PT2009136456W - Método de extracção de adn para bursaphelenchus xylophilus a partir de aparas de madeira, conjunto de iniciadores lamp para bursaphelenchus xylophilus e método de detecção para bursaphelenchus xylophilus a partir de aparas de madeira - Google Patents

Método de extracção de adn para bursaphelenchus xylophilus a partir de aparas de madeira, conjunto de iniciadores lamp para bursaphelenchus xylophilus e método de detecção para bursaphelenchus xylophilus a partir de aparas de madeira Download PDF

Info

Publication number
PT2009136456W
PT2009136456W PT2008069185A PT2008069185A PT2009136456W PT 2009136456 W PT2009136456 W PT 2009136456W PT 2008069185 A PT2008069185 A PT 2008069185A PT 2008069185 A PT2008069185 A PT 2008069185A PT 2009136456 W PT2009136456 W PT 2009136456W
Authority
PT
Portugal
Prior art keywords
bursaphelenchus xylophilus
dna
amplification
primer
bursaphelenchus
Prior art date
Application number
PT2008069185A
Other languages
English (en)
Inventor
Takuya Aikawa
Taisei Kikuchi
Natsumi Kanzaki
Original Assignee
Forestry And Forest Products Res Inst
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forestry And Forest Products Res Inst filed Critical Forestry And Forest Products Res Inst
Publication of PT2009136456W publication Critical patent/PT2009136456W/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

DESCRIÇÃO "MÉTODO DE EXTRACÇÃO DE ADN PARA BURSAPHELENCHUS XYLOPHILUS A PARTIR DE APARAS DE MADEIRA, CONJUNTO DE INICIADORES LAMP PARA BURSAPHELENCHUS XYLOPHILUS E MÉTODO DE DETECÇÃO PARA BURSAPHELENCHUS XYLOPHILUS A PARTIR DE APARAS DE MADEIRA"
CAMPO TÉCNICO A presente invenção refere-se a um método para extracção de ADN de Bursaphelenchus xylophilus a partir de um pedaço de madeira que inclui Bursaphelenchus xylophilus, um conjunto de iniciadores LAMP compreendendo um iniciador que emparelha com a uma região especifica de ADN de Bursaphelenchus xylophilus, um método para detecção de Bursaphelenchus xylophilus a partir de um pedaço de madeira e a um método para detecção de Bursaphelenchus xylophilus utilizando amplificação génica.
ANTECEDENTES DA TÉCNICA 0 Bursaphelenchus xylophilus é um patógeneo da doença da murchidão do pinheiro que causa o mais grave dano a florestas no Japão. 0 Bursaphelenchus xylophilus é uma espécie invasiva da América do Norte que causou dano dramático a pinheiros Japoneses que não tinham resistência ao Bursaphelenchus xylophilus. Actualmente, à excepção das prefeituras de Hokkaido e Aomori, o Bursaphelenchus xylophilus propagou-se por todo o Japão. 1
Para diagnosticar a doença da murchidão do pinheiro é necessário detectar o Bursaphelenchus xylophilus a partir de um pedaço de madeira, retirado de uma árvore de pinheiro morta. De modo convencional, isto é habitualmente efectuado através do isolamento de Bursaphelenchus xylophilus a partir do pedaço de madeira, utilizando o método de Baermann e a realização de uma observação morfológica. 0 método de Baermann (ver, por exemplo, Masahara Mamiya, Kazuyoshi Futai, Hajime Kosaka, Natsumi Kanzaki (2004), Wood Nematodes (Nematode Experiment Methods, editado pela Sociedade Nematológica Japonesa, Sociedade Nematológica Japonesa, Ibaraki) 134-153) é um método no qual um espécime é embrulhado num toalhete de papel e mergulhado num funil cheio com água. Se um nemátodo estiver no espécime, o nemátodo irá cair para o fundo do funil. A morfologia do nemátodo caido pode ser, depois, confirmada com um microscópio, de modo a determinar se é ou não Bursaphelenchus xylophilus.
Contudo, além de requerer um tempo muito longo para o isolamento do nemátodo a partir do pedaço de madeira, o método de Baermann requer conhecimento especialista com respeito à morfologia do nemátodo. Além disso, para detecção do nemátodo é necessário equipamento caro, tal como um microscópio. Por conseguinte, a detecção de Bursaphelenchus xylophilus tem sido, até agora, efectuada em instituições especialistas tendo as pessoas e equipamento capazes de distinguirem nemátodos. Por outras palavras, não existia, até agora, um método fácil para detecção de Bursaphelenchus xylophilus. 2
DIVULGAÇÃO DA INVENÇÃO
PROBLEMAS A SEREM RESOLVIDOS PELA INVENÇÃO
Em campos tais como o alimentar e medicina, foram propostos métodos de detecção para patógeneos utilizando amplificação de ADN. Contudo, como se descreve abaixo, uma vez que o Bursaphelenchus xylophilus está presente nas árvores, dá-se a circunstância especial de que os métodos convencionais empregues em outros campos não poderem ser aplicados na prática. A presente invenção foi concebida em consideração de tais circunstâncias. É um objectivo da presente invenção proporcionar um método para extracção simples de ADN de Bursaphelenchus xylophilus a partir de um pedaço de madeira que inclui Bursaphelenchus xylophilus, um conjunto de iniciadores LAMP de Bursaphelenchus xylophilus e um método de detecção de Bursaphelenchus xylophilus capaz de facilmente detectar Bursaphelenchus xylophilus utilizando amplificação génica.
MEIOS PARA RESOLUÇÃO DOS PROBLEMAS
Especificamente, a presente invenção proporciona um método para extracção de ADN de Bursaphelenchus xylophilus a partir de um pedaço de madeira, compreendendo mergulhar um pedaço de madeira incluindo Bursaphelenchus xylophilus numa solução compreendendo uma solução de extracção de ADN e um enzima que decompõe a queratina.
