CN113736867A - 一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：RT‑qPCR预混液，RT‑qPCR酶，阳性质控品，阴性质控品。其中，RT‑qPCR预混液由一步反应RT‑qPCR缓冲液，以及登革病毒非编码区高度保守序列正向特异性引物、登革病毒非编码区高度保守序列反向特异性引物、登革病毒探针；埃及伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA探针；白纹伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA探针组成。该试剂盒具有灵敏、精准、高效的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，尤其涉及一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒。
技术背景
登革病毒(dengue virus)是单股正链RNA病毒，属于黄病毒科黄病毒属，是一类在病毒结构和基因组水平都高度保守的病毒群体。登革病毒通过蚊媒进行传播，主要的传播媒介是埃及伊蚊和白纹伊蚊，引起登革热以及发病率和死亡率均很高的登革出血热和登革休克综合征。形态学上，登革病毒是直径约为50nm的包膜球型病毒，由于登革病毒E蛋白以首尾相连的方式形成二聚体规则地排列在病毒表面，因此呈现出20面体对称的构象。登革病毒的基因组RNA约含有11000个核苷酸，基因组只有一个开放读码框，5’端和3’端均有一段非编码区。病毒5’端为I型帽子结构，四分之一编码病毒3个结构蛋白(C、PrM和E)；病毒3’端缺乏poly(A)尾，四分之三编码7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)。这些蛋白是以多聚蛋白形式进行翻译合成后，由宿主蛋白酶切割而形成的。目前，登革病毒的检测方法主要有病毒分离培养法、免疫学方法、普通RT-PCR等。病毒分离培养法实验要求高且周期长，无法快速检测病毒；免疫学方法虽然灵敏度高，但存在假阳性偏高和交叉反应等问题，且不适用于病毒种鉴别；普通RT-PCR方法存在容易造成扩增反应产物污染、敏感性不够等问题。
登革热是全球和我国严重的蚊媒传染病之一，其防控形势及挑战日益严峻，对我国人民健康和国家生物安全造成严重威胁。据研究显示，携带登革病毒的埃及伊蚊和白纹伊蚊雌蚊可通过垂直感染的方式，将登革病毒传给下一代，这是登革病毒持续存在于环境中的重要机制之一。在登革热疫情中，同时进行伊蚊监测和登革病毒检测，能对伊蚊携带病毒情况进行及时评估并指导灭蚊工作，从而降低疫情扩散的风险。
蚊虫是对人类危害严重的病媒生物之一。蚊虫不仅侵扰叮咬人类，影响人们的工作和休息，被蚊子叮咬后，被叮咬者的皮肤出现起包和发痒等症状，还可引起过敏反应，造成奇痒和红肿；并且登革热、流行性乙型脑炎、疟疾等多种高致病性、高病死率的传染病都和蚊虫叮咬有关，属于蚊媒传染病。伊蚊是蚊科库蚊亚科伊蚊属蚊虫，是蚊科中最大一属，更是凶猛的刺叮吸血蚊虫，分布范围广泛，在我国各省(区)都有分布。伊蚊监测和种群分类工作，是登革热等蚊媒传染病防控的基础。目前，蚊虫分类鉴定工作主要以蚊卵、蛹、幼虫及成虫的外部形态为依据。但在实际采样和监测工作中，运用传统的形态分类方法，蚊卵、蛹和幼虫的正确鉴定需要喂养羽化至成蚊，耗费时间长；蚊虫中存在多种形态相似的种群，应用形态学分类方法无法达到蚊虫复合体、近缘种等鉴别的需要；成蚊受采集方法、采集工具和卫生消毒等的影响，经常出现腹部鳞片或翅等重要体征脱落和受损的情况，难以运用形态学方法进行分类。
多重PCR反应是指在同一反应中实现多个基因序列的特异性扩增和检测。运用荧光检测技术，在经优化设计的多重PCR反应体系中加入不同荧光标记的探针，一对引物对应一个特异性的荧光探针，检测不同靶标的探针携带不同光谱范围的荧光基团，巧妙的把核酸扩增、光谱分析和实时检测技术结合在一起，利用荧光信号积累监测PCR反应的进程。多重荧光PCR技术可同时检测多种目标片段，大幅度提高工作效率，具有灵敏、准确、快速等特点，在蚊媒监测和病原微生物快速检测方面均具有不可替代的作用，应用前景广泛。
登革病毒的主要传播媒介为埃及伊蚊和白纹伊蚊。在野外伊蚊幼虫中可分离得到登革病毒，说明自然届存在伊蚊经蚊卵传递登革病毒的现象；实验研究证明，伊蚊亲代可以经蚊卵传递登革病毒给子代，且在传递过程中病毒毒力呈现逐渐加强的趋势。埃及伊蚊和白纹伊蚊两个蚊种可共存于同一生态位中，并具有共同的特征。受生态学和抗药性、蚊虫飞行距离、种群密度等多种因素影响，蚊虫引起的传染病流行早期很难被发现。因此，目前需要建立一种不仅能够同时对埃及伊蚊和白纹伊蚊的卵、蛹、幼虫及成虫不同发育阶段进行分类鉴定，并且可以对蚊媒携带登革病毒进行筛检的快速、精准、高通量的多重荧光RT-PCR方法，来提高蚊媒种群分类鉴定和病毒监测的效率及准确度。
发明内容
本发明的目的在于提供一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒，旨在解决现有技术中对蚊卵、蛹和幼虫的分类鉴定时间长，蚊虫复合体、近缘种、成蚊腹部鳞片或翅等重要体征脱落和受损时无法进行分类鉴定，在进行蚊媒分类鉴定的同时无法检测登革病毒的问题。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：RT-qPCR预混液，RT-qPCR酶，阳性质控品，阴性质控品。
