CN107119132A - Pabpc1基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂基因表达量中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，提供了PABPC1基因在定量检测稻螟赤眼蜂基因表达量中作为内参基因的应用。稻螟赤眼蜂在受到高温或低温胁迫时，PABPC1基因能够在稻螟赤眼蜂体内稳定表达，因此将该基因作为内参基因来准确研究稻螟赤眼蜂体内与温度胁迫下相关基因的表达情况。

Description

PABPC1基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂基因表达量 中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别涉及PABPC1基因在定量检测稻螟赤眼蜂基因表达量中作为内参基因的应用。

背景技术

稻螟赤眼蜂Trichogramma japonicun Ashmead属于膜翅目赤眼蜂科，是一种重要的害虫天敌。其成虫将卵产在寄主卵内，在寄主卵内取食、发育致使寄主卵死亡，从而达到将害虫消灭在危害之前的目的。虽然在生态上对稻螟赤眼蜂的研究较多，但对分子机理上的研究非常少。如已经有研究显示不同地理种群对稻螟赤眼蜂耐高温或耐低温的能力有所不同，但是稻螟赤眼蜂如何应对高温低温的机理还有待进一步开展研究。若能明确稻螟赤眼蜂耐高低温的机制，将对种群的筛选、放蜂效果的提高都能带来突破。

研究稻螟赤眼蜂不同温度胁迫后体内相关基因的功能，其中最基本的技术方法就是对功能基因进行简单、快速、准确的表达定量分析。与传统的印迹杂交，半定量RT-PCR等定量分析方法比较，实时荧光定量PCR具有操作简单、特异性强、灵敏度高、线性关系好、成本低等优点，是近年来最受科研工作者青睐的基因表达定量的方法。然而，实时荧光定量PCR检测的准确性很大程度上取决于内参基因的选择，其作用是校正样品量以及实验过程中存在的误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正样品量之间的误差，这样获得的实验结果才更为可信。昆虫中常用的内参基因有RPS3、Actin、GAPDH、Tublin、RPL10、18S rRNA、28S rRNA等，但实际上没有任何一个内参基因mRNA表达水平在所有外在或内在的条件下都是恒定的，理想的内参基因是不存在的，不同物种之间差异更是巨大。所以，一般要选择一个在处理因素作用的条件下表达相对稳定的基因作内参基因或内参标准，这是实时荧光定量PCR成功与否的关键所在。

因此，要对稻螟赤眼蜂进行相关的耐高温耐低温机制研究，明确与耐高温耐低温相关的基因，就必须先筛选出合适的内参基因。昆虫体内的热激蛋白基因是与温度胁迫相关的重要基因，包括热激蛋白基因hsp20，hsp40，hsp70及hsp90，但这些基因在稻螟赤眼蜂体内对温度胁迫的反应尚未见报道，也无研究关于温度胁迫下稻螟赤眼蜂体内稳定的内参基因的相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供了PABPC1基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂体内与温度调节相关基因的表达量的应用，为稻螟赤眼蜂在不同温度胁迫下进行实时荧光定量PCR反应时选择合适内参基因提供依据。

一方面，PABPC1基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂体内与温度调节相关基因的表达量的应用。

优选的，PABPC1基因作为内参基因在定量检测温度胁迫下稻螟赤眼蜂体内与适应温度调节相关基因的表达量的用途。

其中，所述定量检测的方法优选为实时荧光定量PCR。

本发明中，所述PABPC1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，在对稻螟赤眼蜂体内与适应温度调节相关基因的表达量进行定量检测时，扩增所述PABPC1基因的引物序列如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示。

本发明中，所述与温度调节相关的基因优选为热激蛋白基因。进一步优选的，所述热激蛋白基因为hsp70，所述hsp70的基因序列如SEQ ID NO:11所示。

优选的，在对稻螟赤眼蜂体内hsp70基因进行定量检测时，扩增所述hsp70基因的引物序列如SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示。