Além disso, a presente invenção proporciona um conjunto de iniciadores LAMP que podem ser emparelhados com uma região específica do ADNr de Bursaphelenchus xylophilus, e que é 3 utilizado num método de detecção de ADN do Bursaphelenchus xylophilus por amplificação da região especifica, caracterizado por compreender iniciadores F3, B3, FIP e BIP para as respectivas sequências de bases, representados pelas sequências ID N° 1 a 4 na listagem de sequências (este conjunto de iniciadores será referido na presente descrição como "primeiro conjunto de iniciadores") . 0 conjunto de iniciadores LAMP de acordo com a presente invenção também pode incluir uma sequência de bases de iniciador Loop-F, representada pela sequência ID N° 5 na listagem de sequências (este conjunto de iniciadores, incluindo um iniciador Loop F adicional além dos iniciadores com as sequências de bases F3, B3, FIP e BIP será referido na descrição como "segundo conjunto de iniciadores") . Estes conjuntos de iniciadores podem ser utilizados para amplificação de ADN de Bursaphelenchus xylophilus extraído, permitindo que uma enzima que degrada a queratina actue num pedaço de madeira incluindo Bursaphelenchus xylophilus.
Adicionalmente, a presente invenção proporciona um método para detecção de Bursaphelenchus xylophilus, compreendendo: um passo de mergulhar um pedaço de madeira incluindo Bursaphelenchus xylophilus numa solução compreendendo uma solução de extracção de ADN e um enzima que decompõe a queratina; e um passo de amplificação e detecção do ADN de Bursaphelenchus xylophilus extraído. 0 passo de amplificação e detecção de ADN de Bursaphelenchus xylophilus pode ser efectuado através da amplificação e detecção de uma região específica de ADNr de Bursaphelenchus xylophilus, por um método de LAMP utilizando o primeiro conjunto de iniciadores LAMP ou o segundo conjunto de iniciadores LAMP. 4
Ainda adicionalmente, a presente invenção proporciona um método para detecção de ADN de Bursaphelenchus xylophilus, caracterizado por incluir um passo de amplificação e detecção de uma região especifica de ADNr de Bursaphelenchus xylophilus, por um método de LAMP utilizando o primeiro conjunto de iniciadores LAMP ou o segundo conjunto de iniciadores LAMP.
VANTAGENS DA INVENÇÃO
De acordo com a presente invenção, uma vez que o ADN de Bursaphelenchus xylophilus é extraído a partir de um pedaço de madeira enquanto o Bursaphelenchus xylophilus ainda está no pedaço de madeira, o ADN de Bursaphelenchus xylophilus pode ser extraido sem o isolamento de Bursaphelenchus xylophilus a partir do pedaço de madeira. Como resultado, pode ser realizada a detecção de Bursaphelenchus xylophilus utilizando ADN.
Além disso, de acordo com a presente invenção, a detecção pode ser efectuada através da amplificação de uma região específica de ADNr de Bursaphelenchus xylophilus por um método de LAMP. Consequentemente, a amplificação génica e detecção de Bursaphelenchus xylophilus podem ser efectuadas de um modo mais preciso e fácil e a um custo inferior.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇAO
No método de detecção de Bursaphelenchus xylophilus de acordo com a presente forma de realização, por exemplo, mergulhando um pedaço de madeira retirado de uma árvore pertencendo ao género pinus numa solução incluindo uma enzima 5 que degrada a queratina e extraindo o ADN de Bursaphelenchus xylophilus presente no pedaço de madeira, o ADN é extraído sem isolamento do Bursaphelenchus xylophilus a partir do pedaço de madeira. Em seguida, a detecção de Bursaphelenchus xylophilus a partir do pedaço de madeira recolhido é efectuada através da amplificação e detecção de ADN de Bursaphelenchus xylophilus pelo método de LAMP, que é um método de amplificação génica, utilizando um conjunto de iniciadores para o método de LAMP que inclui um iniciador que pode emparelhar especificamente com uma região específica de ADNr de Bursaphelenchus xylophilus.
Deste modo, convencionalmente, a identificação de Bursaphelenchus xylophilus foi efectuada através do isolamento de Bursaphelenchus xylophilus a partir de um pedaço de madeira pelo método de Baermann e, depois, da realização de uma observação morfológica utilizando um microscópio. Em contraste, a presente requerente foi a primeira a conceber a realização da detecção de Bursaphelenchus xylophilus utilizando detecção de ADN.
Contudo se um método de extracção de ADN convencional for aplicado a um pedaço de madeira no qual Bursaphelenchus xylophilus está presente, é difícil extrair eficientemente o ADN de Bursaphelenchus xylophilus a partir do pedaço de madeira e a extracção demora muito tempo. Por outro lado, embora o ADN pudesse ser extraído e purificado através do trituramento do pedaço de madeira no qual Bursaphelenchus xylophilus estivesse presente, um tal método iria requerer equipamento especializado, tal como um triturador para o trituramento do pedaço de madeira. Por conseguinte, em situações onde falte tal equipamento especializado, é difícil aplicar este método. Por outras palavras, em situações onde falte tal equipamento especializado, 6 o Bursaphelenchus xylophilus tem de ser isolado a partir do pedaço de madeira para extrair o ADN, de modo que seja requerida em torno da mesma quantidade de esforço e tempo como para o método de Baermann. Além disso, mesmo se o método anteriormente descrito pudesse ser aplicado, a solução de extracção inclui uma grande quantidade de componentes derivados do pedaço de madeira, tal como lenhina. Por conseguinte, com o fim de utilizar amplificação de ADN para detecção, o ADN extraído deve ser suficientemente purificado.
Consequentemente, a presente requerente centrou-se na queratina, que é um dos principais componentes da superfície corporal de Bursaphelenchus xylophilus. Como resultado de investigação diligente, a presente requerente verificou que ao permitir que uma enzima que degrada a queratina actue sobre um pedaço de madeira incluindo Bursaphelenchus xylophilus e dissolva a superfície corporal de Bursaphelenchus xylophilus, o ADN de Bursaphelenchus xylophilus na solução resultante poderia ser extraído completando, desse modo, a presente invenção. Mais especificamente, de acordo com a presente invenção, o ADN de Bursaphelenchus xylophilus pode ser extraído num curto período de tempo, mesmo se processos, tal como triturando o pedaço de madeira recolhido, sejam omitidos ou simplificados. Além disso, uma vez que há poucos componentes derivados do pedaço de madeira que passam para o tampão de extracção de ADN, o passo de purificação de ADN também pode ser omitida ou simplificada.
