CN107022615B

CN107022615B - 用于检测松材线虫的lamp引物组、试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN107022615B
Application number: CN201710268382.XA
Authority: CN
Inventors: 汪来发; 王曦茁; 朴春根; 李永; 林彩丽; 薛寒
Original assignee: Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry
Current assignee: Research Institute of Forest Ecology Environment and Protection of Chinese Academy of Forestry
Priority date: 2017-04-22
Filing date: 2017-04-22
Publication date: 2021-07-09
Anticipated expiration: 2037-04-22
Also published as: CN107022615A

Abstract

本发明公开了一种用于检测松材线虫的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。本发明首先以松材线虫种内保守的SYG‑2基因为靶基因，设计并筛选获得一组对松材线虫特异性高的LAMP引物组，该LAMP引物组能够特异性区分松材线虫和拟松材线虫。本发明利用所述LAMP引物组建立了一种松材线虫LAMP快速检测试剂盒。本发明进一步利用所述LAMP引物组建立了一种松材线虫的LAMP快速检测方法，该方法能够准确鉴别样品中是否携带有松材线虫。本发明所述LAMP检测方法特异性高，操作简便、耗时短，对于松墨天牛携带松材线虫的快速检测以及松材线虫病的总体预警与控制策略具有重要意义。

Description

用于检测松材线虫的LAMP引物组、试剂盒及检测方法

技术领域

本发明涉及松材线虫的分子检测，尤其涉及用于检测松墨天牛携带松材线虫的LAMP引物组和试剂盒，还涉及所述LAMP引物组、试剂盒在检测松墨天牛携带松材线虫中的应用，属于松墨天牛携带松材线虫的分子检测领域。

背景技术

松材线虫病(Pine wilt disease)，又被称为松树萎蔫病、枯萎病，该病由松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus(Steiner&Buhrer)Nickle]引起，主要通过墨天牛属(Monochamus)昆虫在松树上取食和产卵进行自然传播以及病木、病木加工木的运输进行长距离传播。林区内松材线虫的传播主要靠松墨天牛，可为害包括松属(Pinus spp.)、落叶松属(Larix spp.)、云杉属(Picea spp.)、黄杉属(Pseudotsuga spp.)、冷杉属(Abies spp.)和雪松属(Cedrus spp.)的36种松属植物和8种非松属植物，其中松属植物是最主要的寄主。由于其危害极其严重而目前又缺乏有效的防治方法，被多个国家列为头号检疫对象。

形态学是线虫种类常规鉴定的标准方法，松材线虫的鉴定主要依靠成虫的形态特征。但是，通过形态学准确鉴定松材线虫成虫对于非专业人员相当困难，且无法对幼虫进行准确鉴定。由于形态学的限制，免疫学、生理生化和分子生物学方法被应用到松材线虫的鉴定上。

松墨天牛是松材线虫病最重要的传播媒介，携带的是松材线虫幼虫，且携带的线虫有多种，难以根据形态学特征来区分和鉴定松材线虫幼虫。准确诊断松墨天牛携带的松材线虫是监测松材线虫病发生蔓延过程中急需解决的难题。分子生物学技术的引入，克服了形态学的一些限制，实现快速鉴定。松墨天牛携带的松材线虫分子检测技术的开发，对于及时发现早期疫点，有效的将松材线虫病控制在一定的范围内，缩小松材线虫病的发生，降低防治成本，具有重要的意义；同时为松材线虫病的总体预警与控制策略提供依据。

目前，松材线虫的检测与鉴定主要以分子生物学的方法为主。其中，DNA探针技术虽能有效地鉴定松材线虫，但费用较高，具有放射性；RAPD技术分析松材线虫与近似种的关系，结果重复性较差；RFLP技术区分松材线虫和拟松材线虫，内切酶价格昂贵、耗时；荧光PCR灵敏、快速，但较昂贵；PCR技术操作简便、花费较少，但所需时间也较长。