另一方面，本发明提供一种定量检测热激蛋白hsp70基因在稻螟赤眼蜂被温度胁迫后的表达量的方法，该方法包括：以PABPC1基因为内参基因，检测hsp70基因在稻螟赤眼蜂被温度胁迫后的定量表达量，其中所述定量检测表达量的方法为实时荧光定量PCR。

其中，所述温度胁迫包括高温胁迫和低温胁迫，所述高温胁迫的温度优选为30℃～40℃，所述低温胁迫的温度优选为4℃～10℃。所述温度胁迫的时间优选为0.5～4小时。

优选的，所述PABPC1基因的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明在对稻螟赤眼蜂体内hsp70基因表达量进行定量检测时，扩增所述PABPC1基因的引物序列优选为SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示序列。扩增所述hsp70基因的引物序列优选为：SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:33所示序列。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

本发明为稻螟赤眼蜂体内基因表达谱分析提供了稳定的内参基因参考，为其他物种在特定实验条件下实时荧光定量PCR内参基因的筛选提供了借鉴。应用本发明可建立在不同温度胁迫下，利用实时荧光定量PCR检测稻螟赤眼蜂体内各基因的方法，减少检测误差，使检测结果更加准确可靠。

附图说明

图1：RefFinder软件分析不同温度胁迫下稻螟赤眼蜂内参基因表达的稳定性，平均稳定值越小越稳定。

图2：以PABPC1为内参基因，利用实时荧光定量PCR方法分析不同温度胁迫后稻螟赤眼蜂体内hsp70基因的相对定量表达水平。

具体实施方式

本发明采用下述方法筛选定量检测稻螟赤眼蜂体内与温度调节相关的基因表达量的内参基因。采用该方法可以筛选出合适的内参基因，并且可以作为温度胁迫下稻螟赤眼蜂体内相关功能基因表达量的研究。

该方法包括：提供备选的内参基因；以未处理的稻螟赤眼蜂为对照，采用低温和高温对稻螟赤眼蜂成虫进行胁迫处理，处理后收集稻螟赤眼蜂样品，立即提取总RNA，测定RNA浓度，将RNA反转录合成cDNA，然后以各样品cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR对备选内参基因进行验证，采用RefFinder软件进行数据分析，从而筛选出稻螟赤眼蜂在温度胁迫条件下最稳定表达的内参基因。

本发明中，稻螟赤眼蜂体内与温度相关的功能基因优选为热激蛋白基因，如热激蛋白基因hsp20，hsp40，hsp70及hsp90等。在本发明具体实施例中优选功能目的基因为hsp70基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

本发明对内参基因的筛选过程中，备选的内参基因为以下10种：

多聚腺苷酸结合蛋白(Polyadenylate binding protein 1，PABPC1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；

剪切因子(Splicing factor，SF)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；

延伸因子1(Elonggation factor 1,EF1)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

酪蛋白激酶(Caseinkinase 1 alpha，CK1a)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

延伸因子1Delta(Elonggation factor 1Deta，EF1D)，其核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示；

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

肌动蛋白11(Actinrelatedprotein 2,ARP2)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

跨膜蛋白(Transmembrane protein 209，TMEM209)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；

肌动蛋白213(Actin related protein 213,ARP213)，其核苷酸序列如SEQ IDNO:9所示；

ATP合成酶(ATP synthase)，其核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

本发明选用的稻螟赤眼蜂优选为同一生理状态下的稻螟赤眼蜂。在本发明的具体实施例中，采用在同一条件下室内饲养的稻螟赤眼蜂，饲养条件如下：稻螟赤眼蜂的室内种群在人工气候室：温度25℃，湿度75％，光照：黑暗＝14小时：10小时的条件下，用米蛾卵进行扩繁，利用初羽化的成蜂进行温度胁迫处理。