Além disso, como um novo método de amplificação génica, o método de LAMP (Amplificação Isotérmica Mediada por Loop) desenvolvido pela Eiken Chemical Co., Ltd., (Tochigi) é conhecido. 0 método de LAMP tem uma elevada especificidade e eficiência de amplificação e permite a determinação visual de 7 amplificação pela adição de um pigmento fluorescente ao sistema de reacção. Consequentemente, o método de LAMP possibilita a amplificação génica e detecção num curto período de tempo. Além disso, uma vez que o método de LAMP é um método de amplificação de ácido nucleico isotérmico, não é necessário um dispositivo de controlo de temperatura especial. Além do mais, a ADN polimerase de deslocamento de cadeia utilizada no método de LAMP não necessita de ter resistência ao calor, ao contrário do método de PCR. Consequentemente, comparada com o método de PCR, a reacção pode ser efectuada a um custo inferior. Por conseguinte, se o método de LAMP pode ser utilizado para realizar a detecção com base nos genes de Bursaphelenchus xylophilus, a amplificação e detecção génica de Bursaphelenchus xylophilus podem ser efectuadas mais facilmente e a um custo inferior. Como resultado de investigação diligente, a presente requerente descobriu um conjunto de iniciadores (iniciador LAMP) para o método de LAMP que podem ser especificamente emparelhados com uma região específica de ADNr de Bursaphelenchus xylophilus e que são representados pelas sequências ID N° 1 a 4 na listagem de sequências possibilitando, desse modo, a detecção baseada nos genes de Bursaphelenchus xylophilus utilizando o método de LAMP. Aleém disso, através da utilização de um iniciador Loop-F representado por sequência ID N° 5 na listagem de sequências, a amplificação e detecção podem ser efectuadas num período de tempo mais curto.
Uma forma de realização preferida de acordo com a presente invenção será, agora, descrita em maior detalhe.
Em primeiro lugar, a preparação de uma solução de extracção de ADN de Bursaphelenchus xylophilus, obtida pela extracção de ADN de Bursaphelenchus xylophilus a partir de um pedaço de 8 madeira (espécime de pinheiro) no qual Bursaphelenchus xylophilus está presente, será descrita em detalhe. Na presente forma de realização, um espécime de pinheiro recolhido é colocado numa solução (solução tampão, tampão de extracção de ADN) incluindo uma enzima (a seguir, "enzima queratinolítica") que degrada a queratina e incubado. Desse modo, o ADN do Bursaphelenchus xylophilus presente no espécime de pinheiro é extraído. A solução incluindo o ADN extraído é utilizada como uma solução de extracção de ADN. Como solução tampão, qualquer solução tampão que possa ser utilizada para extracção de ADN pode ser utilizada, desde que tenha uma enzima de actividade queratinolítica. Exemplos incluem uma solução tampão contendo NaCl, tris-HCl e EDTA. Neste case, o NaCl pode ser de 100 a 150 mM, o tris-HCl de 10 a 50 mM e o EDTA de 0,1 a 1 mM. A enzima queratinolítica de acordo com a presente forma de realização não está especialmente limitada. Por exemplo, pode ser utilizada a Proteinase K (E.C.3.4.21.64). A enzima queratinolítica dissolve células e faz com que o ADN no núcleo elua para dentro do tampão de extracção de ADN através da degradação da queratina, que é um dos principais componentes da superfície corporal do Bursaphelenchus xylophilus no espécime de pinheiro. Consequentemente, o ADN de Bursaphelenchus xylophilus pode ser extraído directamente a partir do espécime de pinheiro, sem isolamento do Bursaphelenchus xylophilus a partir do pedaço de madeira. Embora o teor de enzima queratinolítica no tampão de extracção de ADN não estar especialmente limitado, o teor pode ser estabelecido de modo que, por exemplo, cerca de 7,5 U/pL de enzima queratinolítica sejam incluídas no tampão de extracção. Aquando da preparação da solução de extracção de ADN, também pode ser utilizado um kit de extracção de ADN incluindo a enzima queratinolítica pela adição da mesma ao tampão de extracção de 9 ADN. Um exemplo de um kit de extracçao de ADN que pode ser utilizado é o "ISOHAIR" (Nippon Gene Co., Ltd.). 0 tamanho do pedaço de madeira submetido à extracção anteriormente descrita de ADN de Bursaphelenchus xylophilus e o método de recolha não limitam a presente invenção e podem ser fixos arbitrariamente. Além disso, o tipo de árvore a partir do qual o pedaço de madeira é recolhido não está especialmente limitado. Exemplos destes incluem árvores do género pinus, tais como o pinheiro preto Japonês, o pinheiro vermelho Japonês, o pinheiro da ilha de Ryukyu, o pinheiro Coreano, o pinheiro branco Japonês, o pinheiro Escocês, o pinheiro preto Europeu, o pinheiro marítimo, o pinheiro mugo, o pinheiro de Monterey, o pinheiro ponderosa, o pinheiro branco ocidental, o pinheiro preto de Taiwan, o pinheiro preto Chinês, o pinheiro branco Himalaico, o pinheiro slash, o pinheiro rígido, o pinheiro lodgepole, o pinheiro branco oriental, o pinheiro de incenso, o pinheiro de folha comprida, o pinheiro cinzento, o pinheiro de Table Mountain, o pinheiro prateado e o pinheiro vermelho de Taiwan. Além disso, a solução de extracção de ADN anteriormente descrita também pode ser submetida a processamento de purificação de ADN conhecido e, depois, amplificação pelo método de LAMP abaixo descrito. Além disso, o método para extracção de ADN utilizando uma enzima queratinolítica não está limitado apenas a Bursaphelenchus xylophilus presente no pedaço de madeira. Obviamente, o ADN também pode ser extraído fazendo com que uma enzima actue no próprio Bursaphelenchus xylophilus.
