CN110527735B - 一种红苹果基因紧密连锁分子标记与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红苹果基因紧密连锁分子标记与应用。本发明提供的特异引物对由序列表的序列1和序列2所示的两条单链DNA分子组成。本发明提供的分子标记能够在不同群体中完全应用，经过不同亲本验证筛选准确率高达99％以上，而且标记只需要普通的PCR仪、普通的酶制剂和凝胶电泳即可，PCR特异性高，扩增效率高，普通的员工稍加培训便可以进行实验操作和分析，一般的实验室均可以实现。此外，标记也可采用最新的带芯片全自动电泳仪检测，会更加高效。本发明对于苹果选育有重要意义。

Description

一种红苹果基因紧密连锁分子标记与应用

技术领域

本发明涉及生物技术中的DNA分子标记技术，具体涉及一种红苹果基因紧密连锁分子标记与应用。

背景技术

众所周知，苹果因其童期长、自交不亲和、杂交后代分离疯狂，导致育种周期漫长，选育一个优异的新品种，至少也得15年，更加耗资的是苹果树体占地面积大，例如杂交3000株实生苗，按2×1米定植，一亩地仅定植330多棵，约需要10亩土地，需要15年，因此苹果育种是一项十分艰巨的任务。

分子标记辅助育种作为现代育种手段之一，已在其他作物被越来越广泛的应用。事实上，开发能够进行预先选择的分子标记对多年生苹果育种更加重要，不仅能准确预选含目标性状植株，而且能够节省空间土地和劳动力。特别对我们农用土地有限的国家，其意义不言而喻。

目前，新西兰和日本科、中国科学家2006年，2007年，2015年分别开发了苹果红色的SCAR标记和SSR标记，但这些标记不仅程序使用麻烦(SCAR标记需要进行繁琐的酶切，SSR标记需要银染等繁琐的实验程序。)而且这些标记最令人头疼的是只能在特定的群体中做筛选使用，变换群体仍然需要开发新的标记，例如，SCAR和SSR标记标记可在金冠和富士杂交群体中做预先选择使用，但不能在澳洲青萍和富士杂交群体中使用，因而这些标记使用受到了极大的限制，新西兰2016年最新开发出的分子标记，解决了群体问题，但实验需要设计探针，也需要一些昂贵的仪器，而且使用成本也高，可以说这些标记都是处于实验室研究阶段。因此，开发出简单、准确、高效、傻瓜式分子标记意义非常重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种红苹果基因紧密连锁分子标记与应用，能够准确预测后代果实红皮和非红色，可进行任何杂交群体预先选择育种。

本发明提供特异引物对；所述特异引物对由引物RedTEF和引物RedTER组成；

所述引物RedTEF为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链DNA分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代且与序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物RedTER为如下(a3)或(a4)：

(a3)序列表的序列2所示的单链DNA分子；

(a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代且与序列2具有相同功能的DNA分子。

所述特异引物对的用途为如下(b1)-(b6)中的至少一种：

(b1)预测苹果果皮颜色；

(b2)筛选果皮颜色为红色的苹果品种；

(b3)筛选果皮颜色非红色的苹果品种；

(b4)制备用于预测苹果果皮颜色的试剂盒；

(b5)制备用于筛选果皮颜色为红色的苹果品种的试剂盒；

(b6)制备用于筛选筛选果皮颜色非红色的苹果品种的试剂盒。

本发明还保护所述特异引物对的应用，为如下(b1)-(b6)中的至少一种：

(b1)预测苹果果皮颜色；

(b2)筛选果皮颜色为红色的苹果品种；

(b3)筛选果皮颜色非红色的苹果品种；

(b4)制备用于预测苹果果皮颜色的试剂盒；

(b5)制备用于筛选果皮颜色为红色的苹果品种的试剂盒；

(b6)制备用于筛选筛选果皮颜色非红色的苹果品种的试剂盒。

本发明还保护含有所述特异引物对的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下(c1)-(c3)中的至少一种：

(c1)预测苹果果皮颜色；

(c2)筛选果皮颜色为红色的苹果品种；

(c3)筛选果皮颜色非红色的苹果品种。

本发明还保护所述试剂盒的制备方法，包括将所述特异引物对中的各条引物进行独立包装的步骤。

本发明还保护预测苹果果皮颜色的方法(方法甲)，包括如下步骤：以待测苹果的基因组DNA为模板，采用所述特异引物对进行PCR扩增，如果扩增产物中具有740-760bp的DNA片段、待测苹果果皮颜色为红色，如果扩增产物中不具有740-760bp的DNA片段、待测苹果果皮颜色为非红色。

