TWI425093B - Method for Extracting Bursaphelenchus xylophilus from Wood Tablets, LAMP Primer of Bursaphelenchus xylophilus and Method for Detecting Bursaphelenchus xylophilus from Wood - Google Patents

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Description

自木片萃取松材線蟲DNA之方法、松材線蟲之LAMP引子組及自木片檢出松材線蟲之方法
本發明係關於自含松材線蟲之木片萃取松材線蟲DNA之方法、由煉合(annealing)於松材線蟲DNA之特定區域之引子所成之LAMP引子組，自木片檢出松材線蟲之方法、及使用松材線蟲之基因增幅之檢出方法。
松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)係造成日本森林最大損害之松材線蟲病之病原體。松材線蟲是來自北美之侵入種，因為日本松樹對松材線蟲不具抵抗性，所以形成嚴重的損害，現在除了北海道及青森縣以外，蔓延於全部的都府縣。
松材線蟲病之診斷係必須自枯死的松樹木片檢出松材線蟲。一般而言，傳統上係藉由自木片分離松材線蟲，進行形態觀察而檢出，該松材線蟲之分離係使用柏門式漏斗分離法(Baermann funnel method)。柏門式漏斗分離法(參考例如非專利文獻1)係以面紙包住材片，將其浸漬於加滿水的漏斗中。材內若存在線蟲時，該線蟲沈澱於漏斗的底部。之後，以顯微鏡確認已沈澱之線蟲的形態，判定是否為松材線蟲。
然而，柏門式漏斗分離法係除了自木片分離線蟲需要莫大的時間之外，有關線蟲的形態之專業知識或顯微鏡等之高價機器不可缺少。因此，至今松材線蟲之檢出係僅於 可辨識線蟲之人材及機器完備之專業機構進行。換言之，傳統以來未存在可容易進行檢出松材線蟲之方法。
非專利文獻1：真宮靖治．二井一禎．小坂肇．神崎菜摘(2004)材線蟲.(線蟲學實驗法.日本線蟲學會編、日本線蟲學會、茨城).134-153.
發明之揭示
於食品或醫療領域等中，提出使用DNA增幅而檢出病原體之方法。然而，如後所述，因為松材線蟲存在於木本中，所以即使適用其他領域所進行之傳統方法，仍非可實用者之特殊情況。
本發明係有鑑於如此情況，以提供自含松材線蟲之木片容易萃取松材線蟲DNA之方法、松材線蟲之LAMP引子組、及使用基因增幅，可容易檢出松材線蟲之松材線蟲之檢出方法為目的。
亦即，本發明係自木片萃取松材線蟲DNA之方法，將含松材線蟲之木片浸漬於含分解角質之酵素之溶液中，萃取松材線蟲DNA為特徵。
另外，本發明係LAMP引子組，可煉合於松材線蟲之核糖體RNA基因(rDNA)內之特定區域之序列表序列識 別號1至4所示之各個鹽基序列F3、B3、FIP及BIP之引子所成為特徵(於本說明書中，稱該引子組為第1引子組)。在此，本發明之LAMP引子組亦可含序列表序列識別號5所示之鹽基序列Loop-F之引子(除了鹽基序列F3、B3、FIP及BIP之引子，更含Loop-F之引子之該引子組，於本說明書中稱為第2引子組)。此等引子組係可使用於使分解角質之酵素作用於含松材線蟲之木片，增幅已萃取之松材線蟲之DNA。
另外，本發明係松材線蟲之檢出方法，具備將含松材線蟲之木片浸漬於含分解角質之酵素之溶液中，萃取松材線蟲之DNA之步驟，及增幅已萃取之松材線蟲之DNA而檢出之步驟為特徵。在此，增幅松材線蟲之DNA而檢出之步驟係將松材線蟲之rDNA特定區域，使用第1 LAMP引子組、或第2 LAMP引子組，藉由LAMP法進行增幅而檢出。
進而，本發明係松材線蟲之DNA檢出方法，具備將松材線蟲之rDNA特定區域，使用第1 LAMP引子組、或第2 LAMP引子組，藉由LAMP法進行增幅而檢出之步驟為特徵。
依據本發明，因為係松材線蟲存在於木片中之狀態下，自木片萃取松材線蟲之DNA，所以無需自該木片分離松材線蟲，而可萃取松材線蟲DNA。由此可實用使用松 材線蟲之DNA之檢出。