Em seguida, a concepção do iniciador LAMP de acordo com a presente invenção será descrita em detalhe. Na presente forma de realização, um iniciador de método de LAMP específico para Bursaphelenchus xylophilus foi concebido utilizando um software 10 de suporte de concepção de iniciador, com base numa sequência de bases determinada de uma região ITS (espaçador transcrito interno) do ADNr base de Bursaphelenchus xylophilus. Mais especificamente, em primeiro lugar, uma região ITS de ADNr de Bursaphelenchus xylophilus e aquela de Bursaphelenchus mucronatus (a espécie mais estreitamente relacionada com Bursaphelenchus xylophilus) foram amplificadas pelo método de PCR e as sequências de bases daquelas regiões foram determinadas utilizando um sequenciador de ADN ABI3100 (Applied Biosystems). A informação de sequência de bases para ambas as espécies foi analisada utilizando um software de suporte de concepção de iniciador LAMP (Primer Explorer V4), proporcionado num sitio de Internet da Eiken Chemical Co., Ltd. 0 iniciador LAMP foi concebido de modo que apenas o ADN de Bursaphelenchus xylophilus fosse amplificado. 0 iniciador LAMP de acordo com a presente forma de realização é concebido como se segue. São definidas três regiões, F3c, F2c e Flc do lado terminal 3' para um gene alvo na região ITS de ADNr. Igualmente, são definidas as regiões, Bl, B2 e B3 na direcção do lado terminal 5' para o gene alvo. Para estas seis regiões são concebidos quatro tipos de iniciadores, F3, B3, FIP e BIP. Aqui, as regiões complementares para as respectivas regiões F3c, F2c e Flc são F3, F2 e Fl, respectivamente, e as regiões complementares para as respectivas regiões Bl, B2 e B3 são Blc, B2c e B3c, respectivamente.
Especificamente, o iniciador F3 representado por sequência ID N° 1 é concebido de modo que tenha a região F3, que é a sequência complementar à região F3c. 11
Além disso, o iniciador B3 representado por sequência ID N° 2 é concebido de modo que tenha a região B3, que é a sequência complementar à região B3c.
Além disso, o iniciador FIP representado por sequência ID N° 3 é concebido de modo que tenha a região F2, que é a sequência complementar à região F2c definida na região ITS de ADNr, no lado terminal 3' e a mesma sequência que a região Flc no lado terminal 5'.
Ainda além disso, o iniciador BIP representado por sequência ID N° 4 é concebido de modo que tenha a região B2, que é a sequência complementar à região B2c, no lado terminal 3' e a mesma sequência que a região Ele no lado terminal 5'.
Além disso, a presente forma de realização inclui um iniciador Loop-F representado por sequência ID N° 5. Isto possibilita que o número de origens de síntese de ADN durante a operação de amplificação seja aumentada e a reacção de amplificação seja acelerada que, por sua vez, permite que a amplificação e detecção de ADN de Bursaphelenchus xylophilus sejam efectuadas num período de tempo mais curto. 0 iniciador Loop-F representado por sequência ID N° 5 é concebido de modo que tenha a sequência complementar à região entre a região F1 e a região F2.
Em seguida, será descrita a operação de amplificação efectuada pelo método de LAMP, utilizando o conjunto de iniciadores anteriormente descrito em ADN extraído. A operação de amplificação efectuada pelo método de LAMP pode ser realizada como se segue, por exemplo. Em primeiro 12 lugar, os reagentes (por exemplo, Bst ADN polimerase, um tampão de reacção (mistura de reacção), o conjunto de iniciadores e água destilada) são misturados para preparar uma solução de reacção de amplificação. Aqui, o reagente de detecção de fluorescência descrito abaixo também pode ser misturado nesta solução de reacção de amplificação.
Por exemplo, o kit de reagente de amplificação de ADN Loopamp (marca registada; a seguir o mesmo), comercializado pela Eiken Chemical Co., Ltd, pode ser utilizado como os reagentes de reacção, excluindo o conjunto de iniciadores. 0 kit de reagente de amplificação de ADN Loopamp inclui os seguintes componentes. Tampão de reacção 2x (mistura de reacção 2x) : Tris-HCl a 40 mM (pH 8,8), KC1 a 20 mM, MgSCp a 16 mM, (NIHU^SCN a 20 mM, Tween 20 a 0,2%, betaina a 1,6 M, respectivas concentrações finais de 2,8 mM em dATP, dCTP, dGTP e dTTP; 8 unidades/pL de Bst ADN polimerase. Além disso, por exemplo, o reagente de detecção de fluorescência Loopamp, comercializado pela Eiken Chemical Co., Ltd, pode ser utilizado como o reagente de detecção de fluorescência descrito abaixo.
Em seguida, a solução de extracção de ADN de Bursaphelenchus xylophilus descrita acima é adicionada a esta solução de reacção de amplificação e a mistura resultante é incubada a 63 °C, por exemplo. A reacção do método de LAMP é efectuada com base em passos, tais como os seguintes. (1) 0 iniciador FIP, com sequência ID N° 3, emparelha com o ADN molde. (2) Uma cadeia de ADN, que é complementar ao ADN molde, é sintetizada partindo da extremidade 3 ' da região F2 do iniciador FIP pela actividade da Bst ADN polimerase. (3) 0 iniciador F3, com sequência ID N° 1, 13 emparelha com a parte exterior do iniciador FIP e, partindo da extremidade 3', a síntese de ADN é prolongada enquanto a cadeia de ADN é libertada do iniciador FIP já sintetizado pela actividade da Bst ADN polimerase. (4) A cadeia de ADN sintetizada a partir do iniciador F3 e o ADN molde formam uma cadeia dupla. (5) Por outro lado, a cadeia de ADN do iniciador FIP, a partir da qual a cadeia de ADN do iniciador F3 foi libertada, forma ADN de cadeia simples. Esta cadeia de ADN tem as regiões Flc e Fl, que são complementares entre si, no lado terminal 5' e, deste modo, auto-emparelham-se de modo a formar um loop. (6) 0 iniciador BIP, com sequência ID N° 4, emparelha com a cadeia de ADN que se formou num loop no passo anterior (5). Partindo da extremidade 3' deste iniciador BIP, é sintetizado ADN complementar. 0 loop formado no passo (5) é libertado e prolonga-se. Além disso, o iniciador B3, com sequência ID N° 2, emparelha com a parte exterior do iniciador BIP. Partindo da extremidade 3' do iniciador B3, a síntese de ADN é prolongada enquanto a cadeia de ADN é libertada do iniciador BIP já sintetizado pela actividade da Bst ADN polimerase. (7) É formado ADN de cadeia dupla pelo passo anteriormente descrito (6) acima. (8) Por outro lado, uma vez
que a cadeia de ADN sintetizada a partir do iniciador BIP
libertada no passo (6) tem sequências complementares em ambos os terminais, a mesma auto-emparelha-se num loop e forma uma estrutura com forma de altere. (9) Partindo da cadeia de ADN tendo uma estrutura com forma de altere formada no passo (8), o iniciador FIP e o subsequente iniciador BIP emparelham-se e o ciclo de amplificação de ADN prossegue. 0 tempo de incubação para a operação de amplificação pode ser de 60 minutos, por exemplo. Durante este tempo de incubação, o ADN pode ser amplificado em 109 a IO10 vezes pela reacção de 14 emparelhamento e a sintese de cadeia de ADN realizada no método de LAMP.