环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，简称LAMP)是2000年日本荣研化学株式会的Notomi T等开发的一种新的核酸扩增方法，该方法针对靶基因的6个区域设计了2对特异的引物，引物在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下在恒温条件(65℃左右)下保温几十分钟，因其独特的反转设计，对自身进行链置换无限扩增；整个反应过程1个小时内即可完成，其间不需要模板的热变性、退火、温度循环等过程，扩增具有高特异性、等温快速的特点。因此，相较以上几种分子检测技术，LAMP扩增不需要昂贵的仪器和试剂，更利于在一些基层机构的应用。

SYG-2基因是编码多功能细胞粘附因子的基因。SYG-1和SYG-2存在于所有动物类群中，从突触的形成到过滤防御屏障的建立，参与多种主要的生理功能。以松材线虫的SYG-2基因为靶标设计特异性引物，对松墨天牛携带的松材线虫进行LAMP快速扩增，将对于松材线虫的快速鉴定及有效防控具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供用于检测松材线虫的LAMP引物组；

本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种松材线虫的LAMP检测试剂盒；

本发明所要解决的第三个技术问题是建立一种松材线虫的LAMP快速检测方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了用于检测松材线虫的LAMP引物组，所述LAMP引物组选自以下2组引物中的任意一组：

引物组(1)：包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对由核苷酸序列为SEQ IDNo.1所示上游外引物和SEQ ID No.2所示下游外引物组成；所述内引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示上游内引物和SEQ ID No.4所示下游内引物组成；

引物组(2)：包括一对外引物、一对内引物和一对环引物；所述外引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示上游外引物和SEQ ID No.2所示下游外引物组成；所述内引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示上游内引物和SEQ ID No.4所示下游内引物组成；所述环引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.5所示上游环引物和SEQ ID No.6所示下游环引物组成。

优选的，所述检测样品是松墨天牛。

本发明经NCBI比对松材线虫和拟松材线虫的SYG-2基因片段，发现该段基因在松材线虫种内保守，与拟松材线虫种间差异极其大。因此，本发明以松材线虫的SYG-2基因为靶基因，设计了16组LAMP引物。对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果证明，16号引物组不加环引物(即本发明所述引物组(1))，扩增不出拟松材线虫，对松材线虫检测的特异性好；而且16号引物组不加环引物，检测松材线虫Bx的出峰时间为25-30min，扩增效率较高。16号引物组在加环引物的情况下(即本发明所述引物组(2))，可以扩增出拟松材线虫，对松材线虫检测的特异性不好。

本发明所设计的8号引物组在不加环引物的情况下，也扩增不出拟松材线虫，其检测松材线虫Bx的出峰时间为15-20min，扩增效率略优于16号引物组不加环引物。虽然4号引物组加环引物或者不加环引物，都不能扩增出拟松材线虫，但其扩增效率不是最优；具体为，4号引物组加环引物检测松材线虫Bx的出峰时间为20-25min；4号引物组不加环引物检测松材线虫Bx的出峰时间为30-35min。比较可见，在不加环引物的情况下，16号引物组的扩增效率优于4号引物组。另外，本发明所设计的1号、10号、13号和15号引物组加/不加环引物都能扩增出拟松材线虫，对松材线虫检测的特异性差；3号和5号引物组在加环引物的情况下，可扩增出拟松材线虫，而不加环引物，均扩增不出松材线虫和拟松材线虫；其余7组引物加/不加环引物均不能扩增出松材线虫；可见，上述引物组均不能用于松墨天牛携带松材线虫的检测。

因此，本发明用于检测松墨天牛携带松材线虫的LAMP引物组优选为16号引物组不加环引物，即引物组(1)：包括一对外引物和一对内引物；所述外引物对由核苷酸序列为SEQID No.1所示上游外引物和SEQ ID No.2所示下游外引物组成；所述内引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示上游内引物和SEQ ID No.4所示下游内引物组成。