其中，所述RT-qPCR预混液包含一步反应RT-qPCR缓冲液，以及登革病毒非编码区高度保守序列正向特异性引物、登革病毒非编码区高度保守序列反向特异性引物、登革病毒探针；埃及伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA探针；白纹伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA探针。
作为优先，所述登革病毒正向特异性引物的序列为Sequence ID No.1，为CAGGTGGAAGGGCGTACAAC；作为优先，所述登革病毒反向特异性引物的序列为Sequence IDNo.2，为CTCCCGTGACTGTAGCCAGA；所述登革病毒探针的序列为Sequence ID No.3，为FAM-ACTGCCGGAGACCCTGGAGACATTGCT-BHQ1。
进一步地，所述埃及伊蚊正向特异性引物的序列为Sequence ID No.4，为TCCGCCAAAAGCAGAACCTG；所述埃及伊蚊反向特异性引物的序列为Sequence ID No.5，为TCGGCCGGGATGTAGATGTT；所述埃及伊蚊探针的序列为Sequence ID No.6，为VIC-TCCGTGCGGCCAAGTATGCCAAGAAGT-BHQ1。
作为优先，所述白纹伊蚊正向特异性引物的序列为Sequence ID No.7，为TCCAGAATGCGTTACGTGGC；所述白纹伊蚊反向特异性引物的序列为Sequence ID No.8，为CCTTCAGCTCGTTGACCACC；所述白纹伊蚊探针的序列为Sequence ID No.9，为Cy5-ACGCCAGCCCATCGAATGCCGACAT-BHQ2。
作为优先，所述RT-qPCR酶预混液，包括反转录酶和热启动Taq DNA聚合酶。
作为优先，所述阳性质控品为含有登革病毒、埃及伊蚊和白纹伊蚊的目的基因片段的合成质粒混合物。所述阴性质控品为生理盐水。
作为优先，所述一步反应RT-qPCR的初始缓冲液浓度为2倍浓度；
所述RT-qPCR酶的初始预混液浓度为25倍浓度；
所述登革病毒正向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述登革病毒反向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述登革病毒探针的初始浓度为10μm/L；
所述埃及伊蚊正向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述埃及伊蚊反向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述埃及伊蚊探针的初始浓度为10μm/L；
所述白纹伊蚊正向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述白纹伊蚊反向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述白纹伊蚊探针的初始浓度为10μm/L。
作为优先，所述一步反应RT-qPCR缓冲液的应用浓度为1倍浓度；
所述RT-qPCR酶预混液的应用浓度为1倍浓度；
所述登革病毒正向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述登革病毒反向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述登革病毒探针的应用浓度为0.1μm/L；
所述埃及伊蚊正向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述埃及伊蚊反向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述埃及伊蚊探针的应用浓度为0.1μm/L；
所述白纹伊蚊正向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述白纹伊蚊反向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述白纹伊蚊探针的应用浓度为0.1μm/L。
作为优先，所述一步反应RT-qPCR的初始缓冲液的反应体系配制加入量为25μl；
所述RT-qPCR酶的初始预混液的反应体系配制加入量为2μl；
所述登革病毒正向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述登革病毒反向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述登革病毒探针的反应体系配制加入量为0.5μl；
所述埃及伊蚊正向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述埃及伊蚊反向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述埃及伊蚊探针的反应体系配制加入量为0.5μl；