本发明中，不同温度对稻螟赤眼蜂进行胁迫处理的方法为：分别选取低温胁迫、高温胁迫以及常温条件下处理的稻螟赤眼蜂为实验材料，所述低温胁迫的温度优选为4℃～10℃，更优选为5～7℃；所述高温胁迫的温度优选为30℃～40℃，更优选为35～38℃。本发明中，对稻螟赤眼蜂进行低温或高温胁迫的时间至少为0.5小时，作为优选的，低温或高温胁迫的时间为0.5～4小时，进一步优选为1～2小时。本发明中，常温处理的稻螟赤眼蜂温度为24～26℃，优选为25℃。本发明对温度胁迫的装置没有特殊的限定，在本发明具体实施例中采用光照培养箱和冰箱分别对稻螟赤眼蜂进行高温和低温胁迫处理。本发明对温度胁迫操作方式没有特殊的限定，可以将稻螟赤眼蜂置于容器中进行温度胁迫。优选采用将稻螟赤眼蜂置于玻璃管中，用棉塞封口，置于胁迫温度下进行处理。为了保证筛选试验的准确性，本发明优选每个处理设置至少3个生物学重复。

收集温度胁迫的稻螟赤眼蜂，并提取其总RNA，测RNA浓度，反转录合成cDNA。本发明对此步骤没有特殊限定，采用本领域中的常规步骤进行操作即可。

以各样品的cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR对备选内参基因进行验证。

进行实时荧光定量PCR方法对备选的10个内参基因所对应的引物为：

Polyadenylate binding protein 1(PABPC1)：

正:GCGACAACATCACCAGGAGA，反：GAAGAGATGGATCGCGCTGA；

Splicing factor(SF)：

正：TTATGTTCGGGAGCGTGGAG，反：TCAGGTCTGCTTCTCGATCAC；

Elonggation factor 1(EF1)：

正：GCCATGGTTCAAGGGATGGA，反：ACCGTTCCAATACCGCCAAT；

Casein kinase 1 alpha(CK1a)：

正：GGCAGACCTTTGGAACTCGT，反：ACATGACCTCCACCGTTCAC；

Elonggation factor 1Deta(EF1D)：

正：AACTTACGACAGGGCTGAGC，反：CAAGAGCTGCAATGCCATCC；

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase(GAPDH)：

正：CACCACCATCGAGAAGGCTT，反：TGGGTCGTACGAGTCGAGAT；

Actin related protein 2(ARP2)：

正：TCCGCTGACTTTGAAACCGT，反：GAGCAGCAAACCTTTCACCG；

Transmembrane protein 209(TMEM209)：

正：ACTCACAGCCAGGATCAGTG，反：TGGGGCTTCAAGTTGTGTGT；

Actin related protein 213(ARP213)：

正：GACCATCCGCTCTTAGTGCA，反：CAGTGGAAGGTTCAGCGTCT；

ATP synthase：

正：ACAGACAGCGGTGCCATTAA；反：GAATTCACCCATGGCGCATC。

本发明中，hsp70基因的引物序列为：正：AACGTAGTGAGCGATGGTGG，反：CATTGAAGTAAGCCGGCACG。

优选的，实时荧光定量PCR的体系和条件分别为：实时荧光定量PCR的反应体系：定量PCR反应体系共20μL，包含1μL的cDNA(含有总RNA3μg)，10μL SYBR荧光试剂(iTaqUniversal SYBR Green Supermix)，正/反向引物各1μL，双蒸水7μL；实时荧光定量PCR的反应条件：95℃30S，95℃10S，55℃30S共40个循环。融解曲线：55℃到95℃，每0.5℃收集一次荧光信号。在本发明中，优选每个样本设置2个技术重复。

将实时荧光定量PCR获得的Ct值，利用RefFinder软件进行分析，筛选得到表达量最稳定的内参基因作为定量检测稻螟赤眼蜂体内与温度调节相关的基因表达量的合适内参基因。

