引物是否合适(表1)。仪器为CFX96，Bio-Rad公司。
5.实时荧光定量PCR
以上述cDNA为模板，对备选内参基因和目的基因进行荧光定量PCR扩增(表1)，反应体系和反应条件参照【引物扩增效率的考察】一节。实时荧光定量PCR的反应体系共20μL，包含1μL的cDNA(含有总RNA3μg)，10μL2XiTaq荧光试剂，正/反向引物各1μL，双蒸水7μL，其中SYBRGreen荧光试剂购于Bio-Rad公司；反应条件：95℃30S，95℃10S，55℃30S共40个循环。融解曲线：55℃到95℃，每0.5℃收集一次荧光信号。
6.荧光定量PCR数据分析
将实时荧光定量PCR获得的Ct值，按照分析软件格式要求输入到各软件进行分析。△Ct法较为简单，通过比较每一对持家基因在每个样品的相对表达来确定适合的内参基因。
BestKeeper通过原始Ct值和引物扩增效率(E)决定出最适内参基因，并依次排序。GeNorm可通过标准化因子配对差异分析得出两两比较的变异值V，最终选择适合的内参基因数量，这有利于校正系统偏差，得到更准确的基因表达定量结果。当Vn/n+1值小于阈值0.15时，说明最合适的基因内参数目为n，即选择前n个基因作为内参基因。NormFinder可直接运算出各基因的表达稳定值(M)，然后根据M值的大小排序，M值越小，稳定性越高。RefFinder可以用来分析以上四种方法的结果，它能综合BestKeeper，geNorm，NormFinder和△Ct四种方法的结果来对候选内参基因作出最终的稳定性排序。
7.内参基因稳定性分析结果
传统来讲，实时荧光定量PCR开展时一般采用单一常见的内参基因，事实证明，这种操作方法是不可取的，任何外在条件或者内在条件的改变都会影响内参基因表达的稳定性。此外，利用不同的内参基因分析同一目的基因的表达量变化差异非常显著，有的甚至可以达到几十倍的差异，严重影响实验结果的可靠性。因此，本发明提供了不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟内参基因的筛选方法及其应用。从图1可以看出，11种不同的备选基因，他们的Ct值变异较大，Ct最小的为11.70，最大的为37.10，Ct变异最大的为RPS2，变异最小的为EF1基因(图1)。而Ct值变异大小是一个因为能否作为内参基因的首要筛选条件，合适的内参基因的Ct值需适中，大约在15-25之间，表达过高(Ct很小)或过低(Ct值很大)的基因均不适合做内参基因。此外，不同基因的Ct变化如此之大说明这些基因在该农药试剂的不同浓度的胁迫处理下，他们的表达量并不是恒定不变的，相反处于变化的状态中。
本发明利用5种分析软件评价了备选内参基因稳定性。△Ct方法分析结果显示备选基因的稳定性次序为：TF4>ACTA>TUB>EF1>RPL10>ACTB>GAPDH>AK>RPS5>RPS3>RPS2(图2)，通过该方法进行分析，发现在形同处理条件下，TF4最稳定。但是同样的数据经过BestKeeper分析，他们的准定性排序发生了变化，备选基因的稳定性如下：EF1>TUB>ACTB>TF4>ACTA>RPS5>AK>RPL10>RPS2>GAPDH>RPS3(图3)，其中EF1最稳定；同样的数据经过GeNorm分析，备选基因的稳定性如下：TF4>ACTA>TUB>EF1>ACTB>RPL10>AK>RPS5>GAPDH>RPS3>RPS2(图4)其中TF4最稳定；NormFinder分析备选基因的稳定性：TF4>ACTA>TUB>RPL10>EF1>ACTB>GAPDH>AK>RPS5>RPS3>RPS2(图5)，其中TF4最稳定；RefFinder分析备选基因的稳定性：TF4>ACTA>TUB>EF1>ACTB>RPL10>AK>RPS5>GAPDH>RPS3>RPS2(图6)，其中TF4最稳定。综合上述分析结果，四种分析软件结果显示不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下最稳定的内参基因为TF4(图2，图4-6)，而BestKeeper软件的分析结果显示EF1表达稳定性最高(图3)，但是EF1的Ct值较小，说明此基因表达量相当高，上述分析提到过，表达过高或过低的基因均不适合做内参基因，因此我们认为TF4是不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟体内最适合的内参基因。此外，GeNorm关于最适内参基因数目的分析结果中显示V2/3<0.15，说明在不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟进行荧光定量PCR检测时，最合适的内参基因数目是2个即TF4和ACTA。综合以上5种分析方法得出结果，筛选出不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟3龄幼虫中最适合的内参基因为TF4。
四、内参基因的应用
氯虫苯甲酰胺胁迫