所述白纹伊蚊正向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述白纹伊蚊反向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述白纹伊蚊探针的反应体系配制加入量为0.5μl。
本发明的技术效果：
本发明所述试剂盒加入了2种伊蚊和登革病毒的基因，同时包括了白纹伊蚊、埃及伊蚊和登革病毒的基因的正向、反向特异性引物和探针。该试剂盒是一种能够在同一反应管中同时进行伊蚊分类鉴定和登革病毒检测的新的三重荧光RT-PCR核酸检测试剂盒，将所述RT-qPCR预混液、RT-qPCR酶、阳性质控品、阴性质控品混合进行多重实时荧光PCR检测。采用本发明提供的试剂盒对伊蚊进行分类鉴定，同时检测登革病毒，提高了伊蚊监测分类鉴定的准确率和登革病毒快速检测的效率，节约时间、显著提高蚊媒分类监测的鉴别效率和登革病毒检测的速度。
附图说明
图1是本发明实施例提供的阳性质控品扩增曲线图。
图2是本发明实施例提供的阴性质控品扩增曲线图。
图3是本发明实施例提供的埃及伊蚊样本扩增曲线图。
图4是本发明实施例提供的白纹伊蚊样本扩增曲线图。
图5是本发明实施例提供的埃及伊蚊样本同时检测到蚊携带登革病毒扩增曲线图。
图6是本发明实施例提供的白纹伊蚊样本同时检测到蚊携带登革病毒扩增曲线图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清晰、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创新劳动前提下所获得的其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含的包括一个或更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或者两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明实例提供一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：RT-qPCR预混液，RT-qPCR酶，阳性质控品，阴性质控品。
具体的，所述RT-qPCR预混液包含一步反应RT-qPCR缓冲液，以及登革病毒非编码区高度保守序列正向特异性引物、登革病毒非编码区高度保守序列反向特异性引物、登革病毒探针；埃及伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA探针；白纹伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA探针。
优选的，所述登革病毒、埃及伊蚊和白纹伊蚊为美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)上已知的最新的登革病毒、埃及伊蚊和白纹伊蚊全基因组序列。优选的，设计的引物包括正向特异性引物、反向特异性引物和TaqMan荧光探针。其中，设计正向引物和反向引物，主要用于在RT-qPCR反应第一步时，以RNA为模版，采用随机引物，在逆转录酶的作用下反转录成cDNA；第二步以cDNA为模版，退火时正向引物和反向引物各自与其互补链的5’端通过碱基互补结合；第三步延伸反应时，DNA模板和引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTPs为反应原料，靶序列为模板，正向引物和反向引物的3’端不断加上新的碱基从而不断向前延伸，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。设计TaqMan荧光探针，TaqMan荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5’末端携带荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，3’端携带淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。TaqMan荧光探针重复性好、特异性强、线性范围宽，可提高反应效率和检测灵敏度。
优选的，根据登革病毒的全基因组序列，各引物序列如下：
所述登革病毒正向特异性引物的序列为Sequence ID No.1，为CAGGTGGAAGGGCGTACAAC；所述登革病毒反向特异性引物的序列为Sequence ID No.2，为CTCCCGTGACTGTAGCCAGA；所述登革病毒探针的序列为Sequence ID No.3，为FAM-ACTGCCGGAGACCCTGGAGACATTGCT-BHQ1。其中，所述登革病毒正向特异性引物的序列和反向特异性引物的序列包括登革病毒基因序列的特异性保守区，具有靶基因特异性，能够快速将登革病毒基因序列进行聚合酶链式扩增反应，减少反应时间，提高反应灵敏度。所述登革病毒探针的荧光基团为FAM，当进行检测时，若结果中出现了FAM的荧光曲线，即可立即分析得出所检测的蚊虫样本中有登革病毒核酸，提高了检测分析效率。
优选的，所述登革病毒正向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述登革病毒反向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述登革病毒探针的初始浓度为10μm/L。
