CN110885890B - 快速鉴别瓜实蝇和南亚果实蝇的hrm引物、试剂盒及方法 - Google Patents
快速鉴别瓜实蝇和南亚果实蝇的hrm引物、试剂盒及方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了快速鉴别瓜实蝇和南亚果实蝇的HRM引物、试剂盒及方法。本发明首先基于瓜实蝇和南亚果实蝇线粒体基因组设计合成用于区分两种实蝇的HRM特异性引物，分别提取瓜实蝇和南亚果实蝇基因组DNA，然后以提取的DNA为模板，EvGreen为染料进行高分辨率实时荧光定量PCR分析，根据熔解温度曲线峰值差异区分两种实蝇种类。本发明解决了两种共寄主发生且幼虫相似的瓜实蝇和南亚果实蝇快速鉴定的问题，建立了基于线粒体基因鉴别两种实蝇的HRM方法。本发明可快速、高效、简捷区分在瓜类蔬菜上混合发生的瓜实蝇和南亚果实蝇，准确性高，能实现高通量，重复性好且成本低廉。
Description
技术领域
本发明属于昆虫分子生物学技术领域，具体涉及快速鉴别瓜实蝇和南亚果实蝇的HRM引物、试剂盒及方法。
背景技术
瓜实蝇(Bactrocera cucurbitae)和南亚果实蝇(Bactrocera tau)均属双翅目(Diptera)实蝇科(Tephritidae)果实蝇属(Bactrocera)，是我国西南、华南地区瓜果蔬菜生产上的重要害虫和检疫性生物。成虫均在寄主果实中产卵，孵化后的幼虫在果实内取食寄主组织，造成腐烂、落果，影响果蔬产量和品质，引起巨大的经济损失。对上述两种实蝇为害进行防控，对于提高果蔬的产量和质量，保障农业经济收入具有重要意义。
害虫发生预测预报，是害虫综合防控体系中的重要组成环节。准确的害虫测报，可以增强防治虫害的预见性和计划性，提高防治工作的经济效益、生态效益和社会效益，使之更加经济、安全、有效。同时，对不同国家、区域的农产品进行检疫，把本地区外的害虫拒之门外也是一种有效的害虫防控手段。而害虫测报和检疫最基础的工作是要做到“知虫识虫”。
目前，实际应用中，识别瓜实蝇和南亚果实蝇的主要手段是采集到幼虫后，饲养至成虫，然后根据成虫的形态特征进行鉴定，此种方法受限于虫态，对害虫诊断测报和检疫质量及通关速度往往造成较大的影响。近年来，随着分子生物学技术的发展，以分子技术为基础的害虫种类鉴定方法飞速发展，突破了虫态限制因素，在实蝇类害虫中也得到了广泛应用，如DNA条形码的鉴定技术、基因组特异性SSR序列PCR鉴定方法、种特异性PCR技术、限制性片段长度多态性技术、基因芯片技术等。分子技术为害虫种类监测预报和检验检疫提供了更加高效快捷的鉴定手段。然而，所有的技术手段都有本身的优缺点，如DNA条形码技术需要DNA提取、PCR、凝胶电泳、DNA测序、数据比对分析5个步骤，相对周期3-5天；基因芯片技术需要制备大量探针且设备高昂；其它技术手段仅需DNA提取、PCR和凝胶电泳分析，但引物设计和条件摸索相对较难。因此，更加简便、快速、高效的鉴别方法成为迫切需求。
高分辨率熔解曲线(high-resolution melting，HRM)是一种基于单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线的基因突变扫描和基因分型的遗传学分型方法，其基本原理是双链核苷酸(double strand DNA，dsDNA)的热稳定性受其长度和碱基组成的影响，序列变化会导致升温过程中dsDNA解链行为的改变，所用的饱和荧光染料只能嵌入并结合到dsDNA上，因此利用实时荧光PCR技术，通过实时检测dsDNA熔解过程中荧光信号值的变化，就能以生成不同形状熔解曲线的方式将PCR产物中存在的差异直观地展示出来。同时，借助于专业性的分析软件就可以对测试群体实现基于不同形状熔解曲线的基因分型或归类。其敏感性极高、无需使用序列特异性探针就可以检测出单个碱基的差异、分析速度快、灵敏度和特异性高、高通量、低成本、结果准确、不受检测位点的局限、PCR产物无需后处理(如酶切、电泳等)，可实现真正的闭管操作从而降低污染风险，已发展成为SNP基因分型、点突变筛查、物种鉴别等的重要手段。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中没有能快速鉴定两种共寄主发生且幼虫相似的瓜实蝇和南亚果实蝇的方法的问题，提供快速鉴别瓜实蝇和南亚果实蝇的HRM引物、试剂盒及方法。
本发明根据瓜实蝇和南亚果实蝇线粒体基因组保守同源序列，设计一对引物，该引物对能同时对瓜实蝇和南亚果实蝇一段80bp长度的线粒体基因同源片段(图1)进行特异性扩增。扩增的两个物种特异性片段相似性为97.5％，即80bp长度片段中有两个位点碱基存在差异(均为C-T)，根据碱基差异造成的溶解曲线Tm值存在不同，从而实现利用HRM鉴别两个物种。