RefFinder(http://http://fulxie.0fees.us/？type＝reference&i＝1)是一个免费的网络综合评价内参基因稳定性的工具，可从大量的实验数据集评估和筛选内参基因。它能综合BestKeeper，GeNorm，NormFinder和△Ct四种方法的结果来对候选内参基因作出最终的稳定性排序。其中，△Ct法较为简单，通过比较每一对持家基因在每个样品的相对表达来确定适合的内参基因。BestKeeper通过原始Ct值和引物扩增效率(E)决定出最适内参基因，并依次排序。GeNorm程序可用于筛选任何条件下任意数量内参基因，选择出两个以上内参基因，而不是传统地使用单一内参基因。NormFinder程序运行原理与GeNorm程序类似，可直接运算出各基因的表达稳定值(M)，然后根据M值的大小排序，M值越小，稳定性越高。其缺点是只能选择1个合适的内参基因作标准。RefFinder是整合BestKeeper，GeNorm，NormFinder和△Ct四种方法，对每个候选内参基因单独用4种分析方法评价时的排名求几何平均值，得到综合排名指数，该指数越小，说明内参基因表达越稳定；反之，则越不稳定。

结果得到PABPC1基因在稻螟赤眼蜂不同温度胁迫下表达量最稳定，因此将PABPC1基因作为在定量检测稻螟赤眼蜂体内与温度调节相关的基因表达量的内参基因。

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图对本发明进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。其中内参基因稳定性分析RefFinder软件的使用按其使用说明进行。

实施例1内参基因的筛选

一、稻螟赤眼蜂的饲养。

稻螟赤眼蜂实验室种群，在人工气候室：温度25℃，湿度75％，光照：黑暗＝14小时：10小时的条件下，利用米蛾卵扩繁，初羽化的成蜂进行温度胁迫处理。

二、温度胁迫处理

设置光照培养箱的温度分别为25℃、30℃、35℃、40℃，设置冰箱的温度为4℃和10℃。将稻螟赤眼蜂成蜂放置在玻璃管中，用棉塞封口，分别在上述温度下处理1小时。收集样品提取总RNA；每个处理设置3个生物学重复。

三、实时荧光定量PCR分析所有基因的引物设计及扩增效率。

1.引物设计

选择10种备选内参基因和1种与适应温度调节相关的基因作为目的基因，利用primer3.0软件设计特异性扩增引物(表1)。

2.RNA提取过程

取200头稻螟赤眼蜂放入2.0mL玻璃匀浆器中，加入500μL Trizol试剂，手动匀浆5min，此后步骤参照Trizol试剂(Invitrogen，批号：15596026)说明书完成。RNA质量和浓度检测：取1μLRNA样品，利用NanoDrop2000检测OD260/280和浓度，OD260/280值介于1.8～2.2为合格样品。第一链cDNA的合成：利用3μg RNA进行反转录，步骤参照Thermo Fisher反转录试剂盒(Themo Fisher，批号：K1622)说明书进行。

表1备选内参基因及目的基因的引物序列及扩增效率。

3.反转录合成的cDNA的扩增

以上述反转录合成的cDNA为模板，利用设计合成的特异性引物(表1)PCR扩增备选内参基因和目的基因，采用琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段长度是否与选取的目的片段一致，然后回收PCR产物并测序进行验证。发现利用以上设计的引物可以有效扩增出目的片段，与我们设计的目的片段大小一致，条带单一，无特异性扩增。PCR扩增体系：20μL反应体系包含10μL 2×PCR buffer Mix，正/反向引物各1μL，cDNA模板1μL，灭菌水7μL。

4.引物扩增效率的考察

以上述反转录合成的cDNA按5倍等比稀释成5个不同浓度的cDNA为模板，利用设计合成的特异性引物(表1)进行荧光定量PCR扩增备选内参基因和目的基因。实时荧光定量PCR的反应体系共20μL，包含1μL的cDNA(含有总RNA3μg)，10μL2×iTaq SYBR Green荧光试剂(2×iTaqUniversal SYBR Green Supermix)，正/反向引物各1μL，双蒸水7μL，其中SYBRGreen荧光试剂购于Bio-Rad公司；反应条件：95℃30S，95℃10S，55℃30S共40个循环。融解曲线：55℃到95℃，每0.5℃收集一次荧光信号。引物扩增效率由实时荧光定量PCR仪自带软件给出，以扩增效率E(％)是否在90％～110％之间判断引物是否合适(表1)。荧光定量PCR仪为CFX96，Bio-Rad公司。