本发明所述的LAMP引物组能够应用于检测松墨天牛携带的松材线虫。

本发明进一步公开了一种松墨天牛携带松材线虫的LAMP检测试剂盒，包括：LAMP引物组，2×RM(包括：Tris-HCl，KCl，MgSO₄，(NH₄)SO₄，Tween20，Betaine，dNTPs)，SYBRGreenⅠ，Bst DNA聚合酶和ddH₂O；其中，所述LAMP引物组选自本发明所述的LAMP引物组，即16号引物组加环引物或者不加环引物，优选为16号引物组不加环引物。

本发明所述的LAMP检测试剂盒能够应用于检测松墨天牛携带的松材线虫。

本发明还公开了一种松墨天牛携带松材线虫的LAMP检测方法，包括以下步骤：(1)提取待测松墨天牛的DNA；(2)以提取的DNA为模板，以本发明所述的LAMP引物组(即16号引物组加环引物或者不加环引物)为扩增引物，建立LAMP反应体系并置于实时荧光PCR仪中进行PCR反应；(3)对反应结果进行判定：①收集荧光信号，如果出现“S”型扩增曲线，则判定为阳性(有核酸扩增，即待测松墨天牛携带松材线虫)；如果无“S”型扩增曲线，则判定为阴性(无核酸扩增，即待测松墨天牛不携带松材线虫)；或者，②将PCR反应产物灭活，加入显色液混匀；如果呈现绿色，则判定为阳性(有核酸扩增，即待测松墨天牛携带松材线虫)；如果呈现橙色，则判定为阴性(无核酸扩增，即待测松墨天牛不携带松材线虫)。

其中，当所述LAMP引物组为16号引物组不加环引物时，LAMP反应体系包括：反应体系的总体积为25μl；其中，2×RM 12.5μl(包括：pH8.8的Tris-HCl 40mM，KCl 20mM，MgSO₄16mM，(NH₄)SO₄ 20mM，Tween20 0.2％，Betaine 1.6M，dNTPs(2.8mM每种))，SYBR Green I0.5μl，40μM的上游内引物1μl，40μM的下游内引物1μl，10μM的上游外引物0.5μl，10μM的下游外引物0.5μl，8U/μL的Bst DNA聚合酶1μl，DNA模板1μl，余量为ddH₂O。或者，当所述LAMP引物组为16号引物组加环引物时，所述LAMP反应体系包括：反应体系的总体积为25μl；其中，2×RM 12.5μl，SYBR Green I 0.5μl，40μM的上游内引物1μl，40μM的下游内引物1μl，10μM的上游外引物0.5μl，10μM的下游外引物0.5μl，20μM的上游环引物0.5μl，20μM的下游环引物0.5μl，8U/μL的Bst DNA聚合酶1μl，DNA模板1μl，余量为ddH₂O。

本发明所述LAMP检测方法中，所述PCR反应的程序包括：63℃15s，63℃45s作为一个循环；于63℃45s处收集荧光信号。所述灭活是85℃灭活3min。

应用本发明所建立的松墨天牛携带松材线虫的LAMP检测方法，对江苏南京采集的携带松材线虫的松墨天牛的检出率分别为28.60％和43.75％。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明以松材线虫种内保守的SYG-2基因为靶基因，设计并筛选获得能够特异性区分松材线虫和拟松材线虫的LAMP引物组。本发明进一步利用该特异性LAMP引物组建立一种松墨天牛携带松材线虫的LAMP检测方法，该方法能够对松墨天牛携带的松材线虫进行快速检测，不仅特异性高，而且操作简便、耗时短，成本低。本发明方法对于准确诊断松墨天牛携带的松材线虫，监控松材线虫病的发生与蔓延以及对松材线虫病的总体预警与控制策略等均具有重要的意义。

附图说明

图1为1号、4号和15号引物组不加环引物，对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果；

图2为8号和16号引物组不加环引物，对松材线虫Bx的检测结果；

图3为8号和16号引物组不加环引物，对天牛检测的结果；其中，NJ1代表从江苏南京采集的天牛携带松材线虫(6月21日批)；NJ2代表从江苏南京采集的天牛携带松材线虫(6月24日批)；