一对快速鉴别瓜实蝇和南亚果实蝇的HRM引物，包括引物F：CCTGGTCCTTTCGTACTAAGGTATT(SEQ ID No.1)和引物R：TGATCTGAGTTCAGACCGGC(SEQ IDNo.2)。
一种快速鉴别瓜实蝇和南亚果实蝇的试剂盒，该试剂盒含有所述的引物。
一种快速鉴别瓜实蝇和南亚果实蝇的方法，包括以下步骤：
以引物F：CCTGGTCCTTTCGTACTAAGGTATT(SEQ ID No.1)和引物R：TGATCTGAGTTCAGACCGGC(SEQ ID No.2)作为引物，以提取待测样品的单头虫子DNA作为模板，添加荧光饱和染料，进行RT-PCR扩增反应，并设置瓜实蝇、南亚果实蝇阳性对照；对扩增产物进行HRM分析，确定待测样品类型。
所述的RT-PCR扩增反应体系为：
引物F和R各0.2μM，2X EvGreen染料1μl，5U/μl Ex Taq HS DNA聚合酶0.1μl，20mMMg2+plus的10X Ex Taq Buffer 2μl，各2.5mM的dNTP Mixture 1.6μl，模板D NA 100ng，无菌水补足至20μl。
所述的RT-PCR扩增反应程序为：
95℃预变性30s；95℃10s、62℃30s，40个循环。
所述的HRM分析中，是70℃-95℃、以0.1℃/步的升温速率、每0.05s收集一次荧光进行溶解曲线分析。
所述的确定待测样品类型的分析过程为：若待测样品与瓜实蝇阳性对照溶解曲线聚类拟合，则该样品为瓜实蝇；若待测样品与南亚果实蝇阳性对照溶解曲线聚类拟合，则该样品为南亚果实蝇。
本发明所述引物条件为：设计的HRM引物能同时特异性扩增瓜实蝇和南亚实蝇线粒体同源保守片段，扩增的两个物种基因片段碱基具有差异，即通过实时荧光定量PCR生成的熔解曲线获得不同的特异性峰值(Tm)，实时荧光定量PCR结束后，利用高分辨率溶解曲线分析软件分析结果来对瓜实蝇和南亚实蝇进行区别。
本发明根据瓜实蝇和南亚果实蝇线粒体基因组高度保守同源但又有个别碱基差异的特征，设计一对PCR扩增引物，利用实时荧光定量PCR扩增后两个物种间Tm值溶解曲线差异(HRM)来进行种类鉴别。本发明可快速准确鉴别两个共寄主的农业害虫，可为害虫防治和检验检疫提供技术支撑。
本发明设计的一对引物，其特异性强、灵敏度高，利用该对引物能够实现快速、高效、简捷区分在瓜类蔬菜上混合发生的瓜实蝇和南亚果实蝇，准确性高，能实现高通量，重复性好且成本低廉。
附图说明
图1是瓜实蝇和南亚实蝇扩增序列；
图2是HRM引物特异性常规PCR扩增凝胶电泳图；
图3是HRM引物扩增瓜实蝇和南亚果实蝇荧光定量PCR溶解曲线峰图；
图4是HRM引物实时荧光定量PCR扩增标准曲线图；
图5是HRM引物灵敏性定量PCR检测图；
图6是瓜实蝇和南亚果实蝇高分辨率溶解曲线图。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、引物设计与合成：根据NCBI数据库中瓜实蝇和南亚果实蝇线粒体序列，利用在线程序Primer-BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)设计HRM上下游引物F和R，其中引物F和R序列为：
引物F:5’-CCTGGTCCTTTCGTACTAAGGTATT-3’(SEQ ID No.1)；
引物R:5’-TGATCTGAGTTCAGACCGGC-3’(SEQ ID No.2)。
2、瓜实蝇和南亚果实蝇样本DNA的提取：采用市售基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司，产品型号：DP304)分别提取瓜实蝇和南亚果实蝇单头个体基因组DNA，微量紫外分光光度计NanoDrop-1000C Thermo，USA)检测提取的DNA质量和浓度。
3、HRM引物特异性PCR凝胶电泳检测：分别以上述步骤2中提取的瓜实蝇、南亚果实蝇DNA为模板，以设计的引物F和R为引物，进行常规PCR扩增，扩增产物进行凝胶电泳分析，常规PCR凝胶电泳图如图2所示。图2表明设计的引物扩增瓜实蝇和南亚果实蝇均为单一的条带，保证了本实施例引物F和R的特异性。PCR扩增体系为25μl，包括：引物F和R各0.4μM，模板DNA100 ng，rTaq(TAKARA公司)0.623U，10×PCR Buffer 2.5μl，dNTPs(各2.5mM)2μl，灭菌水补足至25μl。PCR反应程序为：95℃预变性3分钟，接下来35个循环：95℃15秒、55℃15秒、72℃30秒，72℃5分钟，反应结束后取5μl产物进行凝胶电泳检测。