所述740-760bp的DNA片段具体为750bp的DNA片段。

本发明还保护预测苹果果皮颜色的方法(方法乙)，包括如下步骤：检测待测苹果基因组DNA中是否含有特异DNA片段，如果所述基因组DNA中含有特异DNA片段、待测苹果果皮颜色为红色，如果所述基因组DNA中不含有特异DNA片段、待测苹果果皮颜色为非红色；

所述特异DNA片段为序列表的序列3所示的DNA分子。

本发明还保护一种筛选果皮颜色为红色的苹果品种的方法(方法丙)，包括如下步骤：

(d1)按照方法甲或方法乙预测苹果果皮颜色；

(d2)基于步骤(d1)的结果筛选果皮颜色为红色的苹果品种。

本发明还保护一种筛选果皮颜色非红色的苹果品种的方法(方法丁)，包括如下步骤：

(e1)按照方法甲或方法乙预测苹果果皮颜色；

(e2)基于步骤(e1)的结果筛选果皮颜色非红色的苹果品种。

本发明还保护所述特异引物对，或，以上任一所述的方法在苹果育种中的应用。

本发明还保护苹果育种方法，为方法A或方法B。

所述方法A包括如下步骤：将方法丙筛选得到的果皮颜色为红色的苹果品种作为育种材料。

所述方法B包括如下步骤：将方法丁筛选得到的果皮颜色非红色的苹果品种作为育种材料。

以上任一所述苹果具体可为表1中所示的苹果品种。

本发明提供的分子标记能够在不同群体中完全应用，经过不同亲本验证筛选准确率高达99％以上，而且标记只需要普通的PCR仪、普通的酶制剂和凝胶电泳即可，PCR特异性高，扩增效率高，普通的员工稍加培训便可以进行实验操作和分析，一般的实验室均可以实现。此外，标记也可采用最新的带芯片全自动电泳仪检测，会更加高效。本发明对于苹果选育有重要意义。

附图说明

图1为实施例3中表1中苹果的电泳检测结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、分子标记的开发及引物设计

进行大量序列分析、比对以及预实验，发现了一对用于预测苹果果皮颜色的特异引物，可用于苹果实生苗的预先选择，引物信息如下所示：

RedTEF(序列表的序列1)：5’-GGTCACCCAACCCACACTGGGCCTTG-3’；

RedTER(序列表的序列2)：5’-CGGCCGCAATCGCAAGACGCAGA-3’。

上述引物的靶序列如序列表的序列3所示。

实施例2、苹果果皮颜色的检测方法

1、提取待测苹果幼叶的基因组DNA。

2、以步骤1得到的基因组DNA为模板，采用实施例1中的特异引物对进行PCR扩增。

PCR扩增反应体系：Premix taq酶10μl，引物RedTEF 1μl，引物RedTER 1μl,模板DNA 2μl，超纯水6μl。

引物RedTEF和引物RedTER在反应体系中的浓度为0.2μM。

模板DNA在反应体系中的浓度为5-10ng/μl。

PCR扩增反应程序：95℃预变性3分钟；98℃变性10秒，62℃退火15秒，72℃延伸20秒，30个循环；72℃延伸5分钟。

3、将步骤2得到的PCR扩增产物进行1.2％的琼脂糖凝胶电泳15min。

根据电泳结果进行如下判断：

如果得到740-760bp的目的条带，则待测苹果为红色果皮；

如果没有得到740-760bp的目的条带，则待测苹果为非红色果皮。

实施例3、苹果实际检测

从国家果树种质(兴城)苹果圃选取48份资源(涵盖了生产主要杂交核心亲本)，采用实施例2中的方法进行检测。

表1所用苹果品种资源

表1中，字体加粗且编号有*标记的品种果皮颜色为非红色(共9个)，其余为红色(共39个)。

电泳结果如图1所示。表1中，泳道M为Takara DL2,000DNA Marker，泳道1-48依次对应表1中编号1-48的苹果品种。电泳检测检测结果与实际果皮颜色完全一致。将39个红色果皮苹果电泳得到的特异条带回收并测序，测序结果与序列3完全一致。

上述结果表明，本发明开发的特异引物可以用于苹果果皮颜色的预测。

序列表

<110> 中国农业科学院果树研究所

<120> 一种红苹果基因紧密连锁分子标记与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggtcacccaa cccacactgg gccttg 26

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cggccgcaat cgcaagacgc aga 23