图4为10号和13号引物组不加环引物，对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果；

图5为1号、8号、13号和15号引物组加环引物，对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果；

图6为3号引物组加环引物，对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果；

图7为4号引物组加环引物，对松材线虫Bx和天牛的检测结果；其中，NJ1代表从江苏南京采集的天牛携带松材线虫(6月21日批)；NJ2代表从江苏南京采集的天牛携带松材线虫(6月24日批)；SD-1代表从山东采集的松材线虫；JS代表从江苏采集的松材线虫；JST-10代表从江苏采集的松材线虫；JS和JST-10代表不同的株系；

图8为5号和16号引物组加环引物，对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果；

图9为10号引物组加环引物，对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1松墨天牛携带松材线虫的LAMP快速检测方法的建立

1、材料与方法

1.1松墨天牛DNA的提取

取松墨天牛成虫头部及胸部组织0.2g放入2mL EP管中，放入钢珠研磨仪研磨5min(60Hz)；加入600μL 3M异硫氰酸胍提取缓冲液，室温裂解1h，期间颠倒混匀；加入600μLTris-酚氯仿异戊醇(25:24:1)，12000r/min离心10min；吸取上清液，加入600μL氯仿异戊醇(24:1)，12000r/min离心10min；吸取上清液，加入600μL异丙醇-20℃沉淀20min，12000r/min离心10min；弃上清，70％乙醇清洗沉淀2次，每次12000r/min离心3min；吸干乙醇彻底干燥后，用60μLBuffer TE溶解DNA，备用。

1.2 LAMP引物设计

经NCBI比对松材线虫和拟松材线虫的SYG-2基因片段，发现该段基因在松材线虫种内保守，与拟松材线虫种间差异极其大。因此，SYG-2可以作为松材线虫LAMP检测的新靶基因。

以SYG-2基因为靶基因，通过荣研公司的LAMP引物在线设计软件http://primerexplorer.jp/e/进行了LAMP引物设计。所设计的LAMP引物组见表1。

表1以SYG-2为靶基因设计的LAMP引物

1.3 LAMP反应

LAMP反应方法参照loopamp DNA扩增试剂盒(Eiken Chemical)，按下表反应液配比构建25μl的LAMP反应体系(表2)。

表2 LAMP反应体系

上述试剂混匀后，加入20μl密封液，混匀离心，盖紧管盖。

1.4 LAMP反应结果检测

1.4.1实时荧光法

将反应管放入实时荧光PCR仪，反应程序为63℃15s，63℃45s作为一个循环，于63℃45s处收集荧光信号，若有“S”型扩增曲线，则判断为阳性(有核酸扩增)，若无“S”型扩增曲线，则判断为阴性(无核酸扩增)。

1.4.2染色法

从实时荧光PCR仪中拿出反应管，85℃灭活3min，然后将1μl显色液滴在PCR管盖中间，盖紧管盖。颠倒反应管数次，使反应混合液与显色液充分混匀，观察反应液颜色。若呈现绿色则为阳性(有核酸扩增)，呈现橙色则为阴性(无核酸扩增)。

2、结果与分析

2.1 LAMP引物对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果

以SYG-2为靶基因设计的LAMP引物，对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果见表3。

表3 LAMP引物对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果

本发明所设计的16组引物，其中9组引物对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm进行LAMP检测，结果为：

1号、10号、13号和15号引物组加/不加环引物都能扩增出拟松材线虫；

3号和5号引物组在加环引物的情况下，可扩增出拟松材线虫，而不加环引物，扩增不出松材线虫和拟松材线虫；

8号、16号引物组在加环引物的情况下，可扩增出拟松材线虫，而不加环引物，扩增不出拟松材线虫。

4号引物组加/不加环引物都不能扩增出拟松材线虫，但扩增效率不算最优。

具体的，1号、4号和15号引物组不加环引物，对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果(实时荧光扩增曲线)见图1；