4、HRM引物特异性定量PCR检测：分别以上述步骤2中提取的瓜实蝇、南亚果实蝇DNA为模板，设计的引物F和R为引物，进行荧光定量PCR扩增，绘制溶解曲线，以溶解曲线是否为单峰判断引物的特异性(图3)。同时，以10倍梯度稀释DNA模板，建立引物扩增标准曲线(图4)，以扩增效率是否介于90％-110％之间为标准判断引物是否适用。图3表明本实施例引物溶解曲线为单一峰带，图4表明本实施例引物扩增效率为97.5％，保证了本实施例引物F和R的特异性和高的扩增效率。荧光定量PCR扩增体系为20μl，包括引物F和R各0.2μM，模板DNA100 ng，TB Premix Ex TaqTM(TAKARA公司)10μl，灭菌水补足至20μl。定量PCR反应程序为：95℃预变性30秒，接下来40个循环：95℃10秒、62℃30秒，循环结束后进行溶解曲线程序。
5、HRM引物灵敏性定量PCR检测：分别以上述步骤2中提取的瓜实蝇、南亚果实蝇DNA为模板，并以10-1倍梯度系列稀释DNA模板，设计的引物F和R为引物，进行荧光定量PCR扩增，分析扩增曲线和溶解曲线(图5)，判断本实施例引物的灵敏度。图5表明单头样本提取的DNA稀释10-3倍后仍然具有很好的扩增结果，表明了本实施例引物和方法具有很高的灵敏性。定量PCR扩增体系和步骤同步骤4。
6、高分辨率溶解曲线定量PCR分析(HRM-PCR)：20μl的反应体系包含引物F和R各0.2μM，2X EvGreen染料1μl，5U/μl Ex Taq HS DNA聚合酶(TaKaRa:RR006Q)0.1μl，10X ExTaq Buffer(20mM Mg2+plus)2μl，dNTP Mixture(各2.5mM)1.6μl，模板DNA 100ng，无菌水补足至20μl。在具有高分辨率溶解曲线分析功能的实时荧光定量PCR仪上进行扩增，HRM-PCR反应程序为：95℃预变性30s；95℃10s、62℃30s，40个循环；循环结束后进行溶解曲线程序：70℃-95℃、以0.1℃/步的升温速率、每0.05s收集一次荧光。每次进行HRM分析时分别设置瓜实蝇和南亚果实蝇阳性对照和阴性对照，所有的样品及对照均设3个重复反应孔。
7、瓜实蝇和南亚果实蝇高分辨率溶解曲线结果分析：HRM-PCR反应结束后，采用高分辨率溶解曲线分析软件对结果进行分析，根据聚合曲线的不同区别种类(待区别的样品分别与各自阳性对照溶解曲线聚类拟合)。
实际应用：应用本实施例引物和方法对11个瓜实蝇和11个南亚果实蝇单独个体鉴定，对本方法进行验证，结果见图6，从图中可以看出本实施例引物及方法能准确区分出瓜实蝇和南亚果实蝇样本，准确性100％。
序列表
<110> 广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所
<120> 快速鉴别瓜实蝇和南亚果实蝇的HRM引物、试剂盒及方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
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<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
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Claims (1)
1.一种快速鉴别瓜实蝇和南亚果实蝇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
以引物F：CCTGGTCCTTTCGTACTAAGGTATT和引物R：TGATCTGAGTTCAGACCG GC作为引物，以提取的待测样品的单头虫子DNA作为模板，添加荧光饱和染料，进行RT-PCR扩增反应，并设置瓜实蝇、南亚果实蝇阳性对照；对扩增产物进行HRM分析，确定待测样品类型；所述的RT-PCR扩增反应，其反应体系为：引物F和R各0.2μM，2X EvGree n染料1μl，5U/μl的Ex TaqHSDNA聚合酶0.1μl，20mM Mg2+plus的10X Ex Taq Buffer 2μl，2.5mM的dNTP Mixture 1.6μl，模板DNA100ng，无菌水补足至20μl；反应程序为：95℃预变性30s；95℃10s、62℃30s，40个循环；所述的HRM分析，是70℃-95℃、以0.1℃/步的升温速率、每0.05s收集一次荧光进行溶解曲线分析；所述的确定待测样品类型的分析过程为：若待测样品与瓜实蝇阳性对照溶解曲线聚类拟合，则该样品为瓜实蝇；若待测样品与南亚果实蝇阳性对照溶解曲线聚类拟合，则该样品为南亚果实蝇。
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| 姜建军等.基于高分辨率荧光曲线技术鉴别瓜实蝇和南亚果实蝇.《植物保护学报》.2022,第49卷(第2期),第707-708页. * |
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