优选的，所述登革病毒正向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述登革病毒反向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述登革病毒探针的应用浓度为0.1μm/L。
优选的，所述登革病毒正向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述登革病毒反向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述登革病毒探针的反应体系配制加入量为0.5μl。
优选的，根据埃及伊蚊的全基因组序列，各引物序列如下：
所述埃及伊蚊正向特异性引物的序列为Sequence ID No.4，为TCCGCCAAAAGCAGAACCTG；所述埃及伊蚊反向特异性引物的序列为Sequence ID No.5，为TCGGCCGGGATGTAGATGTT；所述埃及伊蚊探针的序列为Sequence ID No.6，为VIC-TCCGTGCGGCCAAGTATGCCAAGAAGT-BHQ1。其中，所述埃及伊蚊正向特异性引物的序列和反向特异性引物的序列包括埃及伊蚊基因序列的特异性保守区，具有靶基因特异性，能够快速将埃及伊蚊基因序列进行聚合酶链式扩增反应，减少反应时间，提高反应灵敏度。所述埃及伊蚊探针的荧光基团为VIC，当进行检测时，若结果中出现了VIC的荧光曲线，即可立即分析得出所检测的蚊虫样本核酸为埃及伊蚊基因，提高了蚊虫分类鉴定的效率。
优选的，所述埃及伊蚊正向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述埃及伊蚊反向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述埃及伊蚊探针的初始浓度为10μm/L。
优选的，所述埃及伊蚊正向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述埃及伊蚊反向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述埃及伊蚊探针的应用浓度为0.1μm/L。
优选的，所述埃及伊蚊正向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述埃及伊蚊反向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述埃及伊蚊探针的反应体系配制加入量为0.5μl。
优选的，根据白纹伊蚊的全基因组序列，各引物序列如下：
所述白纹伊蚊正向特异性引物的序列为Sequence ID No.7，为TCCAGAATGCGTTACGTGGC；所述白纹伊蚊反向特异性引物的序列为Sequence ID No.8，为CCTTCAGCTCGTTGACCACC；所述白纹伊蚊探针的序列为Sequence ID No.9，为Cy5-ACGCCAGCCCATCGAATGCCGACAT-BHQ2。其中，所述白纹伊蚊正向特异性引物的序列和反向特异性引物的序列包括白纹伊蚊基因序列的特异性保守区，具有靶基因特异性，能够快速将白纹伊蚊基因序列进行聚合酶链式扩增反应，减少反应时间，提高反应灵敏度。所述白纹伊蚊探针的荧光基团为Cy5，当进行检测时，若结果中出现了Cy5的荧光曲线，即可立即分析得出所检测的蚊虫样本核酸为白纹伊蚊基因，提高了蚊虫分类鉴定的效率。
优选的，所述白纹伊蚊正向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述白纹伊蚊反向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述白纹伊蚊探针的初始浓度为10μm/L。
优选的，所述白纹伊蚊正向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述白纹伊蚊反向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述白纹伊蚊探针的应用浓度为0.1μm/L。
优选的，所述白纹伊蚊正向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述白纹伊蚊反向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述白纹伊蚊探针的反应体系配制加入量为0.5μl。
优选的，所述RT-qPCR反应液包含一步反应RT-qPCR缓冲液，可有效提高反应的扩增性能和特异性，反应过程中无需添加试剂，无需开盖，避免了污染。在本发明中，所述一步反应RT-qPCR的初始缓冲液为配置在试剂盒中的较高浓度的缓冲液，所述一步反应RT-qPCR的初始缓冲液浓度为所述一步反应RT-qPCR的应用缓冲液浓度的2倍。在本发明中，所述一步反应RT-qPCR缓冲液的应用浓度为1倍浓度，所述一步反应RT-qPCR的初始缓冲液的反应体系配制加入量为25μl。