另外，依據本發明，可以LAMP法增幅松材線蟲之rDNA特定區域而檢出。因此，以更高精度容易且廉價地進行增幅松材線蟲之基因及檢出。
用以實施發明之最佳形態
本實施形態之松材線蟲之檢出方法中，例如藉由將來自松屬之木本之木片浸漬於含分解角質之酵素之溶液中，萃取該木片中存在之松材線蟲之DNA，無需自木片分離松材線蟲而萃取DNA。接著，使用含可特異地煉合於松材線蟲之rDNA內的特定區域之引子之LAMP法用引子組，藉由適用基因增幅方法之一之LAMP法，增幅松材線蟲之DNA而檢出，自採取之木片進行松材線蟲檢出。
如上所述，傳統上係以柏門式漏斗分離法自木片分離松材線蟲後，藉由使用顯微鏡觀察形態而鑑定松材線蟲。對此，本發明者首先提出使用DNA之檢出以進行松材線蟲之檢出。
然而，適用傳統之DNA萃取方法於存在松材線蟲之木片時，難以有效率地自木片萃取松材線蟲之DNA，萃取需要非常多的時間。另一方面，雖亦考慮粉碎存在松材線蟲之木片，萃取、精製DNA，但因為需要粉碎木片用之粉碎機等之專業機器，所以不具備如此專業機器時，難以適用該方法。換言之，未具備該專業機器時，結果上變成自木片分離松材線蟲而萃取DNA，需要與柏門式漏斗 分離法時相同程度的勞力及時間。另外，即使可適用該方法時，萃取液中仍含大量木質素等之來自木片的成份。因此，為使用於藉由DNA增幅而檢出，必須充分地精製所萃取之DNA。
因此，本發明者係著眼於松材線蟲體表之主要成份之一之角質。接著，努力研究的結果，發現使分解角質之酵素作用於含松材線蟲之木片，溶解松材線蟲之體表，萃取其中之DNA，而達成完成本發明。亦即，依據本發明，即使省略或簡單化粉碎採取木片等之處理，仍可以短時間萃取松材線蟲之DNA。另外，因為DNA萃取緩衝溶液中浸出來自木片的成份亦少，所以可省略或簡單化DNA精製過程。
另外，作為新的基因增幅法之一，已知藉由榮研化學公司(栃木)所開發之LAMP法(Loop-Mediated Isothermal Amplification)。因為LAMP法係特異性、增幅效率高、及添加螢光色素於反應系，可由目測而判定增幅，所以可短時間進行基因之增幅及檢出。另外，因為LAMP法係等溫核酸增幅法，所以無需特別的溫度控制機器，另外，LAMP法所使用之股取代型DNA聚合酶係無需如PCR法具備耐熱性。因此，與PCR等比較，可廉價地進行反應。因此，關於藉由松材線蟲之基因而進行檢出，若可使用LAMP法，可容易且廉價地進行松材線蟲之基因之增幅及檢出。本發明者努力研究的結果，發現可特異地煉合於松材線蟲之rDNA特定區域之序列表序列識別號1至4所示之 LAMP法用引子(LAMP引子)組，達成可使用LAMP法由松材線蟲之基因而檢出。另外，藉由使用序列表序列識別號5表示之Loop-F之引子，可以更短時間進行增幅及檢出。
以下係詳細地說明關於本發明之適合形態。
首先，詳述藉由自存在松材線蟲之松樹木片(松材片)，萃取松材線蟲之DNA所得之調製松材線蟲之DNA萃取液。本實施形態中，放入採取材片於含分解角質之酵素(以下，稱為角質分解酵素)之溶液(緩衝溶液，DNA萃取緩衝溶液)中，進行培養，萃取存在於松材片中松材線蟲之DNA，作為DNA萃取液。緩衝溶液係只要具有角質分解酵素之活性即可，可使用可用於DNA萃取之緩衝溶液，可舉例如含NaCl、Tris-HCl、EDTA之緩衝溶液，此時，可為NaCl：100-150mM、Tris-HCl：10-50mM、EDTA：0.1-1mM。
在此，有關本實施形態之角質分解酵素雖非特別限定者，但可使用例如蛋白酶K(E.C.3.4.21.64)。藉由角質分解酵素分解松材片中松材線蟲體表之主要成份之一之角質，溶解細胞，使核內之DNA溶出於DNA萃取緩衝溶液中。因此，無需自木片中分離松材線蟲，可直接自松材片萃取松材線蟲之DNA。角質分解酵素於DNA萃取緩衝溶液中之含量並無特別限定，例如可使萃取緩衝溶液中含7.5U/μl程度。另外，關於調製DNA萃取液，可藉由添加含角質分解酵素之DNA萃取試劑組於DNA萃取緩衝溶液而利用。該DNA萃取試劑組係可為例如ISOHAIR(( 股)NIPPON GENE)。