8号和16号引物组不加环引物，对松材线虫Bx的检测结果见图2；8号和16号引物组不加环引物，对天牛的检测结果见图3；

10号和13号引物组不加环引物，对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果见图4；

1号、8号、13号和15号引物组加环引物，对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果见图5；

3号引物组加环引物，对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果见图6；

4号引物组加环引物，对松材线虫Bx和天牛的检测结果见图7；

5号和16号引物组加环引物，对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果见图8；

10号引物组加环引物，对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm的检测结果见图9。

采用另外7组引物(即：2号、6号、7号、9号、11号、12号和14号引物组)对松材线虫Bx和拟松材线虫Bm进行LAMP检测，结果发现，这7组引物无论加环引物或不加环引物都不能扩增出松材线虫。

2.2携带松材线虫的松墨天牛检出率

应用本发明所述的16号引物组不加环引物，分别对2批松墨天牛进行检测，结果松墨天牛中松材线虫的检出率分别为28.60％和43.75％(表4)。

表4松墨天牛中松材线虫的检出率

SEQUENCE LISTING

<110> 中国林业科学院森林生态环境与保护研究所

<120> 用于检测松材线虫的LAMP引物组、试剂盒及检测方法

<130> BJ-2003-170425A

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 1

gcctctttgt ttcgcttaga 20

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 2

cgatcttggc tttctccc 18

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 3

attgtcagca agtgagtctt cccgcttgac atgtctctgt aa 42

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 4

aagtacggag cgaagatcac ttaagcgtcg gcttcacatt 40

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 5

atttcccaag tttctgctcc t 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> artifical sequence

<400> 6

aaggactctg tggtgcttg 19

Claims

1.用于检测松材线虫的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组由一对外引物和一对内引物组成；所述外引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.1所示上游外引物和SEQ ID No.2所示下游外引物组成；所述内引物对由核苷酸序列为SEQ ID No.3所示上游内引物和SEQID No.4所示下游内引物组成。

2.权利要求1所述的LAMP引物组在检测样品中是否携带松材线虫中的应用。

3.按照权利要求2所述的应用，所述的检测样品是松墨天牛。

4.一种松材线虫的LAMP检测试剂盒，包括：LAMP引物组，2×RM，SYBR GreenⅠ，Bst DNA聚合酶和ddH₂O；其特征在于：所述LAMP引物组是权利要求1所述的LAMP引物组。

5.权利要求4所述的LAMP检测试剂盒在检测样品中是否携带松材线虫中的应用。

6.按照权利要求5所述的应用，所述的检测样品是松墨天牛。

7.一种松材线虫的LAMP检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)提取待测样品的DNA；(2)以提取的DNA为模板，以权利要求1所述的LAMP引物组为扩增引物，建立LAMP反应体系并于实时荧光PCR仪中进行PCR反应；(3)对反应结果进行判定：①收集荧光信号，如果出现“S”型扩增曲线，则判定为阳性；如果无“S”型扩增曲线，则判定为阴性；或者，②将PCR反应产物灭活，加入显色液混匀，如果呈现绿色，则判定为阳性；如果呈现橙色，则判定为阴性。

8.按照权利要求7所述的LAMP检测方法，其特征在于，所述待测样品是松墨天牛；

所述LAMP反应体系包括：反应体系的总体积为25μl；其中，2×RM12.5μl，SYBR GreenI0.5μl，40μM的上游内引物1μl，40μM的下游内引物1μl，10μM的上游外引物0.5μl，10μM的下游外引物0.5μl，8U/μL的Bst DNA聚合酶1μl，DNA模板1μl，余量为ddH₂O。

9.按照权利要求7所述的LAMP检测方法，其特征在于，所述PCR反应的程序包括：63℃15s，63℃45s作为一个循环；

所述收集荧光信号是于63℃45s处收集荧光信号。

10.按照权利要求7所述的LAMP检测方法，其特征在于：所述灭活是85℃灭活3min。