以不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫3天的二化螟3龄幼虫为实验样本，未用药剂处理的3龄幼虫为对照样本，TF4为内参基因，利用实时荧光定量PCR检测二化螟P450基因(CYP6a2)的表达水平。反应体系和反应条件参照上述实时荧光定量PCR的操作过程、条件和体系。实时荧光定量PCR的反应体系共20μL，包含1μL的cDNA(含有总RNA3μg)，10μL2XiTaq荧光试剂，正/反向引物各1μL，双蒸水7μL，其中SYBRGreen荧光试剂购于Bio-Rad公司；反应条件：95℃30S，95℃10S，55℃30S共40个循环。融解曲线：55℃到95℃，每0.5℃收集一次荧光信号。每个处理设置2个技术重复，3个生物学重复。数据处理采用2-△△Ct方法处理，△△Ct＝△Ct处理样本-△Ct对照样本，△Ct＝△Ct目的基因-△Ct内参基因。各处理间差异显著性采用DPS软件进行统计分析。
结果显示：随着氯虫苯甲酰胺浓度升高，二化螟P450基因的表达逐渐上调；各浓度处理的二化螟P450基因表达与对照的均呈现显著差异。
本发明利用实时荧光定量PCR对不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫条件下二化螟体内11种备选内参基因和1种目的基因进行了定量扩增，并采用△Ct，RefFinder，BestKeeper，GeNorm，NormFinder共5种软件分析了内参基因稳定性，筛选出在不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫条件下二化螟体内最稳定的内参基因TF4。在此基础上，以二化螟P450为目的基因，TF4为内参基因，明确了在不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫条件下二化螟P450基因的表达规律。此发明筛选出的内参基因TF4适合不同浓度氯虫苯甲酰胺胁迫条件下二化螟体内目的基因的表达谱分析，为以后氯虫苯甲酰胺胁迫条件下二化螟基因的定量PCR实验提供了参考。
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<120>Title:氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟内参基因的筛选方法及应用
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Claims (14)

1.TF4基因作为定量检测二化螟在氯虫苯甲酰胺胁迫下体内与该杀虫剂解毒代谢相关基因表达量的内参基因的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，检测二化螟体内与杀虫剂解毒代谢相关的基因表达量的方法为实时荧光定量PCR。
3.根据权利要求1或2所述的用途，TF4基因为SEQIDNO:10所示的片段。
4.根据权利要求2所述的用途，与杀虫剂解毒代谢相关的基因为P450基因。
5.根据权利要求4所述的用途，所述的P450基因为CYP6a2。
6.根据权利要求4所述的用途，P450基因为SEQIDNO:12所示的片段。
7.根据权利要求4所述的用途，P450基因所使用的引物序列为：正：TGACACCAAAAGGAGCGGAA，反：TGCACTCATCATCCGTTGCT。
8.根据权利要求7所述的用途，TF4基因所使用的引物序列为:正：TTTGATTACTAACGGGTGCA，反：TTCTTCAACTTCAAGCGAGA。
9.一种筛选氯虫苯甲酰胺胁迫下二化螟体内内参基因的方法，该方法包括：
提供备选的内参基因
以未处理的二化螟为对照，采用三个不同浓度的氯虫苯甲酰胺剂量对二化螟3龄幼虫进行胁迫处理，处理后收集二化螟样品，立即提取总RNA，测定RNA浓度，将RNA反转录合成cDNA，然后以各样品cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR对所述备选内参基因进行验证，采用△Ct，RefFinder，BestKeeper，GeNorm，NormFinder软件进行数据分析，从而筛选出二化螟3龄幼虫体内在氯虫苯甲酰胺胁迫条件下最稳定表达的内参基因。
10.一种检测P450基因在二化螟被氯虫苯甲酰胺胁迫后的定量表达量的方法，该方法包括：以TF4基因为内参基因，检测P450基因在二化螟被氯虫苯甲酰胺胁迫后的定量表达量，其中定量表达量的方法为使用实时荧光定量PCR进行检测。
11.根据权利要求10所述的方法，3龄幼虫为实验材料，氯虫苯甲酰胺胁迫浓度为：50ppm，100ppm，200ppm，处理时间为3天。
12.根据权利要求10所述的方法，TF4基因为SEQIDNO:10所示的片段。
13.根据权利要求10所述的方法，P450基因为SEQIDNO:12所示的片段。
14.根据权利要求10所述的方法，P450基因的引物序列为：正：TGACACCAAAAGGAGCGGAA，反：TGCACTCATCATCCGTTGCT；TF4基因引物序列为:正：TTTGATTACTAACGGGTGCA，反：TTCTTCAACTTCAAGCGAGA。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106957922A (zh) * 2017-05-19 2017-07-18 浙江省农业科学院 Tmem209基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂基因表达量中的应用