上述之萃取松材線蟲DNA所供應之木片大小、採取方法並非侷限本發明者，可任意地設定。另外，關於採取木片之木本之種類，雖無特別限定，但可舉例如松屬木本之黑松、赤松、硫球松、朝鮮五葉松、日本五針松(Pinus pentaphylla)、歐洲赤松、歐洲黑松、法國海岸松、山松(Pinus mugo)、輻射松(Pinus Radiata)、美國黃松(Pinus ponderosa)、西部白松(Pinus monticola)、臺灣黑松、油松(Pinus tabuliformis)、喜馬拉雅五葉松、湿地松(Pinus elliottii Engelm)、剛葉松(Pinus rigida Mill)、扭葉松(Pinus contorta)、白松(Pinus strobus)、德達松(Pinus taeda)、大王松、短葉松(Pinus banksiana)、刺針松(Pinus pungens)、白皮松(Pinus bungeana)、臺灣赤松等。另外，亦可於上述之DNA萃取液中，進行已知之DNA精製處理，供應於後述藉由LAMP法之增幅。另外，使用角質分解酵素之DNA萃取法並非侷限於存在於木片中之松材線蟲，當然亦可使酵素作用於松材線蟲本身而進行萃取DNA。
接著，詳述關於本發明之LAMP引子之設計。於本實施形態，決定松材線蟲之鹽基rDNA之ITS(Internal Transcribed Spacer)區域之鹽基序列，基於該鹽基序列，使用引子設計支援軟體，對松材線蟲進行設計特異的LAMP法用引子。具體上，首先將松材線蟲及假松材線蟲(松材線蟲之最近緣種)之rDNA之ITS區域，藉由PCR 法而使增幅，使用ABI3100 DNA sequencer(Applied Biosystems)決定該區域之鹽基序列。將兩種鹽基序列情報，以榮研化學(股)於WEB上提供之LAMP引子設計支援軟體(Primer Explorer V4)分析，設計LAMP引子使僅松材線蟲之DNA被增幅。
在此，有關本實施形態係關於LAMP引子之設計，對於rDNA之ITS區域內之目標基因，分別規定自3’端側之F3c、F2c、F1c之3個區域，以及向目標基因之5’端側之B1、B2、B3之3個區域，對此6個區域，設計F3、B3、FIP及BIP之4種引子。另外，對F3c、F2c、F1c之各區域互補之區域分別為F3、F2、F1，以及對B1、B2、B3之各區域互補之區域分別為B1c、B2c、B3c。
具體上，序列表序列識別號1所示之F3引子係設計成具有與F3c區域互補之序列之F3區域。
另外，序列表序列識別號2所示之B3引子係設計成具有與B3c區域互補之序列之B3區域。
進而，序列表序列識別號3所示之FIP引子係設計成於3’端側具有與rDNA之ITS區域規定之F2c區域互補之序列之F2區域，於5’端側具有與F1c區域相同的序列。
進而，序列表序列識別號4所示之BIP引子係設計成於3’端側具有與B2c區域互補之序列之B2區域，於5’端側具有與B1c區域相同的序列。
另外，本實施形態係含序列表序列識別號5所示之Loop-F引子。因為藉此增幅操作時，增加DNA合成的起 點，可加速增幅反應，所以可以短時間進行松材線蟲DNA之增幅及檢出。序列表序列識別號5所示之Loop-F引子係設計成具有與F1區域及F2區域之間之區域互補之序列。
接著，說明關於對萃取之DNA，藉由使用上述之引子組之LAMP法之增幅操作。
藉由LAMP法之增幅操作係例如如下述進行。首先，混合反應試藥(例如Bst DNA聚合酶、反應用緩衝溶液(reaction mix)、引子組、蒸餾水)，調製增幅反應液。另外，亦可混合後述之螢光．目測檢出試藥。
引子組除外之反應試藥係可為例如榮研化學公司所市售之Loopamp(註冊商標，以下相同)DNA增幅試藥試劑組。Loopamp DNA增幅試藥試劑組係由以下之含有成份所構成；2倍濃度反應用緩衝溶液(2×Reaction mix)：40mM Tris-HCl(H8.8)、20mM KCl、16mM MgSO4、20mM(NH4)2SO4、0.2% Tween20、1.6M Betaine、各最終濃度為2.8mM之dATP、dCTP、dGTP、dTTP；Bst DNA聚合酶8units/μl。另外，關於後述之螢光．目測檢出試藥，例如可為榮研化學公司所市售之Loopamp螢光．目測檢出試藥。
接著，於該增幅反應液，加入上述之松材線蟲之DNA萃取液，例如於63℃進行培養。
在此，LAMP法之反應係如下述步驟所進行。(1)序列表序列識別號3之FIP引子煉合於模型DNA。(2)藉由BstDNA聚合酶之作用，以FIP引子之F2區域之3’ 端為起點，合成與模板DNA互補之DNA股。(3)序列表序列識別號1之F3引子煉合於FIP引子之外側，以該3’端為起點，藉由BstDNA聚合酶之作用，剝離先前所合成之來自FIP引子之DNA股，同時延長DNA合成。(4)由F3引子所合成之DNA股與模板DNA成為雙股，(5)另一方面，依來自F3引子之DNA股，所剝離之來自FIP引子之DNA為單股DNA。該DNA股係於5’端側具有互補的區域F1c、F1，引起自己煉合，形成環(loop)。(6)對於上述之(5)中形成環之DNA股，序列表序列識別號4之BIP引子進行煉合。以該BIP引子之3’端為起點，進行互補DNA之合成。(5)所形成之環被剝離而延伸。另外，序列表序列識別號2之B3引子煉合於BIP引子之外側。以B3引子之3’端為起點，藉由BstDNA聚合酶之作用，剝離先前所合成之來自BIP引子之DNA股，同時延長DNA合成。(7)藉由上述(6)之步驟，形成2股DNA。(8)另一方面，因為於(6)之過程所剝離之來自BIP引子所合成之DNA股係於兩端具有互補的序列，所以自己煉合，形成環而成為啞鈴般之結構。(9)以上述(8)所形成之啞鈴般結構之DNA股為起點，進行介著FIP引子及其後續之BIP引子之煉合之DNA增幅循環。
增幅操作用之培養時間係可例如為60分鐘。藉由於LAMP法中煉合反應及DNA股合成，於該培養間，可使DNA增幅109~1010倍。
本實施形態中，接著，對於已進行增幅操作之反應液 ，進行確認是否含松材線蟲之DNA。亦即，供應於檢出之松材片中存在松材線蟲時，藉由增幅操作增幅松材線蟲之DNA而檢出。另一方面，供應於檢出之松材片中若未含松材線蟲時，即使增幅操作，松材線蟲之DNA仍未被增幅，因此未被檢出。
反應液中是否含被增幅之DNA係可例如以螢光目測檢出而確認。螢光目測檢出係添加螢光目測試藥而使反應，以目測確認反應液的顏色。具體上，若反應液發出螢光為陽性，亦即松材線蟲之DNA被增幅，若未發出螢光為陰性，亦即，可判斷松材線蟲之DNA未被增幅。該反應液之螢光係由紫外線照射裝置，更明確地判斷陽性及陰性之差異。
雖如上所述說明關於本實施形態，但本發明並不侷限於此者，可為其他實施形態。例如LAMP法中DNA增幅之檢出方法並非侷限於螢光目測檢出者，可任意改變。具體上，因作為增幅的副產物產生之焦磷酸鎂之影響，增幅反應液成白濁，但亦可藉由測定此時之增幅反應液之濁度而檢出松材線蟲之DNA增幅。另外，關於基因之增幅，亦可使用已知之各種核酸增幅方法，例如PCR(Polymerase Chain Reaction)法而進行。
另外，使用本發明之LAMP引子，藉由LAMP法增幅DNA而檢出之方法，不，侷限於直接自木片萃取松材線蟲之DNA，藉由柏門式漏斗分離法等自木片分離松材線蟲，萃取DNA時亦可適用。
實施例
以下係由實施例更詳細地說明本發明。然而，本實施例並非侷限本發明者。
(實施例1)
本實施例使用之松材片係採集自森林綜合研究所本所內之10棵枯死黑松。其中5棵係感染松材線蟲之黑松(人為接種松材線蟲而使枯死之黑松)，剩餘5棵係未感染松材線蟲之黑松(於健康狀態砍伐後，為防止松材線蟲感染，於網室隔離之黑松)。
自採取黑松材片萃取松材線蟲之DNA，調製松材線蟲之DNA萃取液。具體上，首先放入1ml之DNA萃取緩衝溶液(100mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH.8.0)，1mM EDTA)於1.5ml之微量管。接著，於微量管中之該DNA萃取緩衝溶液中，添加40μl之含角質分解酵素之蛋白酶K之DNA萃取試劑組(ISOHAIR，(股)NIPPON GENE)Lysis buffer及50μl之Enzyme solution，充分攪拌。接著，將約0.06g之採取的松材片，放入微量管內之溶液中，以55℃，20分鐘，接著94℃，10分鐘進行培養。
接著，使用有關本發明之引子組及上述之DNA萃取液，藉由LAMP法進行增幅、及檢出操作。具體上，首先於0.2ml之微量管，分別注入下述份量之本發明之引子組 、Loopamp DNA增幅試藥試劑組(榮研化學(股))之各試藥、及Loopamp螢光．目測檢出試藥(榮研化學(股))，製作反應液。引子組係藉由PCR法而增幅松材線蟲及假松材線蟲之rDNA的ITS區域，使用ABI3100 DNA sequencer(Applied Biosystems)，決定該區域之鹽基序列後，將兩種鹽基序列情報，以榮研化學(股)於WEB上提供之LAMP引子設計支援軟體(Primer Explorer V4)分析，設計LAMP引子使僅松材線蟲之DNA被增幅而得。
2×Reaction Mix：12.5μl
Primer FIP(序列表序列識別號1)：1.0μl(40pmol/μl)
Primer BIP(序列表序列識別號2)：1.0μl(40pmol/μl)
Primer F3(序列表序列識別號3)：10μl(5pmol/μl)
Primer B3(序列表序列識別號4)：1.0μl(5pmol/μl)
Primer Loop-F(序列表序列識別號5)：1.0μl(20pmol/μl)
Bst DNA Polymerase：1.0μl
螢光．目測檢出試藥：1.0μl
蒸餾水：3.5μl
計：23.0μl
接著，加入2μl之上述DNA萃取液於該增幅反應液，充分攪拌，於63℃之條件下放置1小時。
1小時後，關於增幅反應液係是否發出綠色螢光，由目測確認。該結果如表1所示。發出綠色螢光，判斷為陽性時，以○表示，不發出螢光，判斷為陰性時，以×表 示。
另外，關於各個採取自與各例相同木之松材片，使用柏門式漏斗分離法，進行檢出。該結果係可得到與上述表1表示者相同的檢出結果。藉此顯示有關本發明之本實施例之檢出方法之有效性。
(實施例2及實施例3)
接著，作為本發明之實施例2及3，檢討關於使用藉由LAMP法、及PCR法增幅DNA之檢出松材線蟲之有效性。
首先，自森林綜合研究所本所內發生之1棵枯死松木，採集材片。關於採集材片中之8g，適用柏門式漏斗分離法，分離松材線蟲。接著，算出採集材片之線蟲密度(每1g之松材線蟲數)。
另外，自剩餘的材片，調製8個約0.06g之DNA萃取用檢品，使用於DNA萃取。具體上，首先放入1ml之DNA萃取緩衝溶液(100mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH.8.0)，1mM EDTA)於1.5ml之微量管。接著，於微量管中該DNA萃取緩衝溶液中，添加40μl之含角質分解酵素之蛋白酶K之DNA萃取試劑組(ISOHAIR，(股)NIPPON GENE)之Lysis buffer及50μl之Enzyme solution，充分攪拌。接著，將各約0.06g之DNA萃取用檢品，放入微量管內之溶液中，以55℃，20分鐘，接著94℃，10分鐘進行培養。
使用此8個DNA萃取液，以LAMP法及PCR法增幅松材線蟲，進行檢出。另外，關於使用LAMP法之檢出方法及條件，因與上述實施例1相同，所以省略說明。
實施例3之使用PCR法之檢出係如下述方法進行。首先，於0.2ml之微量管，分別注入下述份量之GoTaq Green Master Mix(Promega(股))及藉由PCR法增幅松材線蟲之rDNA的ITS區域用之引子組，製作反應液。另外，構成該引子組之引子序列係如序列表序列識別號6及7所示。
GoTaq Green Master Mix：10μl
Bx18S1)(序列表序列識別號6)：2.5μl(2pmol/μl)
Bx28S1)(序列表序列識別號7)：2.5μl(2pmol/μl)
蒸餾水：3.0μl
計：18.0μl
1)Aikawa,T.,Kikuchi,T.and Kosaka,H.(2003) Demonstration of interbreeding between virulent andavirulent populations of Bursaphelenchus xylophilus(Nematoda：Aphelenchoididae)by PCR-RFLP method.Appl.Entomol.Zool.38：565-569。
此反應液中加入2μl之上述DNA萃取液，使用iCycler溫度循環器(Thermal cycler)(Bio-Rad Laboratories(股))，藉由PCR反應，增幅松材線蟲之DNA。PCR條件係如下述設定。首先，94℃，2分，接著，94℃，1分-53℃，1分-72℃，1分，35次循環，接著最後為72℃，2分。
注入8個增幅反應液於瓊脂糖膠(agarose gel)，於電泳後以溴化乙啶(ethidium bromide)液染色。接著，關於此等，藉由UV照射，確認有無增幅DNA，判斷是否可檢出DNA。
實施例2及3之適用結果係如下所示。首先，由柏門式漏斗分離法分離線蟲之結果，適用本實施例之檢出方法之材片係經確認每1g棲息約17隻松材線蟲之材片。
使用LAMP法及PCR法之檢出結果係如表2所示。
如表2所示，實施例2使用之8檢品全部可增幅松材線蟲之DNA而檢出。由該實施例2及3之結果，顯示使角質分解酵素作用於木片而萃取DNA，增幅該DNA而檢出之本發明之松材線蟲之檢出方法中，將松材線蟲之rDNA之特定區域，使用上述LAMP引子組，藉由LAMP法進行增幅而檢出為宜。
另外，由該實施例2及3之結果，顯示上述LAMP引子組係使用於使分解角質之酵素作用於含松材線蟲之木片，增幅已萃取松材線蟲之DNA時，與以PCR法所使用之其他引子比較，顯示非常高之增幅成功率。
<110> 森林綜合研究所
<120> 自木片檢品萃取線蟲基因DNA之方法、松材線蟲之 LAMP引子組及自木片檢品檢出松材線蟲之方法。
<160> 7
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 研究者：Aikawa,takuya；Kikuchi.taisei； Kanzaki,natsumi
<220>
<223> 松材線蟲(F3引子)
<400> 1
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 松材線蟲(B3引子)
<400> 2
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 松材線蟲(FIP引子)
<400> 3
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 松材線蟲(BIP引子)
<400> 4
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 松材線蟲(LoopF引子)
<400> 5
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 松材線蟲(PCR引子，B×18S)
<400> 6
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 松材線蟲(PCR引子，B×28S)
<400> 7

Claims (4)

  1. 一種LAMP引子組，其特徵係由可煉合於松材線蟲rDNA特定區域之各序列表序列識別號1至4所示之鹽基序列F3、B3、FIP、及BIP之引子所成。
  2. 如申請專利範圍第1項之LAMP引子組，其中更含有序列表序列識別號5所示之鹽基序列Loop-F之引子。
  3. 一種松材線蟲之DNA檢出方法，其特徵係具備將前述松材線蟲rDNA特定區域，使用申請專利範圍第1項或第2項之LAMP引子組，藉由LAMP法進行增幅而檢出之步驟。
  4. 一種松材線蟲之檢出方法，其特徵係具備將前述含松材線蟲之木片浸漬於含分解角質之酵素之溶液中，萃取前述松材線蟲之DNA之步驟，及增幅已萃取之前述松材線蟲之DNA而檢出之步驟，其中，增幅前述松材線蟲之DNA而檢出之步驟係將前述松材線蟲之rDNA的特定區域使用如申請專利範圍第1項或第2項之LAMP引子組，藉由LAMP法進行增幅而檢出。
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