CN108410999B - 以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊atp6基因鉴别试剂盒及其鉴别方法 - Google Patents
以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊atp6基因鉴别试剂盒及其鉴别方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108410999B CN108410999B CN201810270823.4A CN201810270823A CN108410999B CN 108410999 B CN108410999 B CN 108410999B CN 201810270823 A CN201810270823 A CN 201810270823A CN 108410999 B CN108410999 B CN 108410999B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- aedes
- atp6
- melting curve
- resolution melting
- aedes aegypti
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种物种鉴定领域，是一种以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊鉴别试剂盒，其特点是根据白纹伊蚊和埃及伊蚊ATP6基因序列设计通用引物，利用优化的高分辨率熔解曲线反应体系鉴别白纹伊蚊和埃及伊蚊各种形态如成虫、卵、幼虫和蛹等。能对白纹伊蚊和埃及伊蚊进行鉴别，操作简单、速度快、PCR产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异、真正实现闭管操作。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊鉴别试剂盒。
背景技术
口岸蚊类种群鉴定主要手段为形态学鉴定，依靠有形态学鉴定经验和蚊类形态鉴定能力的口岸检验检疫人员，根据医学蚊类分类检索表进行鉴定。然而，形态学鉴定面临很多问题：蚊类专业鉴定人才少，人员培养周期长；鉴定人员的经验程度、专业水平、蚊类完整性与发育阶段等因素可导致鉴定周期长，效率低；一些复杂的种群如近缘种群和同形种群难以鉴定；对于蚊类卵、幼虫和蛹，为获取其可靠鉴定特征，经常需要蚊类人工培养后鉴定；口岸送检蚊类若数量较大，对口岸蚊类鉴定工作是非常大的考验；等等。因而，口岸蚊类鉴定除了提高检疫人员鉴定能力和研发鉴定辅助系统外，仍需要发展安全、快速、准确、灵敏的鉴定方法，以实现蚊类快速鉴定。
近年来，随着分子生物学技术的发展，常规PCR、限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）、随机扩增多态性DNA（RAPD）、单链构象多态性（SSCP）、DNA条形码技术等分子手段已经应用于蚊类种群鉴定。然而，这些鉴定方法均有不足之处：常规检测特异PCR产物序列，依赖于较贵的分子探针或产物测序；RFLP鉴定蚊种不仅耗时，而且需要大量样本；RAPD鉴定蚊种快速，但结果不稳定，且有时不可重复；SSCP只能作为检测蚊类基因突变的方法，要确定突变的位置和类型，需进一步测序，且电泳条件要求比较严格；DNA条形码技术的后续测序工作耗时、耗经费。鉴于上述方法的不足，为了安全、快速、准确、灵敏的实现蚊类种群的分子鉴定，需要探寻新的分子鉴定手段。
发明内容
针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊鉴别试剂盒可作为白纹伊蚊和埃及伊蚊新的鉴别手段，它以单核苷酸熔解温度不同而形成不同形态熔解曲线为基础进行蚊类鉴定，操作简单、速度快、低成本、高通量、结果准确、不受检测位点的局限、PCR 产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异等优势，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的分析。并提供其操作方法。
本发明是由以下技术方案来实现的：
本发明设计了一组以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊鉴别引物，其特征是，序列如下：
ATP6-F：5’-AGTACTAGTCATTTAAC-3’。
ATP6-R：5’-GTTGATATAGGGCCGGTATTTCC-3’。
利用上述的检测引物，本发明提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊鉴别试剂盒，它包括如成分：
1）白纹伊蚊和埃及伊蚊ATP6基因的通用引物
ATP6-F：5’-AGTACTAGTCATTTAAC-3’。
ATP6-R：5’-GTTGATATAGGGCCGGTATTTCC-3’。
2）PCR混合液：FastStart Taq DNA聚合酶，反应缓冲液，dNTP混合液，ResoLight饱和荧光染料。
3）白纹伊蚊和埃及伊蚊基因组。
4）ddH2O。
5）25 mM MgCl2。
其中，所述的反应缓冲液为PCR buffer (10X) (PCR反应缓冲液)，为本领域常见的商品化缓冲液。
本发明还提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊鉴别方法，包括如下步骤：
1）高分辨率熔解曲线模板白纹伊蚊和埃及伊蚊基因组DNA的制备