优选的，所述RT-qPCR酶预混液，包括反转录酶和热启动Taq DNA聚合酶，可有效提高反应的扩增性能和特异性，反应过程中无需添加试剂，无需开盖，避免了污染。在本发明中，所述RT-qPCR酶的初始预混液为配置在试剂盒中的较高浓度的预混液，所述RT-qPCR酶的初始预混液浓度为RT-qPCR酶应用预混液浓度的25倍。在本发明中，所述RT-qPCR酶预混液的应用浓度为1倍浓度，所述RT-qPCR酶的初始预混液的反应体系配制加入量为2μl。
优选的，所述阳性质控品为含有登革病毒、埃及伊蚊和白纹伊蚊的目的基因片段的合成质粒混合物，所述阳性质控品的加样量为10μl。
优选的，所述阴性质控品为生理盐水，所述阴性质控品的加样量为10μl。
本发明实施例提供的所述试剂盒加入了登革病毒、埃及伊蚊和白纹伊蚊的基因，同时包括了登革病毒、埃及伊蚊和白纹伊蚊的基因的正向特异性引物、反向特异性引物和探针。该试剂盒是一种可以在同一反应管中对埃及伊蚊和白纹伊蚊进行分类鉴定，并且可以对蚊虫携带的登革病毒进行检测的新的三重荧光RT-PCR核酸检测试剂盒，将所述RT-qPCR预混液，RT-qPCR酶，阳性质控品，阴性质控品混合进行三重实时荧光PCR检测技术，同时具备了特异性强和灵敏度高的优点。采用本发明提供的试剂盒对埃及伊蚊和白纹伊蚊进行分类鉴定，同时检测登革病毒，提高了蚊媒分类鉴定和病原体监测的效率，节省时间，同时提高蚊媒分类鉴别的准确率和病原体监测的效率。
相应的，本发明实施例同时提供了一种利用上述同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒进行检测的方法，该方法包括以下步骤：
S01.选取10个蚊媒监测样本，提取所述蚊虫样本的总RNA。
S02.依据已知登革病毒、埃及伊蚊和白纹伊蚊的全基因组序列，分别设计合成登革病毒非编码区高度保守序列正向特异性引物、登革病毒非编码区高度保守序列反向特异性引物、登革病毒探针；埃及伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA探针；白纹伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA探针。
S03.依据上述同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒提供的RT-qPCR预混液，RT-qPCR酶，阳性质控品，阴性质控品，配制50μl RT-qPCR反应体系。
S04.设置反应程序，其中，荧光信号设置为：荧光报告基团为FAM，VIC，Cy5通道；参比荧光(Passive Reference)为无(None)；荧光PCR扩增，设置反应总体积为50μl；荧光PCR扩增程序的设置见表1。
表1
S05.PCR扩增结束后，根据荧光曲线判断蚊虫分类和是否感染登革病毒。仅当阳性质控品在3个荧光通道中信号均为阳性，阴性质控品在3个荧光通道中信号均为阴性时，待检测样本的检测结果有效。
当检测结果中，每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的PCR反应循环数(CT值)≤40，且有明显指数增长期，检测结果为阳性样本。
当检测结果中，CT值为40＜CT＜45，且有明显指数增长期，检测结果为可疑样本；对于检测结果为可疑的样本，建议复检一次，如果复检结果CT＜40且有指数扩增，则判定检测结果为阳性样本，否则判定检测结果为阴性样本。
当检测结果中，CT＝40或无CT值，且无指数扩增期，检测结果为阴性样本。
具体的，在上述步骤S01中，所述蚊媒样本选自埃及伊蚊携带登革病毒、白纹伊蚊携带登革病毒、埃及伊蚊携带寨卡病毒、白纹伊蚊携带寨卡病毒、库蚊携带流行性乙脑病毒，上述蚊媒样本选用各2个。
优选的，所述提取所述蚊媒样本的RNA步骤中，采用RNA提取试剂盒High PureViral RNA Kit，瑞士Roche公司产品。按照试剂说明书进行样本核酸提取即可。
在上述S02步骤中，所述登革病毒非编码区高度保守序列正向特异性引物、登革病毒非编码区高度保守序列反向特异性引物、登革病毒探针；埃及伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA探针；白纹伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA探针的具体碱基序列如上文所述，此处不再复述。
在上述S03步骤中，依据上述同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒提供的RT-qPCR预混液，RT-qPCR酶，阳性质控品，阴性质控品，配制50μl RT-qPCR反应体系。各组分的反应体系配制加入量见表2。
表2
| 反应组分 | 反应体系配制加入量(μl) |
| 一步反应RT-qPCR预混液 | 25 |
| 登革病毒-正向引物 | 1 |
| 登革病毒-反向引物 | 1 |
| 登革病毒-FAM探针 | 0.5 |
| 埃及伊蚊-正向引物 | 1 |
| 埃及伊蚊-反向引物 | 1 |
| 埃及伊蚊-VIC探针 | 0.5 |
| 白纹伊蚊-正向引物 | 1 |
| 白纹伊蚊-反向引物 | 1 |
| 白纹伊蚊-Cy5探针 | 0.5 |
| RT-qPCR酶 | 2 |
| RNase free ddH<sub>2</sub>O | 10 |