5.实时荧光定量PCR

以上述cDNA为模板，对备选内参基因和目的基因进行荧光定量PCR扩增(表1)，反应体系和反应条件参照【4.引物扩增效率的考察】一节。实时荧光定量PCR的反应体系共20μL，包含1μL的cDNA(含有总RNA 3μg)，10μL2×iTaq荧光试剂，正/反向引物各1μL，双蒸水7μL，其中SYBR Green荧光试剂购于Bio-Rad公司；反应条件：95℃30S，95℃10S，55℃30S共40个循环。融解曲线：55℃到95℃，每0.5℃收集一次荧光信号。

将实时荧光定量PCR获得的Ct值，按照分析软件格式要求输入RefFinder软件进行分析。内参基因稳定性分析结果见图1。从图1可以看出，10种不同备选基因的稳定性为：PABPC1>EF1>EF1D>TMEM209>SF>ARP2>ARP213>CK1A>ATP synthase>GAPDH，其中PABPC1最稳定。

传统来讲，实时荧光定量PCR开展时一般采用单一常见的内参基因，事实证明，这种操作方法是不可取的，任何外在条件或者内在条件的改变都会影响内参基因表达的稳定性。此外，利用不同的内参基因分析同一目的基因的表达量变化差异非常显著，有的甚至可以达到几十倍的差异，严重影响实验结果的可靠性。因此，本发明提供的不同温度胁迫下稻螟赤眼蜂内参基因的筛选方法，筛选出表达量最稳定的PABPC1作为在定量检测稻螟赤眼蜂体内与温度调节相关的基因表达量的内参基因。

实施例2PABPC1作为内参基因的应用

1.温度胁迫

以不同温度胁迫1小时的稻螟赤眼蜂为实验样本，25℃的稻螟赤眼蜂试虫为对照样本，PABPC1为内参基因，利用实时荧光定量PCR检测稻螟赤眼蜂hsp70基因的表达水平。温度胁迫方法、反应体系和反应条件参照实施例1中的低温和高温胁迫、实时荧光定量PCR的操作过程、条件和体系。每个处理设置2个技术重复，3个生物学重复。数据处理采用2-△△Ct方法处理，△△Ct＝△Ct处理样本-△Ct对照样本，△Ct＝△Ct目的基因-△Ct内参基因。各处理间差异显著性采用DPS软件进行统计分析。

结果显示：低温处理对稻螟赤眼蜂hsp70基因的表达量无显著影响；高温处理中30℃对其表达量亦无显著影响，但随着温度升高到35℃和40℃，hsp70的表达量显著上调，与对照样本相比，分别上调了2.8倍和5.4倍。

本发明利用实时荧光定量PCR对不同温度胁迫条件下稻螟赤眼蜂体内10种备选内参基因和1种目的基因进行了定量扩增，并采用RefFinder软件分析了内参基因稳定性，筛选出不同温度胁迫条件下稻螟赤眼蜂体内最稳定的内参基因PABPC1。在此基础上，以稻螟赤眼蜂热激蛋白基因hsp70为目的基因，PABPC1为内参基因，明确了在不同温度胁迫条件下稻螟赤眼蜂hsp70基因的表达规律。此发明筛选出的内参基因PABPC1适合不同温度条件胁迫下稻螟赤眼蜂体内目的基因的表达谱分析，为以后温度胁迫条件下稻螟赤眼蜂基因的定量PCR实验提供了参考。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省农业科学院

