CN105039563A - 一种基于基因芯片同时鉴定三种伊蚊的探针及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测鉴定领域，涉及一种针对白纹伊蚊、埃及伊蚊、东乡伊蚊3种伊蚊的基因芯片检测鉴定探针及试剂盒。本发明公开了一种基于基因芯片同时鉴定三种伊蚊的探针，包括下列三种探针：白纹伊蚊：CTTTAACACTGCTGCTTTCTAGTTC；埃及伊蚊：GTGCTGAACTTAGCCACCCTGGT；东乡伊蚊：AACTCTCCTGCTTTCAAGTAGT。本发明根据不同伊蚊的基因序列，选择基因序列保守位置并设计特异性寡核苷酸检测探针，利用分子生物学的方法进行蚊类鉴别，克服了传统媒介蚊种鉴定方法存在着鉴定专家数量有限、鉴定周期长、鉴定效率低等问题，实现了对白纹伊蚊、埃及伊蚊、东乡伊蚊三种伊蚊快速、准确的鉴定。经过实验检测，本发明的基因芯片及试剂盒特异性强，灵敏度高，可以很好的应用于口岸媒介生物鉴定工作。

Description

一种基于基因芯片同时鉴定三种伊蚊的探针及试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测鉴定领域，涉及一种针对白纹伊蚊、埃及伊蚊、东乡伊蚊3种伊蚊的基因芯片检测鉴定探针及试剂盒。
背景技术
伊蚊，蚊科(Culicidae)库蚊亚科(Culicinae)伊蚊属(Aedes)昆虫的统称。分布于全世界，是蚊科中最大一属，近1000种，中国有100余种。伊蚊会传播很多疾病，对人类的健康带来危害，黄热病与登革热就主要通过伊蚊传播。黄热病是由黄热病病毒引起的急性传染病，埃及伊蚊是主要传播媒介。登革热是一种急性传染病，已知12种伊蚊可传播本病，但最主要的是埃及伊蚊和白纹伊蚊。东乡伊蚊幼虫多孳生在海滨岩穴、石洞以及容器、船舱等的积水中，是马来丝虫病和乙型脑炎的传播媒介。
目前，口岸媒介生物的传统鉴定方法为形态学鉴定方法，主要是依据有形态学鉴定经验、具有媒介生物形态鉴定知识的实验室专业人员根据医学媒介分类检索表进行种类鉴定。受限于鉴定人员的经验积累、专业要求、标本完整性与发育阶段，传统媒介蚊种鉴定方法存在着鉴定专家数量有限、鉴定周期长、鉴定效率低等问题。比如，首先，传统的分类方法在鉴定蚊虫复合体、近缘种存在一定困难；其次，在国境口岸蚊媒监测和交通工具等的卫生检疫工作中，受不同的采集工具、采集方法的影响以及标本运送过程的限制，当专业技术人员鉴定时，许多蚊虫标本已经是残缺不全，往往是腹部鳞片或翅等重要体征脱落或受损，难以进行准确的形态分类；再次，对于截获的卵、幼虫和蛹，整个鉴定过程大致需要数周的时间，由于鉴定特征细微难辨，往往需要培养至成虫再鉴定，如果是少见的国外种类，还要请国外专家协助鉴定，鉴定所需的时间就更多了。
近年来，分子生物学技术的迅速发展，显示了在蚊类鉴别应用中的极大潜力，形成了许多分子鉴别方法，成为解决当前蚊虫分类难题的新钥匙。
基因芯片技术系指将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。基因芯片主要用于基因检测工作。基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。目前基于基因芯片鉴定蚊虫报道的技术极少，仅能搜索到赵明等人建立的DNA条形码芯片的初步研究，但是芯片的设计与研制主要通过虚拟电子杂交及验证，结果与实物的杂交还是有很大的差异。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明公开了一种基于基因芯片同时鉴定三种伊蚊的探针，包括下列三种探针：
白纹伊蚊：CTTTAACACTGCTGCTTTCTAGTTC；
埃及伊蚊：GTGCTGAACTTAGCCACCCTGGT；
东乡伊蚊：AACTCTCCTGCTTTCAAGTAGT。
本发明的内容还包括一种用于同时鉴定三种伊蚊的基因芯片，所述基因芯片含有上述三种探针。
本发明的内容还包括一种用于同时鉴定三种伊蚊的基因芯片试剂盒，所述基因芯片含有上述三种探针。
本发明的内容还包括上述基因芯片试剂盒在检测和鉴定白纹伊蚊、埃及伊蚊、东乡伊蚊三种伊蚊中的应用。