| RNA模版 | 5.5 |
| 总反应体积 | 50 |
在上述S05步骤中，当检测结果中，每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的PCR反应循环数(CT值)≤40，且有明显指数增长期，检测结果为阳性样本，确定检测结果为阳性样本之后，对荧光基团进行进一步分析，确定蚊媒的分型和是否携带登革病毒。具体分析见表3，当荧光基团为FAM时，则检测结果为登革病毒核酸阳性；当荧光基团为VIC时，则蚊虫分型为埃及伊蚊；当荧光基团为Cy5时，则蚊虫分型为白纹伊蚊。
表3
上述方法是利用同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒进行检测的方法，基于三重荧光PCR技术，对样本进行登革病毒、埃及伊蚊和白纹伊蚊检测，检测时间2小时，检测结果可用于登革病毒检测、伊蚊分类鉴定和常规医学媒介生物监测等多个研究领域。本发明与现有技术相比较优点为：(1)一份样本1次检测即可同时进行伊蚊分类监测和登革病毒检测，检测时间2小时，与1个样本进行3次检测相比，显著提高了检测效率；(2)分别针对登革病毒、埃及伊蚊和白纹伊蚊基因序列设计正向反向特异性扩增引物和Taqman探针，保证检测的特异性和准确性；(3)可对蚊卵、蛹和幼虫，蚊虫复合体和近缘种等进行分子生物学水平的准确鉴定。
进一步的，以具体实施例的内容进行说明。
实施例1
S01.选取收集埃及伊蚊携带登革病毒样本、白纹伊蚊携带登革病毒样本、埃及伊蚊携带寨卡病毒样本、白纹伊蚊携带寨卡病毒样本、库蚊携带流行性乙脑病毒样本，上述蚊媒样本各选用2个。按照RNA提取试剂盒Roche High Pure Viral RNA Kit方法对样本进行核酸提取备用；分别取埃及伊蚊携带登革病毒样本核酸、白纹伊蚊携带登革病毒样本核酸、埃及伊蚊携带寨卡病毒样本核酸、白纹伊蚊携带寨卡病毒样本核酸进行阳性样本验证；取库蚊携带流行性乙脑病毒样本核酸进行特异性检测。
S02.依据已知登革病毒、埃及伊蚊和白纹伊蚊的全基因组序列，分别设计合成登革病毒非编码区高度保守序列正向特异性引物、登革病毒非编码区高度保守序列反向特异性引物、登革病毒探针；埃及伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA探针；白纹伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA探针。上述各引物的碱基序列见表4。
表4
S03.依据上述同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒提供的RT-qPCR预混液，RT-qPCR酶，阳性质控品，阴性质控品，配制50μl RT-qPCR反应体系。各组分的反应体系配制见表5。
表5
S04.设置反应程序，其中，荧光信号设置为：荧光报告基团为FAM，VIC，Cy5通道；参比荧光(Passive Reference)为无(None)；荧光PCR扩增，设置反应总体积为50μl；荧光PCR扩增程序的设置见表1。
表1
S05.PCR扩增结束后，根据荧光曲线判断蚊虫分类和是否感染登革病毒。仅当阳性质控品在3个荧光通道中信号均为阳性，阴性质控品在3个荧光通道中信号均为阴性时，待检测样本的检测结果有效。
当检测结果中，每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的PCR反应循环数(CT值)≤40，且有明显指数增长期，检测结果为阳性样本。
当检测结果中，40＜CT＜45，且有明显指数增长期，检测结果为可疑样本；对于检测结果为可疑的样本，建议复检一次，如果复检结果CT＜40且有指数扩增，则判定检测结果为阳性样本，否则判定检测结果为阴性样本。
当检测结果中，CT＝40或无CT值，且无指数扩增期，检测结果为阴性样本。
对上述样本检测结果进行分析，通过对埃及伊蚊携带登革病毒样本核酸、白纹伊蚊携带登革病毒样本核酸、埃及伊蚊携带寨卡病毒样本核酸、白纹伊蚊携带寨卡病毒样本核酸进行检测，结果目标蚊虫和病原体检测均为阳性，阳性样本检出率100％。样本验证如附图1-附图6。其中附图1为阳性质控品的扩增曲线，图2为阴性质控品扩增曲线，图3为埃及伊蚊样本扩增曲线，图4为白纹伊蚊样本扩增曲线，图5为埃及伊蚊样本且登革病毒阳性样本扩增曲线，图6为白纹伊蚊样本且登革病毒阳性样本扩增曲线。可以看出，阳性质控品的扩增曲线均为正值，阴性质控品吴扩增曲线。不同分型的伊蚊样本，其探针所带的荧光基团不同，不同荧光基团代表检测得到不同分型的伊蚊样本，其中，埃及伊蚊探针的荧光基团为VIC，白纹伊蚊探针的荧光基团为Cy5。
通过对库蚊携带流行性乙脑病毒样本进行特异性检测，非目标蚊虫和病原体检测均为阴性，结果表明该方法具有良好的特异性，特异性为100％。
以上所述仅为本发明的较良好实施例，并不用以限制本发明，在本发明的原则之内所作的修改和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>广西国际旅行卫生保健中心(南宁海关口岸门诊部)
<120>一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒
<130>2021.08.30
<160>9