<120> PABPC1基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂基因表达量中的应用

<130> GW2017I0812

<160> 33

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 361

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gcgacaacat caccaggaga tcgctcggat atgcctacgt gaattttcaa caaccggctg 60

atgccgaaag agctttggat accatgaact ttgacatgat caaaggcaga cctattagaa 120

taatgtggtc tcagcgcgat ccatctcttc gccgctcagg cgttggaaat gttttcatca 180

ggaacttgga caaaaacatt gataacaagg ccatgtatga tactttctca gcttttggca 240

acattcttag ttgcaaagtt gctcaggatg agaaaggttc ctccaaaggg tacggattcg 300

ttcattttga aaccgaagaa gctgccaaca agtccatcga caaggtcaat ggtatgctgc 360

t 361

<210> 2

<211> 285

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgtttcagc tttgttttat atcagtatgt catcttaaac aagttataac cagacgtttt 60

atcgtgccgt tttcgcttat gttcgggagc gtggagttcc agacctggat ctgcgtggtg 120

tgcggcttct tggggatctg gacttgctta acgtccttgg gcgaccatta cggctacgtg 180

aacggctgcg agataaagat cgtgagtagg aacgcctggc tccagtggct ccacgggccc 240

gtgaacgaga tcgtgagcgt gatcgtgatc gagaagcaga cctga 285

<210> 3

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atgggaaagg aaaagatcca tattaacatc gtcgtcattg gacacgtaga ttcaggagcc 60

atggttcaag ggatggaacg ttgagcgcaa agaaggcaaa gctgacggca aatgcctcat 120

cgaagccctc gatgccatcc tcccaccatc caggccaacc gacaaagccc tccgtctccc 180

actccaggac gtctacaaaa ttggcggtat tggaacggta ccagtcggtc gtgtcgaaac 240

tggtgtgttg aaaccaggta tggttgtcac cttcgcccca gctggtttga ccac 294

<210> 4

<211> 453

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

atgcagcaaa aaaagcagaa gaagcctcag atccaatccg tccaggtgtt cggacgtaaa 60

aaaaccgcca cggctgttgc ctactgcaag agaggatccg gtctccttaa ggtcaatggc 120

agacctttgg aactcgtcga gcccaagatg ctccaataca aactccagga accaatcctg 180

cttcttggca aggacaagtt caaggatgtt gatattcgtg tcagagtgaa cggtggaggt 240

catgttgcac agatctatgc catcaggcaa gcaattgcca aggctgtagt tgccttctat 300

cagaaatttg ttgatgaggc aagcaagaag gaaatcaaag atatccttat tcagtacgat 360

aggactctct tggttgctga tcctagaagg tgcgaaccta agaagtttgg tggtccgggt 420

gctcgtgccc gttaccaaaa atcttaccgt taa 453

<210> 5

<211> 257

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atggccgcgg tttcgatgca agaaaaggtt tggtccgaaa aatcaactta cgacagggct 60

gagcgcctgc accacgaaag acttgccaag gaattagata tcacaatgtc tggaagttta 120

gctgctgaag ttgccaaggc acgccaacac atcaagctgt ccttgcaagt tatggatggc 180

attgcagctc ttgctggttt gtctgttgaa aaagaagtcc cagacaaaga agtttctggc 240

agactagttt cattgga 257

<210> 6

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accatcgaga aggcttcggc tcatttggaa ggtggtgcca agaaggtcat catctccgct 60

ccatcggccg acgcacccat gtacgtgtgc ggtgtgaatc tcgactcgta cgacccaagc 120

cacaaagtcg tgtccaacgc ctcgtgcacg accaactgct tggctcccct cgccaaggtc 180

atccacgaca acttcgagat cgtc 204

<210> 7

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cattccgctg actttgaaac cgtaagaatg atcaaagaaa agctgtgtta tattggttat 60

gatattgaga ccgaagaaaa actagcactc gagactacag ttctagtaga atcctataca 120

ttacctgatg gtagagttat caaagttggc ggtgaaaggt ttgctgctcc tgaagcactt 180

tttcaaccac accttatcaa tgtggaggct cagggtatcg cagaacttgt tttcaataca 240

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ggtagtacta tgtat 315

<210> 8

<211> 298

<212> DNA

<213> 人工序列

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ttcggcttca cttatcccta ctctgcctac attggttcca tttttagaat tatgcagcaa 120