Em seguida, na presente forma de realização, é confirmado se o ADN de Bursaphelenchus xylophilus está incluido na solução de reacção que sofreu a operação de amplificação. Mais especificamente, se o Bursaphelenchus xylophilus estiver presente no espécime de pinheiro submetido a detecção, o ADN de Bursaphelenchus xylophilus irá ser amplificado pela operação de amplificação e detectado. Por outro lado, se o Bursaphelenchus xylophilus não estiver no espécime de pinheiro submetido a detecção, o ADN de Bursaphelenchus xylophilus não irá ser amplificado pela operação de amplificação e, deste modo, não será detectado.
Se o ADN amplificado estiver incluido na solução de reacção pode ser confirmado por detecção de fluorescência, por exemplo. Na detecção de fluorescência, é adicionado um reagente de detecção de fluorescência de modo a efectuar a reacção e a cor da solução de reacção é confirmada visualmente. Mais especificamente, se a solução de reacção emitir fluorescência, pode ser realizada uma determinação positiva, nomeadamente, que o ADN de Bursaphelenchus xylophilus é amplificado, ao passo que se a solução de reacção não emitir fluorescência, pode ser realizada uma determinação negativa, nomeadamente, que o ADN de Bursaphelenchus xylophilus não é amplificado. A diferença entre positivo e negativo para fluorescência de solução de reacção pode ser mais claramente determinada, através da utilização de um aparelho de irradiação UV.
Embora a presente forma de realização fosse descrita acima, a presente invenção não está limitada à descrição acima. A 15 presente invenção pode ser aplicada em outras formas de realização. Por exemplo, o método de amplificação e detecção de ADN efectuado no método de LAMP não está limitado a detecção de fluorescência e pode ser arbitrariamente alterado. Especif icamente, uma vez que a solução de reacção de amplificação é turva, em virtude dos efeitos do pirofosfato de magnésio produzido como um subproduto de amplificação, a amplificação de ADN de Bursaphelenchus xylophilus também pode ser detectada, nesta fase, através da medição da turbidez da solução de reacção de amplificação. Além disso, a amplificação de ADN de Bursaphelenchus xylophilus também pode ser detectada utilizando diversos métodos de amplificação de ácido nucleico que são conhecidos com respeito a amplificação génica, tal como PCR (reacção de polimerização em cadeia).
Além disso, o método para amplificação e detecção de ADN pelo método de LAMP utilizando o iniciador LAMP de acordo com a presente invenção não está limitado a casos nos quais o ADN de Bursaphelenchus xylophilus é directamente extraído de um pedaço de madeira. Este método também pode ser aplicado em casos nos quais o Bursaphelenchus xylophilus é isolado de um pedaço de madeira por um método, tal como o método de Baermann e o ADN é, depois, extraído.
Exemplos A presente invenção será, agora, descrita em maior detalhe, com base nos exemplos seguintes. Contudo, estes exemplos não limitam, de modo algum, a presente invenção. 16 (Exemplo 1)
Os espécimes de pinheiro utilizados no presente exemplo foram recolhidos de 10 pinheiros pretos Japoneses, nas instalações principais de investigação do Forestry and Forest Products Research Institute. Cinco daquelas árvores eram pinheiros pretos Japoneses (pinheiros pretos Japoneses mortos por inoculação artificial de Bursaphelenchus xylophilus) infectados com Bursaphelenchus xylophilus. As restantes 5 árvores eram pinheiros pretos Japoneses (pinheiros pretos Japoneses que foram abatidos num estado saudável e, depois, isolados numa área com rede, de modo a prevenir infecção por Bursaphelenchus xylophilus) que não estavam infectados com Bursaphelenchus xylophilus.
Foi extraído ADN de Bursaphelenchus xylophilus dos espécimes de pinheiro recolhidos e foi preparada uma solução de extracção de ADN de Bursaphelenchus xylophilus. Especificamente, 1 mL de um tampao de extracçao de ADN (NaCl a 100 mM, tris-HCl a 10 mM (pH O 00 EDTA a 1 mM) foi colocado num microtubo de 1,5 mL. Em seguida, 40 pL de um kit de extracção de ADN (ISOHAIR, Nippon Gene Co . , Ltd.), que incluía a enzima queratinolítica Proteinase K, num tampão de Lise e 50 pL de uma solução enzimática foram adicionados ao tampão de extracção de ADN no microtubo e a mistura resultante foi exaustivamente agitada. Em seguida, cerca de 0,06 g do espécime de pinheiro recolhido foram colocados na solução no microtubo e incubados, durante 20 minutos, a 55 °C e, depois, durante 10 minutos, a 94 °C.
Em seguida, utilizando o conjunto de iniciadores de acordo com a presente invenção e a solução de extracção de ADN descrita 17 acima, as operações de amplificação e detecção foram efectuadas pelo método de LAMP. Especificamente, em primeiro lugar, o conjunto de iniciadores de acordo com a presente invenção, os respectivos reagentes do kit de reagentes de amplificação de ADN Loopamp (Eiken Chemical Co. , Ltd.) e o reagente de detecção de fluorescência Loopamp (Eiken Chemical Co., Ltd.) foram dispensados para dentro de um microtubo de 0,2 mL nas quantidades abaixo, para produzir uma solução de reacção. Os conjuntos de iniciadores foram obtidos pelo método seguinte. Uma região ITS de ADNr de Bursaphelenchus xylophilus e aquela de Bursaphelenchus mucronatus foram amplificadas pelo método de PCR. A sequência de bases daquelas regiões foi determinada utilizando um sequenciador de ADN ABI3100 (Applied Biosystems). Depois, a informação de sequência de bases para ambas as espécies foi analisada utilizando o software de suporte de concepção de iniciador LAMP (Primer Explorer V4), proporcionado num sítio de Internet da Eiken Chemical Co., Ltd. O iniciador LAMP foi obtido, concebendo-o de modo que apenas o ADN de
Bursaphelenchus xylophilus fosse amplificado.