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
CAGGTGGAAG GGCGTACAAC 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
CTCCCGTGAC TGTAGCCAGA 20
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
ACTGCCGGAG ACCCTGGAGA CATTGCT 27
<210>4
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
TCCGCCAAAA GCAGAACCTG 20
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
TCGGCCGGGA TGTAGATGTT 20
<210>6
<211>27
<212>DNA
<213>人工合成
<400>6
TCCGTGCGGC CAAGTATGCC AAGAAGT 27<210>7
<211>
<212>DNA
<213>人工合成
<400>7
TCCAGAATGC GTTACGTGGC 20
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工合成
<400>8
CCTTCAGCTC GTTGACCACC 20
<210>9
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<400>9
ACGCCAGCCC ATCGAATGCC GACAT 25
序列表
<110> 广西国际旅行卫生保健中心（南宁海关口岸门诊部）
<120> 一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 1
caggtggaag ggcgtacaac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
ctcccgtgac tgtagccaga 20
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 3
actgccggag accctggaga cattgct 27
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 4
tccgccaaaa gcagaacctg 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 5
tcggccggga tgtagatgtt 20
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工合成(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 6
tccgtgcggc caagtatgcc aagaagt 27
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 7
tccagaatgc gttacgtggc 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 8
ccttcagctc gttgaccacc 20
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工合成(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 9
acgccagccc atcgaatgcc gacat 25
Claims (9)
1.一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下试剂：RT-qPCR预混液，RT-qPCR酶，阳性质控品，阴性质控品。
其中，RT-qPCR预混液由一步反应RT-qPCR缓冲液，以及登革病毒非编码区高度保守序列正向特异性引物、登革病毒非编码区高度保守序列反向特异性引物、登革病毒探针；埃及伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、埃及伊蚊核糖体RNA探针；白纹伊蚊核糖体RNA正向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA反向特异性引物、白纹伊蚊核糖体RNA探针组成。
2.根据权利要求1所述的一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒，其特征在于：
所述登革病毒正向特异性引物的序列为Sequence ID No.1，为CAGGTGGAAGGGCGTACAAC；
所述登革病毒反向特异性引物的序列为Sequence ID No.2，为CTCCCGTGACTGTAGCCAGA；
所述登革病毒探针的序列为Sequence ID No.3，为FAM-ACTGCCGGAGACCCTGGAGACATTGCT-BHQ1。
3.根据权利要求1所述的一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒，其特征在于：