本发明根据不同伊蚊的基因序列，选择基因序列保守位置并设计特异性寡核苷酸检测探针，利用分子生物学的方法进行蚊类鉴别，克服了传统媒介蚊种鉴定方法存在着鉴定专家数量有限、鉴定周期长、鉴定效率低等问题，实现了对白纹伊蚊、埃及伊蚊、东乡伊蚊三种伊蚊快速、准确的鉴定。经过实验检测，本发明的基因芯片及试剂盒特异性强，灵敏度高，可以很好的应用于口岸媒介生物鉴定工作。
为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。
附图说明
图1实施例1的基因芯片的点样位置示意图，其中灰色点为阳性质控；黑色空心点为阴性质控；黑色实心点为检测样本。检测样本和质控点平行两组，检测样本从左到右分别为白纹伊蚊、东乡伊蚊、埃及伊蚊。
图2是特异性检测中，样品为白纹伊蚊的基因芯片杂交结果图，结果证明本发明的基因芯片可以特异性识别样品中的白纹伊蚊基因。
图3是特异性检测中，样品为东乡伊蚊的基因芯片杂交结果图，结果证明本发明的基因芯片可以特异性识别样品中的东乡伊蚊基因。
图4是特异性检测中，样品为埃及伊蚊的基因芯片杂交结果图，结果证明本发明的基因芯片可以特异性识别样品中的埃及伊蚊基因。
图5为本发明的基因芯片针对白纹伊蚊的灵敏度检测结果，其中1-6号为检测模板梯度依次2倍梯度稀释；
图6为本发明的基因芯片针对东乡伊蚊的灵敏度检测结果，其中1-6号为检测模板梯度依次2倍梯度稀释；
图7为本发明的基因芯片针对埃及伊蚊的灵敏度检测结果，其中1-6号为检测模板梯度依次2倍梯度稀释；
具体实施例
【实施例1基因芯片的制备】
本实施例的制备方法如下：
1、探针的设计：首先从NCBI基因数据库中下载相应的基因序列，使用软件对序列进行比对。根据比对结果在基因序列保守位置设计特异性寡核苷酸检测探针(表1)、质控探针(表2)和特异性引物(表3)。
2、探针的合成：每条探针的3′端加入6个碱基T且3′末端氨基修饰作为连接臂，使其固定在芯片上；质控探针除了3′末端进行氨基修饰外，5′端同时标记生物素。
3、芯片的制备：将合成的探针用去离子水稀释成100uM，分别取10ul探针溶液和10ul体积芯片点样液混匀，使探针终浓度为50uM。其中，点样位置如图1所示，灰色点为阳性质控；黑色空心点为阴性质控；黑色实心点为检测样本。检测样本和质控点平行两组，检测样本从左到右分别为白纹伊蚊、东乡伊蚊、埃及伊蚊。点样过程保持一定湿度，点样完成后将芯片置于干燥器中避光常温静置24小时。点制好的芯片常温干燥保存。
其中，用于检测鉴定3种伊蚊的寡核苷酸探针和质控探针如下：
表1检测探针
编号 蚊种 探针序列 长度(bp)
1 白纹伊蚊 CTTTAACACTGCTGCTTTCTAGTTC 25
2 埃及伊蚊 GTGCTGAACTTAGCCACCCTGGT 23
3 东乡伊蚊 AACTCTCCTGCTTTCAAGTAGT 22
表2质控探针
表3通用引物
引物名称 引物序列 长度(bp)
Lian6-1 TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA 26
Lian6-2 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG 25
利用基因芯片检测鉴定上述三种伊蚊的使用方法步骤如下：
1、提取待测样本的模板DNA：使用商品化动物组织基因组DNA提取试剂盒提取蚊虫DNA。
2、模板DNA的扩增与标记：模板DNA的扩增采用通用PCR引物，所述通用PCR引物的序列(表3)；PCR扩增反应：其反应体系如表4所示；反应程序：95℃预变性3min；35个循环为95℃30sec、45℃30sec、72℃,1min；72℃7min；4℃保存或进行下一步实验(表5)。
3、芯片杂交：将基因芯片分别置0.2％SDS和去离子水中分别清洗30sec，离心干燥；将PCR产物在95℃变形5min后立即置于冰浴中5min，取PCR产物5ul与5ul杂交液混匀，使用加样器加于芯片加样孔，使其均匀覆盖于阵列表面，将基因芯片放入杂交箱中45℃杂交1h。
4、杂交后清洗：杂交完成后，从杂交箱中取出芯片，并立即清洗基因芯片。