Mistura de Reacção 2x: 12,5 pL
Iniciador FIP (sequência ID N° 1): 1,0 pL (40 pmol/pL)
Iniciador BIP (sequência ID N° 2): 1,0 pL (40 pmol/pL)
Iniciador F3 (sequência ID N° 3): 1,0 pL (5 pmol/pL)
Iniciador B3 (sequência ID N° 4): 1,0 pL (5 pmol/pL)
Iniciador Loop-F (sequência ID N° 5): 1,0 pL (20 pmol/pL)
Bst ADN Polimerase: 1,0 pL
Reagente de Detecção de Fluorescência: 1,0 pL Água Destilada: 3,5 pL Total: 23,0 pL 18
Em seguida, 2 μι da solução de extracção de ADN descrita acima foram adicionados à solução de reacção de amplificação. A mistura resultante foi exaustivamente agitada e, depois, deixada, durante 1 hora, a 63 °C.
Após 1 hora, foi visualmente confirmado se a solução de reacção de amplificação emitia fluorescência verde. Os resultados são mostrados na Tabela 1. Os casos determinados como sendo positivos, nos quais a fluorescência verde era emitida, são marcados com um circulo (o) e os casos determinados como sendo negativos, nos quais a fluorescência verde não era emitida, são marcados com uma cruz (x).
[Tabela 1]
Resultados de detecção de Bursaphelenchus xylophilus baseados no método de LAMP, utilizando espécimes retirados de pinheiros pretos Japoneses que tinham morrido em virtude de infecção por Bursaphelenchus xylophilus (infecção por nemátodo) e pinheiros pretos Japoneses mortos por abate artificial (não infecção por nemátodo).
Estado de Repetição Árvore Morta 1 2 3 4 5 Infecção por Nemátodo o o o o o Não Infecção por Nemátodo X X X X X 19
Além disso, a detecção também foi efectuada utilizando o método de Baermann para espécimes de pinheiro recolhidos das mesmas árvores como cada um dos exemplos. Foram obtidos os mesmos resultados de detecção que aqueles ilustrados na Tabela 1 acima. Consequentemente, a eficácia do método de detecção da presente forma de realização de acordo com a presente invenção foi demonstrada. (Exemplos 2 e 3)
Em seguida, como nos Exemplos 2 e 3 da presente invenção, foi investigada a eficácia de detecção de Bursaphelenchus xylophilus utilizando amplificação de ADN baseada no método de LAMP e no método de PCR.
Em primeiro lugar, foi recolhido um espécime a partir de uma árvore morta crescendo numa instalação do Forestry and Forest Products Research Institute. 0 Bursaphelenchus xylophilus foi isolado através da aplicação do método de Baermann em 8 g do pedaço de madeira recolhido. Em seguida, foi calculada a concentração de nemátodo (número de Bursaphelenchus xylophilus por 1 g) no espécime recolhido.
Além disso, foram preparadas 8 amostras para extracção de ADN de cerca de 0,06 g a partir do espécime restante e utilizadas para extracção de ADN. Especif icamente, 1 mL de um tampão de extracção de ADN (NaCl a 100 mM, tris-HCl a 10 mM (pH 8,0), EDTA a 1 mM) foi colocado num microtubo de 1,5 mL. Em seguida, 40 pL de um kit de extracção de ADN (ISOHAIR, Nippon Gene Co., Ltd.), que incluía a enzima queratinolítica Proteinase K, num tampão de Lise e 50 pL de uma solução enzimática foram 20 adicionados ao tampão de extracção de ADN no microtubo e a mistura resultante foi exaustivamente agitada. Em seguida, cerca de 0,06 g de cada amostra para extracção de ADN foram colocados na solução no microtubo e incubados, durante 20 minutos, a 55 °C e, depois, durante 10 minutos, a 94 °C.
Utilizando estas 8 soluções de extracção de ADN, a detecção foi efectuada através da amplificação de ADN de Bursaphelenchus xylophilus pelo método de LAMP e do método de PCR. O método e condições para a detecção efectuada utilizando o método de LAMP são os mesmos como descrito acima no Exemplo 1 e, deste modo, uma sua descrição é omitida. A detecção efectuada utilizando o método de PCR para o Exemplo 3 foi realizada como se segue. Primeiro, GoTaq (Green Master Mix (Promega 25 KK) ) e um conjunto de iniciadores para amplificação de uma região ITS de ADNr de Bursaphelenchus xylophilus pelo método de PCR foram dispensados para dentro de um microtubo de 0,2 mL, de modo a produzir uma solução de reacção. As sequências de iniciadores formando o conjunto de iniciadores eram representadas pelas sequências ID N° 6 e 7.
GoTaq Green Master Mix: 10,0 pL BX18S1’ (sequência ID N° 6) : 2,5 pL (2 pmol/pL) BX28S1’ (sequência ID N° 7) : 2,5 pL (2 pmol/pL)
Água Destilada: 3,0 pL Total: 18,0 pL 11 Aikawa, T., Kikuchi, T. e Kosaka, H. (2003) Demonstration of interbreeding between virulent and avirulent populations of Bursaphelenchus xylophilus (Nematoda: Aphelenchoididae) by PCR-RFLP method. Appl. Entomol. zool. 38: 565-569. 21 A esta solução de reacção foram adicionados 2 nL da solução de extracção de ADN descrita acima. 0 ADN de Bursaphelenchus xylophilus foi, depois, amplificado por uma reacção de PCR utilizando um termociclador iCycler (Bio-Rad Laboratories KK) . As condições de PCR foram estabelecidas como se segue. Em primeiro lugar, foram efectuados 35 ciclos a 94 °C/1 min. - 53 °C/1 min. - 72 °C/1 min. e a ciclização foi finalizada, durante 2 minutos, a 72 °C.
As 8 soluções de reacção de amplificação foram injectadas dentro de um gel de agarose, submetidas a electroforese e, depois, coradas com brometo de etidio. Se o ADN era ou não detectado foi determinado através da confirmação da presença de amplificação de ADN por irradiação UV.
Os resultados do pedido dos Exemplos 2 e 3 são mostrados abaixo. Em primeiro lugar, como resultado do isolamento de nemátodo pelo método de Baermann, o espécime submetido a detecção de acordo com a presente forma de realização foi confirmado como tendo cerca de 17 Bursaphelenchus xylophilus ai vivendo por 1 g.