使用电动匀浆器低温研磨白纹伊蚊和埃及伊蚊组织。使用TaKaRa MiniBESTUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(TaKaRa公司)，参照试剂盒说明提取白纹伊蚊和埃及伊蚊基因组DNA。
2）高分辨率熔解曲线反应体系：
30μL反应体系包括：ATP6-F 0.6 μL（10 μm工作浓度），ATP6-R 0.6 μL（10 μm工作浓度），模板2 μL，反应缓冲液3 μL，FastStart Taq DNA聚合酶0.5 μL，dNTP混合液2 μL，MgCl2 3.6 μL，ResoLight饱和荧光染料 1μL，ddH2O 16.7 μL。
3）高分辨率熔解曲线反应程序：
94℃预变性5 min。94℃变性30s，52 ℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。72℃延伸5min。
PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线。95℃变性1min。40℃降温1min。65-95℃连续升温（每次升温1℃，收集25个荧光信号）。40℃冷却10s。使用LightCycler® 480 GeneScanning Software 软件分析高分辨率熔解曲线。
本发明的一种以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊鉴别试剂盒及操作方法，根据白纹伊蚊和埃及伊蚊ATP6基因序列设计通用引物，可对白纹伊蚊和埃及伊蚊的成虫、卵、幼虫和蛹进行鉴别，与现有鉴别手段相比，本发明的有益效果在于：
1）可对白纹伊蚊和埃及伊蚊的各种状态进行鉴别，如成虫、卵、幼虫和蛹等状态，不需要孵化后鉴别。
2）本发明设计的引物，灵敏度高，特异性强。
3）操作简单、速度快，当天即可出具结果。
4）PCR 产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异等优势，实现真正的闭管操作从而降低污染风险，非常适合大量样品的分析。
附图说明
图1：白纹伊蚊和埃及伊蚊ATP6的PCR结果图，其中，M：DL2000，1白纹伊蚊，2埃及伊蚊。
图2：埃及伊蚊ATP6基因相对于白纹伊蚊ATP6基因的高分辨率熔解曲线图。横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度，其中有波动的曲线为埃及伊蚊，直线的为白纹伊蚊。
具体实施方式
下面利用实施例对本发明作进一步描述。
本实施例提供一种以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊鉴别试剂盒，包括如下体系：
1）白纹伊蚊和埃及伊蚊ATP6基因的通用引物
ATP6-F：5’-AGTACTAGTCATTTAAC-3’
ATP6-R：5’-GTTGATATAGGGCCGGTATTTCC-3’
2）PCR混合液：FastStart Taq DNA聚合酶，反应缓冲液，dNTP混合液，ResoLight饱和荧光染料
3）白纹伊蚊和埃及伊蚊基因组
4）ddH2O
5）25 mM MgCl2
还提供了一种以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊鉴别方法，按如下的步骤进行：
实例1：利用高分辨率熔解曲线鉴别白纹伊蚊和埃及伊蚊：
1）使用电动匀浆器低温研磨白纹伊蚊和埃及伊蚊组织。使用TaKaRa MiniBESTUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒(TaKaRa公司)，参照试剂盒说明提取白纹伊蚊和埃及伊蚊基因组DNA。
2）30μL高分辨率熔解曲线反应体系包括：ATP6-F 0.6 μL（10 μm工作浓度），ATP6-R 0.6 μL（10 μm工作浓度），模板2 μL，反应缓冲液3 μL，FastStart Taq DNA聚合酶0.5 μL，dNTP混合液2 μL，MgCl2 3.6 μL，ResoLight饱和荧光染料 1μL，ddH2O 16.7 μL。
3）高分辨率熔解曲线反应程序：94℃预变性5 min。94℃变性30s，52 ℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环。72℃延伸5min。PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线。95℃变性1min。40℃降温1min。65-95℃连续升温（每次升温1℃，收集25个荧光信号）。40℃冷却10s。使用LightCycler® 480 Gene Scanning Software 软件分析高分辨率熔解曲线。
4）结果：白纹伊蚊和埃及伊蚊ATP6 PCR均扩增出条带，扩增片段长度为266bp，基因测序并用NCBI Blast比对，比对结果为相对应的白纹伊蚊和埃及伊蚊。利用LightCycler® 480 Gene Scanning Software 软件分析高分辨率熔解曲线，发现白纹伊蚊和埃及伊蚊的曲线差异明显，可有效区分。
5）结论：本发明首次利用高分辨熔解曲线鉴别白纹伊蚊和埃及伊蚊，拓展了蚊类鉴定的视角。本发明利用基于白纹伊蚊和埃及伊蚊ATP6基因的高分辨熔解曲线也是蚊种鉴定的一个新方向。本试剂盒操作简单、速度快、PCR 产物无需后处理、可以检测出单个碱基的差异、真正实现闭管操作，可对白纹伊蚊和埃及伊蚊的各种状态进行鉴别，如成虫、卵、幼虫和蛹等状态，不需要孵化后鉴别。
当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例，本技术领域的普通技术人员，在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 山东国际旅行卫生保健中心