所述埃及伊蚊正向特异性引物的序列为Sequence ID No.4，为TCCGCCAAAAGCAGAACCTG；
所述埃及伊蚊反向特异性引物的序列为Sequence ID No.5，为TCGGCCGGGATGTAGATGTT；
所述埃及伊蚊探针的序列为Sequence ID No.6，为VIC-TCCGTGCGGCCAAGTATGCCAAGAAGT-BHQ1。
4.根据权利要求1所述的一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒，其特征在于：
所述白纹伊蚊正向特异性引物的序列为Sequence ID No.7，为TCCAGAATGCGTTACGTGGC；
所述白纹伊蚊反向特异性引物的序列为Sequence ID No.8，为CCTTCAGCTCGTTGACCACC；
所述白纹伊蚊探针的序列为Sequence ID No.9，为Cy5-ACGCCAGCCCATCGAATGCCGACAT-BHQ2。
5.根据权利要求1所述的一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述RT-qPCR酶预混液，包括反转录酶和热启动Taq DNA聚合酶。
6.根据权利要求1所述的一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为含有登革病毒、埃及伊蚊和白纹伊蚊的目的基因片段的合成质粒混合物。所述阴性质控品为生理盐水。
7.根据权利要求1-6所述的一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒，其特征在于：
所述一步反应RT-qPCR的初始缓冲液浓度为2倍浓度；
所述RT-qPCR酶的初始预混液浓度为25倍浓度；
所述登革病毒正向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述登革病毒反向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述登革病毒探针的初始浓度为10μm/L；
所述埃及伊蚊正向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述埃及伊蚊反向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述埃及伊蚊探针的初始浓度为10μm/L；
所述白纹伊蚊正向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述白纹伊蚊反向特异性引物的初始浓度为10μm/L，所述白纹伊蚊探针的初始浓度为10μm/L。
8.根据权利要求1-7所述的一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒，其特征在于：
所述一步反应RT-qPCR缓冲液的应用浓度为1倍浓度；
所述RT-qPCR酶预混液的应用浓度为1倍浓度；
所述登革病毒正向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述登革病毒反向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述登革病毒探针的应用浓度为0.1μm/L；
所述埃及伊蚊正向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述埃及伊蚊反向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述埃及伊蚊探针的应用浓度为0.1μm/L；
所述白纹伊蚊正向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述白纹伊蚊反向特异性引物的应用浓度为0.2μm/L，所述白纹伊蚊探针的应用浓度为0.1μm/L。
9.根据权利要求7所述的一种同时用于伊蚊分类监测和登革病毒检测的试剂盒，其特征在于：
所述一步反应RT-qPCR的初始缓冲液的反应体系配制加入量为25μl；
所述RT-qPCR酶的初始预混液的反应体系配制加入量为2μl；
所述登革病毒正向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述登革病毒反向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述登革病毒探针的反应体系配制加入量为0.5μl；
所述埃及伊蚊正向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述埃及伊蚊反向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述埃及伊蚊探针的反应体系配制加入量为0.5μl；
所述白纹伊蚊正向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述白纹伊蚊反向特异性引物的反应体系配制加入量为1μl，所述白纹伊蚊探针的反应体系配制加入量为0.5μl。
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