Os resultados de detecção utilizando o método de LAMP e o método de PCR são mostrados na Tabela 2. 22 [Tabela 2] Método de amplificação de ADN Número de Amostra Número de Sucessos Detectados (número de sucessos de amplificação) Número de Insucessos Detectados (número de insucessos de amplificação) Razão de Sucesso de Detecção (%) (razão de sucesso de amplificação) Método de LAMP (Exemplo 2) 8 8 0 100 Método de PCR (Exemplo 3) 8 1 7 13
Como mostrado na Tabela 2, em todas as 8 amostras utilizadas no Exemplo 2, o ADN de Bursaphelenchus xylophilus foi amplificado e detectado. Os resultados dos Exemplos 2 e 3 mostram que no método de detecção de Bursaphelenchus xylophilus de acordo com a presente invenção, no qual o ADN é extraído fazendo com que uma enzima queratinolitica actue num pedaço de madeira e o ADN extraído seja amplificado e detectado, são preferidas a amplificação e detecção de uma região específica do ADNr de Bursaphelenchus xylophilus pelo método de LAMP, utilizando o conjunto de iniciadores LAMP descrito acima.
Além disso, a partir dos resultados dos Exemplos 2 e 3 é nítido que, quando o conjunto de iniciadores LAMP descrito acima é utilizado na amplificação de ADN de Bursaphelenchus xylophilus extraído, fazendo com que uma enzima que degrada a queratina actue num pedaço de madeira que inclui Bursaphelenchus xylophilus, é exibida uma taxa de sucesso de amplificação muito superior do que para outros iniciadores utilizados no método de PCR. 23
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Forestry and Forest Products Research Institute <120> Método de extracção de adn para bursaphelenchus xylophilus a partir de aparas de madeira, conjunto de iniciadores lamp para bursaphelenchus xylophilus e método de detecção para bursaphelenchus xylophilus a partir de aparas de madeira <130> NR080101 <16 0> 7 <170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 18
<212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> Inventores: Aikawa, takuya; Kikuchi, taisei;
Kanzaki, natsumi <220> <223> Bursaphelenchus xylophilus (iniciador F3) <400> 1 gcagaaacgc cgacttgt 18 24 <210> 2 <211> 19 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> Bursaphelenchus xylophilus (iniciador B3) <400> 2 tcatccgaac gtccctgac 19 <210> 3 <211> 41 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> Bursaphelenchus xylophilus (iniciador FIP) <400> 3 cgcggaacaa accgcgtaaa accgttgtga cagtcgtctc g 41 <210> 4 <211> 41 <212> ADN <213> sequência artificial 25 <220> <223> Bursaphelenchus xylophilus (iniciador BIP) <400> 4 agagggcttc gtgctcgatt ggccgttgaa acaacatcac c 41
<210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Bursaphelenchus xylophilus (iniciador LoopF) <400> 5 agatggtgcc taacattgcg 20
<210> 6 <211> 20 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> Bursaphelenchus xylophilus (iniciador PCR, Bxl8S) <400> 6 aaactaggga tcgctggagt 20 26
<210> 7 <211> 20 <212> ADN <213> sequência artificial <220> <223> Bursaphelenchus xylophilus (iniciador PCR, Bx28S) <400> 7 ttcagcaggt agtcataccc 20
Lisboa, 27 de Junho de 2011 27

Claims (1)

  1. REIVINDICAÇÕES Método para detecção de Bursaphelenchus xylophilus, que compreende um passo de extracção de ADN de Bursaphelenchus xylophilus e um passo de amplificação e detecção do ADN extraído do Bursaphelenchus xylophilus, caracterizado por: - o passo de extracção ser efectuado mergulhando um pedaço de madeira incluindo Bursaphelenchus xylophilus numa solução compreendendo uma solução de extracção de ADN e um enzima que decompõe a queratina, sem triturar o pedaço de madeira mergulhado na solução; o passo de amplificação e detecção de ADN do Bursaphelenchus xylophilus ser efectuado por amplificação e detecção de uma região específica do ADNr do Bursaphelenchus xylophilus por um método LAMP, utilizando um conjunto de iniciadores LAMP compreendendo os iniciadores F3, B3, FIP e BIP para as respectivas sequências de bases, que são representados pelas SEQ ID Nos 1 a 4 numa listagem de sequências ou compreendendo os iniciadores F3, B3, FIP e BIP para as respectivas sequências de bases, que são representados pelas SEQ ID Nos 1 a 4 e, adicionalmente, um iniciador de sequência de bases Loop-F representado por SEQ ID No 5 numa listagem de sequências. Lisboa, 31 de Agosto de 2011
PT2008069185A 2008-05-07 2008-10-23 Método de extracção de adn para bursaphelenchus xylophilus a partir de aparas de madeira, conjunto de iniciadores lamp para bursaphelenchus xylophilus e método de detecção para bursaphelenchus xylophilus a partir de aparas de madeira PT2009136456W (pt)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2008121316A JP5540277B2 (ja) 2008-05-07 2008-05-07 木片からのマツノザイセンチュウのｄｎａ抽出方法、マツノザイセンチュウのｌａｍｐプライマーセット、および木片からのマツノザイセンチュウの検出方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PT2009136456W true PT2009136456W (pt) 2011-09-07

Family

ID=41264513

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PT2008069185A PT2009136456W (pt) 2008-05-07 2008-10-23 Método de extracção de adn para bursaphelenchus xylophilus a partir de aparas de madeira, conjunto de iniciadores lamp para bursaphelenchus xylophilus e método de detecção para bursaphelenchus xylophilus a partir de aparas de madeira