<120> 以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊ATP6基因鉴别试剂盒及其鉴别方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agtactagtc atttaac 17
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gttgatatag ggccggtatt tcc 23
Claims (1)
1.一种以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊ATP6基因鉴别方法，其特征在于，包括如下步骤：
1）高分辨率熔解曲线模板白纹伊蚊和埃及伊蚊基因组DNA的制备
使用电动匀浆器低温研磨白纹伊蚊和埃及伊蚊组织；使用TaKaRa MiniBESTUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0试剂盒，参照试剂盒说明提取白纹伊蚊和埃及伊蚊基因组DNA；
2）高分辨率熔解曲线反应体系：
30μL反应体系包括：工作浓度为10 μm的ATP6-F 0.6 μL，工作浓度为10 μm的ATP6-R0.6 μL，模板2 μL，反应缓冲液3 μL，FastStart Taq DNA聚合酶0.5 μL，dNTP混合液2 μL，MgCl2 3.6 μL，ResoLight饱和荧光染料 1μL，ddH2O 16.7 μL；
ATP6-F和ATP6-R的序列如下：
ATP6-F：5’-AGTACTAGTCATTTAAC-3’；
ATP6-R：5’-GTTGATATAGGGCCGGTATTTCC-3’；
4）高分辨率熔解曲线反应程序：
94℃预变性5 min；94℃变性30s，52 ℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸5min；
PCR结束后直接运行高分辨率熔解曲线；95℃变性1min；40℃降温1min；65-95℃连续升温，每次升温1℃，收集25个荧光信号；40℃冷却10s；使用LightCycler® 480 GeneScanning Software 软件分析高分辨率熔解曲线；横坐标为温度，纵坐标为相对荧光强度，其中有波动的曲线为埃及伊蚊，直线的为白纹伊蚊。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810270823.4A CN108410999B (zh) | 2018-03-29 | 2018-03-29 | 以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊atp6基因鉴别试剂盒及其鉴别方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810270823.4A CN108410999B (zh) | 2018-03-29 | 2018-03-29 | 以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊atp6基因鉴别试剂盒及其鉴别方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108410999A CN108410999A (zh) | 2018-08-17 |
| CN108410999B true CN108410999B (zh) | 2021-06-01 |
Family
ID=63133864
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810270823.4A Active CN108410999B (zh) | 2018-03-29 | 2018-03-29 | 以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊atp6基因鉴别试剂盒及其鉴别方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108410999B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105039563A (zh) * | 2015-08-14 | 2015-11-11 | 珠海国际旅行卫生保健中心 | 一种基于基因芯片同时鉴定三种伊蚊的探针及试剂盒 |
| CN105483124A (zh) * | 2015-12-22 | 2016-04-13 | 福建国际旅行卫生保健中心 | 蚊虫快速鉴定dna芯片及其鉴定方法 |
-
2018
- 2018-03-29 CN CN201810270823.4A patent/CN108410999B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105039563A (zh) * | 2015-08-14 | 2015-11-11 | 珠海国际旅行卫生保健中心 | 一种基于基因芯片同时鉴定三种伊蚊的探针及试剂盒 |
| CN105483124A (zh) * | 2015-12-22 | 2016-04-13 | 福建国际旅行卫生保健中心 | 蚊虫快速鉴定dna芯片及其鉴定方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DNA条形码在媒介蚊类鉴定中的应用;方义亮；高博；王宇平；等;《中国人兽共患病学报》;20121231;第29卷(第10期);第1012页右栏第2段 * |