<210> 3

<211> 750

<212> DNA

<213> 苹果(Malus pumila)

<400> 3

ggtcacccaa cccacactgg gccttggccg gccctatgtc taaaatatcc gctagctaaa 60

taaaaattag acgtcactaa accaactgat tccttattta aattggtttt gttattggaa 120

caggtagcaa gaagttgcct acatcttcat atgaggtgaa atcaaaggcc atgctatgac 180

taaaatgata agctaagatt agtaaattac aaagtgagaa ttctactgat cgatccagca 240

aatcgtggtc ccaaaatttg aaacgggagc ttaagaattt ttactctgaa ttaaatgaaa 300

aagtacaaat atagtgtaag gatgctcatt actaaacagt gcatggttcc actttttgga 360

caatggttat ctgtcatatt attcaatttt cttctacata aatatttatt gtacgataaa 420

taaataaaat tgtaggatac atgcactatt gatgcgcctt cacatataag acacactgtc 480

ggatatcaca ctcccttctc tttctagtcc tactcatcgt actttcagca ggcaatgtta 540

agaatttttc tttcaggatt tttatatatg tgttgaccct agaaactaca aagcctacgt 600

ggcgcgcagg ccgaataatt aataagctaa ctacgtcctt cggtgattgc ggggcgtgcc 660

aactcgtcgg ccgaggctcg gccgaggagt aaatttgatg atgctgcgtt gggtcgcgct 720

actgacttct gcgtcttgcg attgcggccg 750

Claims (9)

1.一种用于预测苹果果皮颜色的特异引物对；所述特异引物对由引物RedTEF和引物RedTER组成；

所述引物RedTEF为序列表的序列1所示的单链DNA分子；

所述引物RedTER为序列表的序列2所示的单链DNA分子。

2.权利要求1所述特异引物对的应用，所述应用为如下(b1)-(b6)中的至少一种：

(b1)在预测苹果果皮颜色是否为红色中的应用；

(b2)在筛选果皮颜色为红色的苹果品种中的应用；

(b3)在筛选果皮颜色为非红色的苹果品种中的应用；

(b4)在制备用于预测苹果果皮颜色是否为红色的试剂盒中的应用；

(b5)在制备用于筛选果皮颜色为红色的苹果品种的试剂盒中的应用；

(b6)在制备用于筛选果皮颜色为非红色的苹果品种的试剂盒中的应用。

3.含有权利要求1所述特异引物对的试剂盒；所述试剂盒的应用为如下(c1)-(c3)中的至少一种：

(c1)预测苹果果皮颜色是否为红色；

(c2)筛选果皮颜色为红色的苹果品种；

(c3)筛选果皮颜色为非红色的苹果品种。

4.权利要求3所述试剂盒的制备方法，包括将权利要求1所述的特异引物对中的各条引物进行独立包装的步骤。

5.预测苹果果皮颜色是否为红色的方法，包括如下步骤：以待测苹果的基因组DNA为模板，采用权利要求1中所述的特异引物对进行PCR扩增，如果扩增产物中具有740-760bp大小的特异扩增DNA片段，待测苹果果皮颜色为红色；如果扩增产物中不具有740-760bp大小的特异扩增DNA片段，待测苹果果皮颜色为非红色。

6.预测苹果果皮颜色的方法，包括如下步骤：检测待测苹果基因组DNA中是否含有特异DNA片段，如果所述基因组DNA中含有所述特异DNA片段，待测苹果果皮颜色为红色；如果所述基因组DNA中不含有所述特异DNA片段，待测苹果果皮颜色为非红色；

所述特异DNA片段为序列表的序列3所示的DNA片段。

7.一种筛选果皮颜色为红色的苹果品种的方法，包括如下步骤：

(1)按照权利要求6所述方法预测苹果果皮颜色是否为红色；

(2)基于步骤(1)的结果筛选果皮颜色为红色的苹果品种。

8.一种筛选果皮颜色为非红色的苹果品种的方法，包括如下步骤：

(1)按照权利要求6所述方法预测苹果果皮颜色是否为红色；

(2)基于步骤(1)的结果筛选果皮颜色为非红色的苹果品种。

9.苹果育种方法，为方法A或方法B；

所述方法A包括如下步骤：按照权利要求7所述的方法筛选得到果皮颜色为红色的苹果品种，然后将其作为育种材料；

所述方法B包括如下步骤：按照权利要求8所述的方法筛选得到果皮颜色为非红色的苹果品种，然后将其作为育种材料。

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