5、标记：向芯片加入15ul标记液，用移液器涂匀后将芯片放回杂交箱中，37℃反应30min，取出芯片用清洗液清洗10sec，干燥。
6、结果分析：向芯片反应孔加入1:1混合的检测液200ul，用移液器涂匀后，静置5-10min。
表4反应体系
成分 体积(ul)
模板 2.5
引物1 2.5
引物2 2.5
2×Mastermix 25
ddH2O 17.5
表5反应程序
【实施例2白纹伊蚊基因芯片的检测鉴定】
按照实施例1的方法制备基因芯片，室温干燥储存备用。取白纹伊蚊标本，用动物组织基因组试剂盒提取DNA，提取方式按说明书要求进行操作。按照实施例1的方法进行PCR扩增和探针杂交。
结果分析：杂交结果显示，实施例1制备的基因芯片对白纹伊蚊有很好的特异性识别能力。
【实施例3东乡伊蚊基因芯片的检测鉴定】
按照实施例1的方法制备基因芯片，室温干燥储存备用。取东乡伊蚊标本，用动物组织基因组试剂盒提取DNA，提取方式按说明书要求进行操作。按照实施例1的方法进行PCR扩增和探针杂交。
结果分析：杂交结果显示，实施例1制备的基因芯片对东乡伊蚊有很好的特异性识别能力。
【实施例4特异性检测】
参照实施例1，除了配置白纹伊蚊、埃及伊蚊、东乡伊蚊样品，还配置了致倦库蚊、骚扰阿蚊、中华按蚊等常见干扰蚊种样品，取其中之一或两两混合或三种混合配置成11种不同的待测样品，每种待测样品设置复管并分别标记。进行PCR扩增后，用检测探针对上述样品进行检测。结果表明，仅混合了白纹伊蚊、埃及伊蚊、东乡伊蚊的扩增产物能与相应的探针出现阳性结果。(图2、3、4)
结果：本发明所述检测方法对白纹伊蚊、埃及伊蚊、东乡伊蚊样品的检测结果为阳性，其它蚊虫和阴性对照的检测均为阴性，证明该方法有较好的特异性。
【实施例5灵敏性检测】
参照实施例1，配置不同浓度的白纹伊蚊、埃及伊蚊、东乡伊蚊，模板倍比稀释，用其对应的引物进行PCR扩增，PCR产物倍比稀释，95℃变性5min后立即置冰浴中静置5min，用检测探针对上述样品进行检测，检测到的最低浓度。(图5、6、7)
结果：平行对照实验的检测结果表明，本发明所述检测方法的检测下限分别为：白纹伊蚊0.0219ng(图5)；东乡伊蚊0.0125ng(图6)；埃及伊蚊0.0125ng(图7)。因此，本发明所述检测方法灵敏度高，且安全、高效，能在快速应急检测和微量样本检测中发挥重要作用。
【实施例6盲样检测】
参照实施例1，除了配置白纹伊蚊、埃及伊蚊、东乡伊蚊样品，还配置了致倦库蚊、三带喙库蚊、骚扰阿蚊、中华按蚊等常见干扰蚊种样品，随机取其中之一或两两混合或三种混合配置成6种不同的待测样品，每种待测样品设置复管并分别编号标记。进行PCR扩增后，用检测探针对上述样品进行检测。结果表明，仅混合了白纹伊蚊、埃及伊蚊、东乡伊蚊的扩增产物能与相应的探针出现阳性结果。
检测结果：利用本发明提供的检测方法可检出全部阳性样本。
本发明根据不同伊蚊的基因序列，选择基因序列保守位置并设计特异性寡核苷酸检测探针，利用分子生物学的方法进行蚊类鉴别，克服了传统媒介蚊种鉴定方法存在着鉴定专家数量有限、鉴定周期长、鉴定效率低等问题，实现了对白纹伊蚊、埃及伊蚊、东乡伊蚊三种伊蚊快速、准确的鉴定。经过实验检测，本发明的基因芯片及试剂盒特异性强，灵敏度高，可以很好的应用于口岸媒介生物鉴定工作。
本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。

Claims (4)

1.一种基于基因芯片同时鉴定三种伊蚊的探针，包括下列三种探针：
白纹伊蚊：CTTTAACACTGCTGCTTTCTAGTTC；
埃及伊蚊：GTGCTGAACTTAGCCACCCTGGT；
东乡伊蚊：AACTCTCCTGCTTTCAAGTAGT。
2.一种用于同时鉴定三种伊蚊的基因芯片，其特征在于：含有权利要求1所述探针。
3.一种用于同时鉴定三种伊蚊的基因芯片试剂盒，其特征在于：含有权利要求1所述探针。
4.权利要求3或4所述的基因芯片试剂盒在检测和鉴定白纹伊蚊、埃及伊蚊、东乡伊蚊三种伊蚊中的应用。
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