Country Status (8)

Country Link
US (1) US8318435B2 (pt)
JP (1) JP5540277B2 (pt)
KR (1) KR101572143B1 (pt)
CN (1) CN102016030B (pt)
CA (1) CA2722148C (pt)
PT (1) PT2009136456W (pt)
TW (1) TWI425093B (pt)
WO (1) WO2009136456A1 (pt)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107022615A (zh) * 2017-04-22 2017-08-08 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 用于检测松材线虫的lamp引物组、试剂盒及检测方法

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101832889B (zh) * 2010-04-30 2011-11-23 王进福 松材线虫快速分离技术的薄片洗涤法
CN102154476B (zh) * 2011-01-31 2014-06-25 中国农业科学院植物保护研究所 一种香蕉穿孔线虫特异性lamp检测方法及其应用
CN102260746B (zh) * 2011-08-10 2013-02-27 中国农业大学 基于环介导等温扩增检测甘薯腐烂茎线虫的试剂盒及其应用
CN102586461B (zh) * 2012-03-16 2013-04-24 中国农业科学院植物保护研究所 一种北方根结线虫lamp快速检测方法及应用
CN103173530A (zh) * 2012-06-13 2013-06-26 中国检验检疫科学研究院 松材线虫lamp特异性检测方法
CN103555840B (zh) * 2013-11-04 2015-09-09 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 检测松材线虫的方法、检测引物及其lamp检测试剂盒
CN103911433B (zh) * 2014-03-06 2015-08-19 广东省农业科学院动物卫生研究所 嗜水气单胞菌的lamp检测引物组及试剂盒
CN103924001B (zh) * 2014-04-30 2016-04-13 南京农业大学 一种用于山茶根结线虫lamp 快速检测的引物组合物及其应用
CN105349687A (zh) * 2015-12-15 2016-02-24 林康艺 一种快速检测桑尼短体线虫的环等温扩增引物及其应用
WO2017155276A1 (ko) * 2016-03-11 2017-09-14 엘지전자 주식회사 V2x 통신에서의 참조신호 송신 방법 및 이를 위한 장치
CN107502662B (zh) * 2017-09-04 2021-07-09 华南农业大学 一种快速检测鉴定水稻潜根线虫的lamp引物和方法
KR101986676B1 (ko) * 2017-12-20 2019-06-07 주식회사 이콘비즈 소나무재선충병 감염여부 판별방법
KR102148153B1 (ko) 2019-04-25 2020-08-26 대한민국 소나무재선충 감염목 조기 진단 유전자 및 이를 이용한 진단 키트, 진단방법
KR102239392B1 (ko) * 2020-03-19 2021-04-12 대한민국 소나무재선충 신속 검출용 재조합효소-중합효소 증폭 프라이머 프로브 세트
KR102368219B1 (ko) 2020-07-21 2022-03-02 박성준 소나무 재선충dna 기반 진단검사장치
CN112322751A (zh) * 2020-11-19 2021-02-05 南京耐德高科技有限公司 松材线虫核酸快速检测荧光比色二合一试剂盒及检测方法
CN113957153A (zh) * 2021-07-07 2022-01-21 重庆市渝东南农业科学院 一种新型松材线虫检测方法
KR102310223B1 (ko) * 2021-07-21 2021-10-08 주식회사 에이아이더뉴트리진 랩온페이퍼칩을 포함하는 구조물에 적용하기 위한 세포용해용 조성물

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100485045C (zh) * 2004-12-14 2009-05-06 中国科学院微生物研究所 一种检测松材线虫的方法、试剂盒及其专用引物和探针
CN100487435C (zh) * 2005-12-22 2009-05-13 云南农业大学 一种松树萎蔫病病原线虫的检测方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107022615A (zh) * 2017-04-22 2017-08-08 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 用于检测松材线虫的lamp引物组、试剂盒及检测方法
CN107022615B (zh) * 2017-04-22 2021-07-09 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 用于检测松材线虫的lamp引物组、试剂盒及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2722148A1 (en) 2009-11-12
US8318435B2 (en) 2012-11-27
JP2009268404A (ja) 2009-11-19
WO2009136456A1 (ja) 2009-11-12
US20110159503A1 (en) 2011-06-30
CA2722148C (en) 2016-02-16
CN102016030B (zh) 2012-08-22
KR20110003397A (ko) 2011-01-11
JP5540277B2 (ja) 2014-07-02
TWI425093B (zh) 2014-02-01
KR101572143B1 (ko) 2015-11-26
CN102016030A (zh) 2011-04-13
TW200946681A (en) 2009-11-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PT2009136456W (pt) Método de extracção de adn para bursaphelenchus xylophilus a partir de aparas de madeira, conjunto de iniciadores lamp para bursaphelenchus xylophilus e método de detecção para bursaphelenchus xylophilus a partir de aparas de madeira
CN106399490B (zh) 检测植原体的lamp引物组及其试剂盒和应用
Christoforou et al. Rapid detection and quantification of viable potato cyst nematodes using qPCR in combination with propidium monoazide
CN105950774A (zh) 一种基于二代测序检测Rett综合症致病基因SNP位点的试剂盒及其检测方法
ES2301170T3 (es) Extraccion,amplificacion e hibridacion secuencial de adn micotico y metodos para detectar celulas micoticas en material clinico.
CN107217094A (zh) 一个与吉富罗非鱼生长速度相关的snp标记及其应用
KR101624026B1 (ko) 사과갈색무늬병균 검출을 위한 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이의 용도
Edwards et al. Discrimination of three Typhlodromalus species (Acari: Phytoseiidae) using random amplified polymorphic DNA markers
CN106086211A (zh) 检测荷花腐败病菌的lamp引物组、试剂盒及检测方法
CN104894125B (zh) 一种检测葡萄a病毒的rt‑lamp试剂盒及其专用引物
CN105683394A (zh) 评估果汁/果酒质量和/或安全性的方法
Sutrisno The impact of storage times of museum insect specimens on PCR success: case study on moth collections in Indonesia
KR20080043164A (ko) 알에이피디 표지인자를 이용한 배추 뿌리혹병 저항성유전자 판별방법
KR20160142618A (ko) 조직내 교잡법을 이용한 낭충봉아 부패병 바이러스 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법
RU2332463C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров для определения видовой принадлежности осетровых рыб и продукции из них
JP7486147B2 (ja) ホクベイコメクイゴミムシダマシ検出用オリゴヌクレオチド
ES2320838B1 (es) Metodo para la identificacion de variedades de pimiento.
KR20200002310A (ko) 체리 바이러스 3종의 진단을 위한 다중 진단용 프라이머 및 이의 용도
Tonka et al. Development of loop mediated isothermal amplification for rapid species detection of Armillaria ostoyae using assimilating probe.
El-Matbouli et al. Molecular diagnostic methods for detection of Thelohania contejeani (Microsporidia), the causative agent of porcelain disease in crayfish
JP7488519B2 (ja) Ｌａｍｐプライマーセット及びプライマー対
JP5656210B2 (ja) マイクロサテライトマーカーを用いるラッカセイ品種識別法
CN109161599B (zh) Pitx2基因用于筛选伊犁马泌乳性状试剂盒及其应用
Ciupa et al. Optimization method for biomolecular identification of muscle larva of Trichinella species.
JP2006345844A (ja) トマト萎凋性病害菌を間接的に識別できる分子マーカー