CN106967830A (zh) * 2017-05-19 2017-07-21 浙江省农业科学院 Zfp基因作为内参基因在定量检测螟黄赤眼蜂基因表达量中的应用
CN107043822A (zh) * 2017-05-19 2017-08-15 浙江省农业科学院 Rps23基因作为内参基因在定量检测螟黄赤眼蜂基因表达量中的应用
CN107119132A (zh) * 2017-05-19 2017-09-01 浙江省农业科学院 Pabpc1基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂基因表达量中的应用
CN112048511A (zh) * 2020-09-18 2020-12-08 中国水稻研究所 Als类除草剂胁迫下棒头草稳定表达的内参基因、筛选方法及应用
CN112210617A (zh) * 2020-08-24 2021-01-12 浙江省农业科学院 适用于桑黄生长发育研究的内参基因及其内参引物的筛选方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103966242A (zh) * 2013-01-25 2014-08-06 中国农业科学院植物保护研究所 大草蛉p450新基因及其应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103966242A (zh) * 2013-01-25 2014-08-06 中国农业科学院植物保护研究所 大草蛉p450新基因及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
XIAOLU TENG等: "Validation of reference genes for quantitative expression analysis by real-time RT-PCR in four lepidopteran insects", 《JOURNAL OF INSECT SCIENCE》 *
梁立成等: "3种药剂对稻纵卷叶螟和二化螟不同龄期幼虫的毒效及抑制取食作用", 《南方农业学报》 *

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106957922A (zh) * 2017-05-19 2017-07-18 浙江省农业科学院 Tmem209基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂基因表达量中的应用
CN106967830A (zh) * 2017-05-19 2017-07-21 浙江省农业科学院 Zfp基因作为内参基因在定量检测螟黄赤眼蜂基因表达量中的应用
CN107043822A (zh) * 2017-05-19 2017-08-15 浙江省农业科学院 Rps23基因作为内参基因在定量检测螟黄赤眼蜂基因表达量中的应用
CN107119132A (zh) * 2017-05-19 2017-09-01 浙江省农业科学院 Pabpc1基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂基因表达量中的应用
CN107043822B (zh) * 2017-05-19 2019-09-17 浙江省农业科学院 Rps23基因作为内参基因在定量检测螟黄赤眼蜂基因表达量中的应用
CN107119132B (zh) * 2017-05-19 2019-11-26 浙江省农业科学院 Pabpc1基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂基因表达量中的应用
CN106967830B (zh) * 2017-05-19 2019-12-24 浙江省农业科学院 Zfp基因作为内参基因在定量检测螟黄赤眼蜂基因表达量中的应用
CN106957922B (zh) * 2017-05-19 2019-12-24 浙江省农业科学院 Tmem209基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂基因表达量中的应用
CN112210617A (zh) * 2020-08-24 2021-01-12 浙江省农业科学院 适用于桑黄生长发育研究的内参基因及其内参引物的筛选方法
CN112210617B (zh) * 2020-08-24 2022-05-10 浙江省农业科学院 适用于桑黄生长发育研究的内参基因及其内参引物的筛选方法
CN112048511A (zh) * 2020-09-18 2020-12-08 中国水稻研究所 Als类除草剂胁迫下棒头草稳定表达的内参基因、筛选方法及应用
CN112048511B (zh) * 2020-09-18 2023-09-22 中国水稻研究所 Als类除草剂胁迫下棒头草稳定表达的内参基因、筛选方法及应用

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