| Rapid and high throughput molecular identification of diverse mosquito species by high resolution melting analysis;Ajamma, Yvonne Ukamaka; Mararo, Enock; Omondi, David; 等.;《F1000Research》;20160811(第5期);摘要，第5页左栏第2段和右栏第1段，第6页左栏第1段 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN108410999A (zh) | 2018-08-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108165642B (zh) | 以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊cytb基因鉴别试剂盒及其鉴别方法 | |
| Tomlinson | In-field diagnostics using loop-mediated isothermal amplification | |
| Dickinson | Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for detection of phytoplasmas in the field | |
| CN107619870A (zh) | 能预示和鉴定绵羊羊毛长度的分子标记及其特异性引物对和应用 | |
| CN111334608A (zh) | 用于检测新型冠状病毒2019-nCoV的双重荧光冻干微芯片、试剂盒及方法 | |
| CN110885899B (zh) | 用于鉴别16种禽病病原冻干微芯片、试剂盒及方法 | |
| CN110029176B (zh) | 以高分辨率熔解曲线为基础的三带喙库蚊鉴定试剂盒及其鉴定方法 | |
| CN108192986B (zh) | 以高分辨率熔解曲线为基础的淡色库蚊和致倦库蚊nd5基因鉴别试剂盒及其鉴别方法 | |
| CN113699276A (zh) | 以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒5种点突变s基因鉴别试剂盒及其鉴别方法 | |
| CN110885890B (zh) | 快速鉴别瓜实蝇和南亚果实蝇的hrm引物、试剂盒及方法 | |
| CN113736915A (zh) | 以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒3种点突变s基因鉴别试剂盒及其鉴别方法 | |
| CN108410999B (zh) | 以高分辨率熔解曲线为基础的白纹伊蚊和埃及伊蚊atp6基因鉴别试剂盒及其鉴别方法 | |
| Filipiak et al. | A fast and sensitive multiplex real-time PCR assay for simultaneous identification of Bursaphelenchus xylophilus, B. mucronatus and B. fraudulentus–three closely related species from the xylophilus group | |
| CN116516036A (zh) | 一种lamp法检测菠萝泛菌的引物和探针组合及应用 | |
| Gomes et al. | Direct detection of Theileria annulata in bovine blood samples using standard and isothermal DNA amplification approaches | |
| Paul et al. | Rapid extraction of plant nucleic acids by microneedle patch for in-field detection of plant pathogens | |
| CN111996263B (zh) | 基于Taqman-MGB实时荧光PCR技术的亚洲型舞毒蛾检测方法及其引物和探针 | |
| CN114085924A (zh) | 以高分辨率熔解曲线为基础的新型冠状病毒4种点突变s基因鉴别试剂盒及其鉴别方法 | |
| CN107435064B (zh) | 小球藻培养中危害金藻的快速定量检测qPCR方法 | |
| EP3245297B1 (en) | Method and kit for identification of nematodes, forest plant pests, by real-time pcr | |
| CN110894551A (zh) | 草鱼出血病i型病毒（gcrv-i）的raa恒温荧光检测方法及试剂 | |
| CN113862381B (zh) | 一种检测白纹伊蚊的环介导等温扩增引物、试剂盒和方法 | |
| KR101493903B1 (ko) | 샬롯노란줄무늬 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도 | |
| RU2795019C1 (ru) | Олигонуклеотиды для определения мутации S:P681R SARS-CoV-2 | |
| KR102421942B1 (ko) | 마이크로시스티스, 독성 마이크로시스티스 검출용 프라이머 세트 및 이를 이용한 독성 마이크로시스티스 검출방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |