KR20160075943A - 장수풍뎅이 병원성 바이러스 AdV(Allomyrina dichotoma Virus)의 감염 진단용 프라이머 세트 및 그 진단방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 장수풍뎅이의 질병을 유발하는 병원성 바이러스(AdV)의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 장수풍뎅이의 바이러스 질병을 유발하는 미동정 바이러스에 대한 특이 DNA 절편을 진단할 수 있는 프라이머(Primer) 세트를 제공하고, 이 프라이머를 이용한 PCR 증폭방법을 통해 신속하고 정밀하게 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)의 감염 여부를 진단할 수 있는 방법을 확립함으로써, 장수풍뎅이의 바이러스성 질병을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있음을 알 수 있다.
Description
본 발명은 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)의 감염 진단용 프라이머 세트 및 그 진단방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 장수풍뎅이의 질병을 유발하는 미동정 병원성 바이러스(AdV)의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 프라이머 세트와 그 진단방법에 관한 것이다.
장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)는 딱정벌레목(Coleoptera), 풍뎅이과 (Family Scarabaeidae)에 속하는 곤충이다. 장수풍뎅이는 습도나 온도에 민감하지 않고 먹이가 까다롭지 않아 사육이 간편하여 애완곤충으로 각광받고 있으며, 최근에는 장수풍뎅이의 애벌레가 간 질환에 효과가 있다는 민간요법이 알려지면서 이를 건강보조용 약재로 이용하는 경향이 증가 되고 있다. 예로부터 한약재로 자주 이용되어 온 굼벵이, 누에, 동충하초, 지네 등은 유용한 곤충자원으로 이용되고 있으며 최근 신약 개발에 있어서 이러한 천연자원의 기능에 대한 연구도 활발하게 진행되고 있다. 이와 같이 장수풍뎅이는 애완용으로도 널리 이용되며 유용한 곤충자원의 하나로 자리 잡고 있다.
한국 장수풍뎅이의 경우, 장수풍뎅이에 감염하는 세균과 진균의 진단은 몇 가지 정도 알려져 있다. 세균의 경우 S.marcescens와 B.thuringiensis가 있고(비특허 문헌 1,4 참조), 진균의 경우 M.anisopliae와 B.bassiana이 있다(비특허 문헌 2,3 참조).
하지만 바이러스성으로 의심되는 질병에 의한 유충 집단 폐사로 심각한 경제적 손실이 있으나 아직까지 연구 자료는 매우 미흡한 실정이다. 바이러스병이 만연하고 있음에도 불구하고, 질병 유발 바이러스의 동정이나 진단방법은 전무한 상태이다. 따라서 장수풍뎅이 병원성 바이러스의 신속하고 조기 진단을 할 수 있는 검출 방법에 대한 연구가 요구되는 실정이다.
바이러스성 감염을 진단하고 바이러스를 검출, 동정하는 방법으로 외부병징의 육안 및 현미경 관찰법, PCR을 통한 염기서열의 증폭, 항혈청에 의한 효소면역항체법, 배양-동정법 등이 알려져 있다. 미동정 바이러스의 경우, 외부 병징의 육안 또는 현미경 관찰은 바이러스가 어떤 그룹에 속하는지만 확인할 수 있으며 동정을 하기는 어렵다. 바이러스 동정을 위해서는 상당한 기간을 요할 만큼 느리고 다양한 생화학적 시험을 거쳐야 한다.
그러므로 본 발명에서는 장수풍뎅이의 질병을 유발하는 미동정 병원성 바이러스의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 방법을 알아보았다.
상기 장수풍뎅이 질병 병원성 바이러스(AdV) 진단방법을 통해 바이러스(ADV)를 보균한 장수풍뎅이 성충이 사육장을 이탈해 야생 장수풍뎅이와 접촉함으로서 질병이 전국으로 확산될 가능성을 미연에 방지하며, 사육 농가의 질병 방제에 시간과 비용을 절감하는데 기여할 수 있다.
바이러스 진단 방법에 있어서 최근 가장 흔하게 이루어지고 있는 방법은 PCR 진단(분자진단)법이다. 이는 유전자의 최소단위인 DNA 또는 RNA의 특정영역을 시험관 내에서 인위적으로 대량 증폭하는 획기적인 기술이다. PCR의 원리는 단순하고 실제로 쉽게 응용할 수 있어 생명공학을 포함하는 의학, 이학, 농학, 수의학, 식품과학, 환경과학 등 다양한 분야에서 활용되고 있다. 사람이나 동물에 감염되어 질병을 일으키는 세균이나 바이러스 또는 기타 감염성 기생충은 모두 생명체를 유지하고 증식하기 위한 최소단위의 유전정보인 DNA(RNA)를 가진다. PCR 진단방법은 이러한 최소단위의 DNA 또는 RNA를 실험실 내에서 인공적으로 증폭하는 기술을 말한다. 사람이나 동물이 세균 또는 바이러스 등에 감염되면 이들은 숙주의 세포에 침투하여 증식을 하게 되며 온몸으로 퍼지게 된다. PCR 진단방법이 기존 진단방법에 비해 특이도가 매우 뛰어난 이유는 검체내에 존재하는 병원체(세균, 바이러스 등)가 가지는 특정 DNA(RNA)만을 Target으로 하기 때문이며, 1개의 유전자만 존재하더라도 이를 최소 수 억배로 증폭하기 때문에 민감도가 다른 검사법에 비해 최소 수천배 이상 뛰어나다.
관련 선행기술로는 대한민국등록특허 제10-1322323호(명칭: 백미속 식물에서 발견된 신규한 큰조롱모자이크바이러스, 그의 검출용 프라이머 및 이를 이용한 큰조롱모자이크 바이러스의 검출방법)과, 대한민국등록특허 제10-1395938호(명칭 : 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 프라이머 및 그 진단방법)가 있다.
1- 정지아, 김애란, 서병주, 정석찬, 김인철, 정기화, 정병열. 2013. Serratia marcescens 검출을 위한 PCR 기법 개발 및 돼지정액 유래균주에 대한 항생제 감수성 양상. 생명과학회지. 제23권 제9호, 1133-1139
2- Choi JY, Je YH, and Kim KY. 2004. Identification of Metarhizium sp. Isolated from Protaetia brevitarsis seulensis (Kolbe) using ribosomal DNA sequence. GenBank direct submission no. AY237118.1
3- Shin TY, Choi JB, Bae SM, Koo HN, Roh JY, Je YH, Jin BR, and Woo SD. 2011. Characterization of Beauveria bassiana MsW1 isolated from pine sawyers, Monochamus saltuarius. J. Basic Microbiol. 51, 531-539 (2011)
4- Yamada S, Ohashi E, Agata N, and Venkateswaran K. 1999. Cloning and nucleotide sequence analysis of gyrB of Bacillus cereus, B. thuringiensis, B. mycoides, and B. anthracis and their application to the detection of B. cereus in rice. Appl. Environ. Microbiol. 65: 1483-1490
본 발명의 목적은 장수풍뎅이의 질병 원인인 병원성 바이러스((AdV)를 유전자 수준에서 효과적으로 진단할 수 있는 PCR용 프라이머 세트와 상기 프라이머 세트를 이용한 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)진단용 조성물 또는 진단용 키트, 상기 프라이머 세트 또는 조성물 또는 키트를 이용하는 단계를 포함하는 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)의 진단 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 프라이머 세트는 서열번호 1과 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 5와 서열번호6 으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것이 특징이다.
장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 프라이머 세트는 서열번호 1과 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 5와 서열번호 6로 표시되는 프라이머 세트를 모두 포함하여 이루어지는 것이 특징이다.
본 발명의 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 조성물은 상기 프라이머 세트를 포함하여 진단하는 것이 특징이다.
상기 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 조성물에는 DNA 중합효소를 추가적으로 포함하는 것이 특징이다.
본 발명의 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 키트는 상기 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 진단용 조성물을 포함하는 것이 특징이다.
본 발명의 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단 방법은 장수풍뎅이 병원성 바이러스 감염 진단 프라이머 세트를 제조하는 제 1단계, 상기 프라이머 세트와 DNA 중합효소를 포함하는 조성물을 제조하는 제 2단계, 상기 제조된 조성물에 검체 DNA를 첨가하여 반응액을 제조하는 제 3단계, 상기 제조된 반응액을 PCR 또는 실시간 PCR반응을 수행하여 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염을 진단하는 제 4단계를 포함하는 것이 특징이다.
다른 관점에서, 본 발명의 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단 방법은 장수풍뎅이 병원성 바이러스 감염 진단 프라이머 세트를 제조하는 제 1단계, 상기 프라이머 세트와 DNA 중합효소를 포함하는 조성물을 제조하는 제 2단계, 상기 제조된 조성물에 체액원액 또는 체액 희석액을 첨가하여 반응액을 제조하는 제 3단계, 상기 제조된 반응액을 PCR 또는 실시간 PCR반응을 수행하여 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염을 진단하는 제 4단계를 포함하는 것이 특징이다.
본 발명에 의한 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단방법은 지금까지 바이러스 동정이나 진단법이 보고 된바가 없는 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염을 특이적으로 진단함으로써 장수풍뎅이의 바이러스 감염 여부를 신속 정밀하게 진단 가능하며, 이를 통해 장수풍뎅이 질병 원인인 바이러스 감염경로를 추적하는 데에도 유용하게 이용될 수 있으므로 결과적으로 장수풍뎅이의 바이러스성 질병을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있다.
도 1은 장수풍뎅이 병원성 바이러스, AdV에 감염된 장수풍뎅이 유충 사진이다.
도 2는 AdV-F1, AdV-R1 과 AdV-F2, AdV-R2 및 AdV-F3, AdV-R3 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭한 후 전기 영동한 것이다. 구체적으로 레인 1~3은 장수풍뎅이 병사체(병사충), 4~7은 B.thuringiensis, 8~11은 S.marcescens, 레인 12~15는 M.anisopliae, 레인 16~19는 B.bassiana의 PCR 산물을 나타낸 것이다. 레인 7, 레인11, 레인15 및 레인19는 양성 대조군이다.
도 3은 장수풍뎅이 병사충 체액의 농도별 PCR 검출 감도를 보여주는 사진이다.
도 2는 AdV-F1, AdV-R1 과 AdV-F2, AdV-R2 및 AdV-F3, AdV-R3 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭한 후 전기 영동한 것이다. 구체적으로 레인 1~3은 장수풍뎅이 병사체(병사충), 4~7은 B.thuringiensis, 8~11은 S.marcescens, 레인 12~15는 M.anisopliae, 레인 16~19는 B.bassiana의 PCR 산물을 나타낸 것이다. 레인 7, 레인11, 레인15 및 레인19는 양성 대조군이다.
도 3은 장수풍뎅이 병사충 체액의 농도별 PCR 검출 감도를 보여주는 사진이다.
본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.
장수풍뎅이의 병 증상이 바이러스에 감염 되었을 때 병증을 보여 현재 알려진 곤충 감염 바이러스들을 대상으로 프라이머를 제작하였으며 오릭테스 누디바이러스(Oryctes Nudivirus)도 그 중 하나였다. 그 중 병증상이 한국장수풍뎅이와 유사하며, 기주곤충의 계통도 가까운 편인 말레이시아산 남방 장수풍뎅이에 감염하는 오릭테스 누디바이러스의 염기서열을 기반으로 프라이머 세트 3종을 제작하였다. 제작한 프라이머 세트 3종으로 한국 장수풍뎅이 병사충(질병으로 죽은 장수풍뎅이)으로부터 감염 양성반응을 확인하였다. 각 진단 프라이머 세트가 장수풍뎅이에 감염하는 것으로 알려진 세균 2종과 진균 2종에서는 증폭되지 않음을 확인하였다.
미동정 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)가 오릭테스 누디바이러스와 동일한 종인지, 변이를 일으킨 변종인지, 한국 토종, 혹은 다른 바이러스인데 프라이머로 선택한 일부 염기서열이 유사할 뿐인지의 여부는 아직 확인되지 않았다.
본 발명은 오릭테스 누디바이러스의 염기서열을 토대로 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단 프라이머 세트 제작 및 프라이머 세트를 이용한 진단방법을 제공한다.
본 발명에서의 용어, "프라이머"란 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소)및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재하에서 DNA합성을 개시할 수 있다. 본 발명에 의하면, 상기 프라이머는 15 내지 30개의 염기서열을 가지는 각각의 정방향 및 역방향의 핵산으로 구성됨이 바람직하다.
본 발명은 장수풍뎅이로부터 유래된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 내지 6의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 증폭하는 단계를 포함한다. 서열번호 1, 서열번호3, 서열번호5는 정방향 프라이머이고 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6은 역방향 프라이머이다. 바람직하게는 정방향 프라이머 하나와 역방향 프라이머 하나가 세트를 이루는 것이다. 더욱 바람직하게는 서열번호 1과 서열번호 2가 한세트, 서열번호 3과 서열번호4가 한세트, 서열번호 5와 서열번호6이 한세트를 이루는 것이다.
상기 장수풍뎅이로부터 유래된 DNA란, 장수풍뎅이 또는 장수풍뎅이 유충으로부터 분리된 gDNA 뿐 아니라, 바이러스 DNA등 장수풍뎅이로부터 얻을 수 있는 모든 종류의 DNA를 의미한다.
상기 증폭은 중합연쇄효소를 이용한 중합효소연쇄반응(PCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time PCR)일 수 있다.
상기 본 발명을 다른 관점에서 살펴보면, 본 발명의 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 조성물은 상기 프라이머 세트 뿐만 아니라, 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위한 DNA 중합효소를 추가로 포함할 수도 있다.
상기 본 발명을 다른 관점에서 살펴보면, 본 발명은 상기 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 조성물을 포함하는 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 키트에 관한 것이다. 상기 키트를 이용하면, 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)에 감염되었는지의 여부를 확인할 수 있다.
본 발명의 진단용 키트는, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 진단용 키트 및 진단용 조성물은 실시간 다중 PCR(real-time multiplex PCR)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 본 발명의 진단용 키트는, 진단 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 세트 외에도 장수풍뎅이 세균성 질병 원인균의 유전자인 DNA를 증폭하기 위한 DNA 중합효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Hot start Taq-폴리머라아제 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.
뿐만 아니라, 상기 키트를 이용하면, 장수풍뎅이아과 곤충의 병원성 바이러스 감염 진단 방법을 제공할 수도 있다.
상기 본 발명을 다른 관점에서 살펴보면, 본 발명의 장수풍뎅이아과 곤충의 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단 방법은 a) 상기 장수풍뎅이아과 곤충의 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 조성물에 DNA 중합 효소를 포함하는 효소 조성물을 혼합하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 제조된 혼합물에 검체 DNA 또는 검체를 첨가하는 단계; 및, c) 상기 b) 단계에서 제조된 검체 DNA 또는 검체를 포함하는 반응액을 PCR 또는 실시간 PCR 반응을 수행하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 검체로는 장수풍뎅이아과 곤충 바람직하게는 장수풍뎅이 또는 장수풍뎅이 유충, 더욱 바람직하게는 장수풍뎅이 유충의 병사충 체액으로부터 얻은 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)가 대상이 된다. 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 PCR 진단은 병사충 조직이나 병사충 체액에서 분리된 DNA를 사용하여 수행할 수 있다. 또한 병사충 체액을 바로 이용하여 PCR을 수행할 수 있다. 이는 장수 풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)의 신속한 진단이 가능하다. 상기 c) 단계에서 DNA 측정하기 위한 분석 방법으로는 경쟁적 PCR , 실시간 PCR, DNA 칩 등이 포함될 수 있으며 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 진단 방법들을 통하여 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 바이러스의 감염 여부를 예측할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시예 1> 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염확인 및 바이러스 정제
도 1은 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)에 감염된 유충의 사진이다. 장수풍뎅이가 바이러스에 감염이 되면, 유충이 우유 빛의 투명한 색상을 띄며, 물렁증을 보이고, 과다한 체액을 보이며 하복부가 팽윤되는 증상을 띈다. 이는 곰팡이나 박테리아 감염과는 확연하게 대비되는 증상으로 바이러스성 질환의 진단 이유가 된다. 상기 이병충의 병증상과 남방장수풍뎅이에 감염하는 오릭테스 누디바이러스 감염 증상이 유사함을 확인하고 기주곤충의 계통도 가까운 편임을 확인하였다.
바이러스 병증을 보이는 장수풍뎅이로부터 BioVision의 PEG virus precipitation kit을 이용하여 다음과 같이 바이러스를 정제 하였다.
바이러스 병증을 보이는 장수풍뎅이 병사충 체액을 3200xg 로 15분간 4℃에서 원심 분리하였다. 분리한 상층액 10ml당 2.5ml PEG solution A를 첨가하여 4℃에서 하루 동안 두었다. 다음날, 10,000xg로 20분간 4℃에서 원심 분리하여 상층액을 제거하고 100μl virus resuspension solution으로 용해하였다.
용해한 Virus는 건강한 장수풍뎅이 유충에 경구 혹은 주사 접종을 통해 실제 바이러스성 질병을 야기하는지 조사하였다. 접종 방법과 양에 따라 83~100%의 치사율을 보였으며, 해당 병사충 모두에서 AdV 진단 양성반응을 확인하였다.
<실시예 2> 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) DNA 분리
- 병사충 조직에서 분리
장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)에 감염된 병사충을 액체질소에 넣은 후 마쇄(grinding)하여 50mg을 200μl resuspension solution에 용해하였다. Promega의 Wizards Plus SV miniprep kit을 이용하여 매뉴얼에 기재된 방법으로 DNA를 분리하였다.
- 병사충 체액에서 분리
병사충의 몸의 어느 곳에 상처를 내어 체액을 받아 내거나, 주사기로 뽑아서 체액을 모았다. 병사충 체액 100μl에 150μl cell resuspension solution을 더한 후, Promega의 Wizards Plus SV miniprep kit을 이용하여 매뉴얼에 기재된 방법으로 DNA를 분리하였다.
<실시예 3>장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)의 진단 프라이머 제작
풍뎅이과의 오릭테스 속에 속하는 남방 장수풍뎅이에 감염하는 오릭테스 누디바이러스의 염기서열을 토대로 하여 약 600bp ~ 650bp 크기의 유전자 단편을 증폭할 것으로 예상되는 프라이머 세트를 Primer3 프로그램을 이용하여 정방향 프라이머(AdV-F1, AdV-F2 및 AdV-F3)와 역방향 프라이머(AdV-R1, AdV-R2 및 AdV-R3)를 구성하였다. 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다. 상기 프라이머는 Blast search를 통해 유전자은행(GenBank)에 등록된 유전자 서열정보와 비교하여 특이성 확인 후 제작하였다.
<실시예 4>프라이머 세트를 이용한 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)의 진단
1. 실험방법
1) PCR 증폭 반응
제작된 프라이머 세트가 장수풍뎅이 질병 유발 세균을 효과적으로 진단할 수 있는지를 PCR 방법을 이용하여 확인하였다. 상기 PCR 방법은 3 stage 3 step의 조건으로 수행하였다. 1 stage: Viral DNA를 단일 서열로 분리시키기 위하여 95℃에서 3분간 열처리하였다. 2 stage: 1 step에서는 Viral DNA와 프라이머를 변성시키기 위해 94℃에서 30초간 처리, 2 step에서는 Viral DNA에 프라이머를 접촉시키기 위해 57℃에서 30초간 처리, 3 step에서는 DNA를 합성하기 위하여 72℃에서 45초간 처리하였으며, 이는 35회 반복 수행하여 특이 서열을 증폭하였다. 3 stage: 72℃에서 10분간 반응시켜 PCR 반응을 종료하였다.
2) 프라이머 세트의 특이성 확인
각 진단 프라이머 세트가 장수풍뎅이 병원성 바이러스(Adv)에 특이적으로 반응하는지를 알아보기 위해 장수풍뎅이 병사충을 실험군 으로 하고, 대조군으로 장수풍뎅이에 감염하는 것으로 알려진 세균 2종인 B.thuringiensis와 S.marcescens에 대하여, 진균 2 종인 M.anisopliae와 B.bassiana에 대해서 비교 실험을 하였다. 대조군의 실험 조건은 비특허 문헌1,2,3 및 4를 참조하였다.
증폭반응 후 증폭산물을 전기 영동하여 확인하였고 그 경과를 도2에 나타내었다.
2. 실험결과
도 2를 통해 알 수 있듯이, 장수풍뎅이 병사충에서 AdV 프라이머 3세트 모두가 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)에 종 특이적으로 유전자 증폭됨을 확인하였다 (lane 1, lane 2 및 lane 3). 반면, 장수풍뎅이에 감염하는 세균에 대한 실험에서 B.thuringiensis는 AdV 프라이머 3세트로 증폭되지 않았으며(lane4, 5 및 lane 6) 양성 대조군인 프라이머 Bt-1/2에서만 증폭되었다(lane 7). 장수풍뎅이에 감염하는 다른 세균 S.marcescens는 AdV 프라이머로 증폭되지 않았으며(lane 8,lane9 및 lane 10) 양성 대조군인 프라이머 luxS-F/R에서만 증폭되었다(lane 11). 역시 장수풍뎅이의 질병 원인이되는 진균 2 종인 M.anisopliae와 B.bassiana 또한 AdV 프라이머로 증폭되지 않았으며 (lane 12, lane 13, lane 14 와 lane 16, lane 17,lane 18),양성 대조군인 프라이머 Nc-F/R과 Bb-P1/P3에서만 증폭됨을 확인하였다(lane15, lane19).
이를 통해 본 발명에 따른 프라이머 세트가 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)를 특이적으로 진단 할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 5>장수풍뎅이 병사충 체액 농도별 PCR 검출 감도
1. 실험방법
신속 조기 진단을 위해 핵산 추출 등의 과정을 거치지 않고 병사충 체액을 직접 이용하거나 체액을 증류수로 5배,10배 및 20배로 희석하여 정방향 프라이머 AdV-F1과 역방향 프라이머 AdV-R1으로 PCR을 진행하였다.
증폭반응 후 증폭산물을 각 1μl씩 1% 아가로즈 겔에 전기 영동하여 확인하였다.
2. 실험결과
상기 실험결과 도 3과 같이 나타났다. 체액을 이용하여 PCR을 진행하여도 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)에 특이적으로 유전자가 증폭됨을 확인하였다. 그리고 체액 원액 5배,10배, 20배로 희석을 많이 할수록 밴드가 더 진하게 나타났다. 이를 통해 본 발명은 별도의 핵산 추출등의 과정을 거치지 않고 체액을 바로 이용함으로 효율적인 바이러스 조기 검출 방법을 제공한다.
이에, 상기 본 발명의 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단방법은 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV)를 특이적으로 진단하고 감염 여부를 신속 정밀하게 진단 할 수 있는 방법을 제공함으로, 상기 진단 방법을 통해 질병 원인 바이러스의 감염경로를 추적하는 데에도 유용하게 이용될 수 있으며 결과적으로는 장수풍뎅이 바이러스성 질병을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있다.
상기의 본 발명은 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION)
<120> PRIMER FOR DIAGNOSIS OF VIRUS THAT CAUSE DISEASES OF ALLOMYRINA
DICHOTOMA AND METHOD FOR DIAGNOSIS USING THE SAME
<130> P2014-0140
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> AdV-F1
<400> 1
tccggaaatt acacgagcca c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> AdV-R1
<400> 2
atgccgtacg agagtatagg tcg 23
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> AdV-F2
<400> 3
tcgaatccgt ttccgatact tacag 25
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> AdV-R2
<400> 4
tgagtagcgc tatagactgc tc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> AdV-F3
<400> 5
gggtgtgacg agaaaacaac gc 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> AdV-R3
<400> 6
gcaggcgtgt aataaatggc gg 22
Claims (7)
- 서열번호 1과 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 5와 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 프라이머 세트.
- 서열번호 1과 서열번호 2로 표시되는 프라이머 세트; 서열번호 3과 서열번호 4로 표시되는 프라이머 세트; 및 서열번호 5와 서열번호 6으로 표시되는 프라이머 세트를 모두 포함하는 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 프라이머 세트.
- 제 1항의 프라이머 세트를 포함하는 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 조성물.
- 제 3항에 있어서,
상기 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 진단용 조성물에는 DNA 중합효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 조성물.
- 제 3항 또는 제 4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 키트.
- 제 1항의 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 프라이머 세트를 제조하는 제 1단계;
상기 프라이머 세트와 DNA 중합효소를 포함하는 조성물을 제조하는 제 2단계;
상기 제조된 조성물에 검체 DNA를 첨가하여 반응액을 제조하는 제 3단계; 및,
상기 제조된 반응액을 PCR 또는 실시간 PCR 반응을 수행하여 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염을 진단하는 제 4단계;를 포함하는, 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단 방법.
- 제 1항의 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단용 프라이머 세트를 제조하는 제 1단계;
상기 프라이머 세트와 DNA 중합효소를 포함하는 조성물을 제조하는 제 2단계;
상기 제조된 조성물에 장수풍뎅이 체액 원액 또는 체액 희석액을 첨가하여 반응액을 제조하는 제 3단계; 및,
상기 제조된 반응액을 PCR 또는 실시간 PCR 반응을 수행하여 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염을 진단하는 제 4단계;를 포함하는, 장수풍뎅이 병원성 바이러스(AdV) 감염 진단 방법.
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| KR1020140184599A KR20160075943A (ko) | 2014-12-19 | 2014-12-19 | 장수풍뎅이 병원성 바이러스 AdV(Allomyrina dichotoma Virus)의 감염 진단용 프라이머 세트 및 그 진단방법 |
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| KR1020140184599A KR20160075943A (ko) | 2014-12-19 | 2014-12-19 | 장수풍뎅이 병원성 바이러스 AdV(Allomyrina dichotoma Virus)의 감염 진단용 프라이머 세트 및 그 진단방법 |
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| KR (1) | KR20160075943A (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20180024813A (ko) | 2016-08-31 | 2018-03-08 | 대한민국(농촌진흥청장) | 장수풍뎅이 병원성 바이러스 또는 오릭테스 누디바이러스의 감염 진단을 위한 등온 핵산연쇄중합법용 프라이머 세트 및 이를 이용한 장수풍뎅이 병원성 바이러스 또는 오릭테스 누디바이러스 감염 진단법 |
| KR20210154003A (ko) * | 2020-06-11 | 2021-12-20 | 대한민국(농촌진흥청장) | 장수풍뎅이 누디바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 |
-
2014
- 2014-12-19 KR KR1020140184599A patent/KR20160075943A/ko not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (4)
| Title |
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| 1- 정지아, 김애란, 서병주, 정석찬, 김인철, 정기화, 정병열. 2013. Serratia marcescens 검출을 위한 PCR 기법 개발 및 돼지정액 유래균주에 대한 항생제 감수성 양상. 생명과학회지. 제23권 제9호, 1133-1139 |
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| KR20180024813A (ko) | 2016-08-31 | 2018-03-08 | 대한민국(농촌진흥청장) | 장수풍뎅이 병원성 바이러스 또는 오릭테스 누디바이러스의 감염 진단을 위한 등온 핵산연쇄중합법용 프라이머 세트 및 이를 이용한 장수풍뎅이 병원성 바이러스 또는 오릭테스 누디바이러스 감염 진단법 |
| KR20210154003A (ko) * | 2020-06-11 | 2021-12-20 | 대한민국(농촌진흥청장) | 장수풍뎅이 누디바이러스 검출을 위한 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단 방법 |
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