tcaagattat ttagttaatc gcataaaaac tcttgcaaaa ggtggatcaa tgagtgaatt 180

taaatggaac tcaggtggat ctcataatgg caaagagtgg gatactagtc ttccaacaga 240

tactgctatt gtaatgcatc tagttgcaac atacatggac acacaacttg aagcccca 298

<210> 9

<211> 261

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gaccatccgc tcttagtgca gttgccaata gttctacttc tccgccaaaa agcagtgctg 60

aaacaactaa aataagcaat ccttttgcaa aagttgacaa aaagtcagac gatgaaccag 120

aagataaagc tcaaaaggtg tccaatgaag acaataaaac aggtgaatca gaaaaaccca 180

gtgcagaaga aaaaaacaca gagcagccaa aatttttgcc tttgaataat acgtcaagca 240

aagacgctga accttccact g 261

<210> 10

<211> 278

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

acagacagcg gtgccattaa ctacaccatc attgtgtcgg ctaccgcctc tgatgccgcc 60

cctctgcagt accttgcccc atactctgga tgcgccatgg gtgaattctt cagagataac 120

ggcaaacacg ccctcatcat ctacgacgat ttgtcgaaac aggccgtagc ctaccgtcaa 180

atgtccctgt tgctgcgaag acccccaggt cgtgaggcct accccggtga tgtcttctac 240

ctccactctc gtctccttga gcgtgccgcc aagatgaa 278

<210> 11

<211> 196

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

atgaaacatt ggcccttcaa cgtagtgagc gatggtggca aaccaaagat ccaagtgtcc 60

tacaaaggcg agaacaagac gttcttcccg gaggaagtgt cgtccatggt tcttatcaaa 120

atgaaggaga tagcagaggc ctacctaggc aaaaagataa ccgacgccgt catcaccgtg 180

ccggcttact tcaatg 196

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

gcgacaacat caccaggaga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gaagagatgg atcgcgctga 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

ttatgttcgg gagcgtggag 20

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

tcaggtctgc ttctcgatca c 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gccatggttc aagggatgga 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

accgttccaa taccgccaat 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggcagacctt tggaactcgt 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

acatgacctc caccgttcac 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

aacttacgac agggctgagc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

caagagctgc aatgccatcc 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

caccaccatc gagaaggctt 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

tgggtcgtac gagtcgagat 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

tccgctgact ttgaaaccgt 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 25

gagcagcaaa cctttcaccg 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 26

actcacagcc aggatcagtg 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 27

tggggcttca agttgtgtgt 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 28

gaccatccgc tcttagtgca 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 29

cagtggaagg ttcagcgtct 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 30

acagacagcg gtgccattaa 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 31

gaattcaccc atggcgcatc 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 32

aacgtagtga gcgatggtgg 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 33

cattgaagta agccggcacg 20

Claims (10)

1.PABPC1基因作为内参基因在定量检测稻螟赤眼蜂体内与温度调节相关基因的表达量的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述定量检测的方法为实时荧光定量PCR。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PABPC1基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

4.根据权利要求1或3所述的应用，其特征在于，扩增所述PABPC1基因的引物序列如SEQIDNO:12和SEQ ID NO:13所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述与温度调节相关基因为热激蛋白基因。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述热激蛋白基因为hsp70，所述hsp70的基因序列如SEQ ID NO:11所示。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，扩增所述hsp70基因的引物序列如SEQIDNO:32和SEQ ID NO:33所示。

8.一种定量检测热激蛋白hsp70基因在稻螟赤眼蜂被温度胁迫后的表达量的方法，该方法包括：以PABPC1基因为内参基因，检测hsp70基因在稻螟赤眼蜂被温度胁迫后的定量表达量，其中所述定量检测表达量的方法为实时荧光定量PCR。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述温度胁迫包括高温胁迫和低温胁迫，所述高温胁迫的温度为30℃～40℃，所述低温胁迫的温度为4℃～10℃。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述温度胁迫的时间为0.5～4小时。