KR101279395B1 - 마이코플라즈마 하이오라이니스를 검출하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 하이오라이니스 검출키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용한 돼지 유행성 폐렴 진단키트 - Google Patents

마이코플라즈마 하이오라이니스를 검출하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 하이오라이니스 검출키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용한 돼지 유행성 폐렴 진단키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 다양한 마이코플라즈마(Mycoplasma) 종들 중에서 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis) 만을 특이적으로 검출할 수 있는, 특이도 및 민감도를 보유한 프라이머에 관한 것이다.
본 발명은, 마이코플라즈마 하이오라이니스 병원체의 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하는 프라이머에 관한 것이다.
본 발명은, 마이코플라즈마 하이오라이니스를 신속하게 검출하는 방법으로PCR 방법을 적용하되, 마이코플라즈마 하이오라이니스 만을 특이적으로 신속하게 검출할 수 있는 검출키트에 관한 것이다.
본 발명은, 돼지의 유행성 폐렴을 진단하기 위해서 병원체인 마이코플라즈마 하이오라이니스를 신속하게 검출하는 방법으로PCR 방법을 적용하되, 돼지 유행성 폐렴을 신속하게 진단할 수 있는 진단키트에 관한 것이다.

Description

마이코플라즈마 하이오라이니스를 검출하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 하이오라이니스 검출키트, 및 상기 프라이머 세트를 이용한 돼지 유행성 폐렴 진단키트{Primer set for the detection of Mycoplasma hyorhinis, kit for the detection of Mycoplasma hyorhinis by using the primer set, and kit for the diagnosis of porcine pneumonia by using the primer set}
본 발명은, 다양한 마이코플라즈마(Mycoplasma) 종들 중에서 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis) 만을 특이적으로 검출할 수 있는, 특이도 및 민감도를 보유한 프라이머에 관한 것이다.
본 발명은, 마이코플라즈마 하이오라이니스 병원체의 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하는 프라이머에 관한 것이다.
본 발명은, 마이코플라즈마 하이오라이니스를 신속하게 검출하는 방법으로PCR 방법을 적용하되, 마이코플라즈마 하이오라이니스 만을 특이적으로 신속하게 검출할 수 있는 검출키트에 관한 것이다.
본 발명은, 돼지의 유행성 폐렴을 진단하기 위해서 병원체인 마이코플라즈마 하이오라이니스를 신속하게 검출하는 방법으로PCR 방법을 적용하되, 돼지 유행성 폐렴을 신속하게 진단할 수 있는 진단키트에 관한 것이다.
마이코플라즈마(Mycoplasma)는 분류학적으로 몰리큐트 강(綱)(Mollicutes class)에 속하는 원핵세균으로서, 인간 또는 동물의 호흡기나 생식기 등의 각종 장기에 상주하며 심각한 질병을 일으키며, 현재까지 수백여 종(species)이 알려져 있다.
마이코플라즈마는 세포벽이 없어 페니실린이나 스트렙토마이신과 같은 세포벽합성을 저해하는 항생물질에 내성이 있고, 크기가 0.15~0.8 ㎛ 정도이기 때문에 여과멸균에 의하여 제거되지 않으며, 형태학적으로도 다형적(pleomorphic) 특성이 있어 광학현미경을 이용한 관찰이 어려운 미생물이다.
통상적으로, 마이코플라즈마를 검출하기 위하여는 배지를 이용하여 분리 배양하는 직접배양법이 이용되고 있다.
그런데 직접배양법은 세포나 조직 배양 시 기질이나 생체재료가 오염이 쉽게 되며, 또한 성장속도가 느린 마이코플라즈마의 증식을 확인하기 위해서는 2주 이상의 긴 시간이 걸리는 문제점이 존재한다.
또한 마이코플라즈마의 까다로운 영양 요구성 때문에 종(species)에 따라 서로 다른 배양 기법을 필요로 하는 문제점도 존재한다.
더욱이 마이코플라즈마에 오염이 되었어도 세포의 형태 변이나 배양용 배지의 색깔 변이를 유도하지 않고, 감염 시 아무런 증상이 나타나지 않을 수 있으므로 직접배양법으로는 마이코플라즈마의 증식을 확인하는 것은 극히 어렵다고 할 수 있다.
한편, 돼지 마이코플라즈마 폐렴(Swine Mycoplasma Pneumonia)은 일명 돼지 유행성 폐렴(Swine Epidemic pneumonia, SEP)라고도 하는 전염성 호흡기 질병으로서, 과거에는 주된 원인체로 마이코플라즈마 하이오뉴모니에(Mycoplasma hyophenamoniae)를 고려하였으나, 최근 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis)가 동일한 호흡기 질병을 유발한다고 밝혀지고 있다.
이 질병의 기전을 보면, 마이코플라즈마 세균이 돼지의 기관지 섬모세포에 부착하여 집락을 형성하고 세포 독소를 분비하여 섬모 세포를 마비시킴으로써 기관지 섬모의 배출 기능 및 기관지 점액 생성을 억제하는 것은 물론 섬모 세포에 침입하여 상피세포를 손상시키며 증식하게 된다.
그 후 마이코플라즈마 세균은 림파구를 손상시키면서 돼지의 면역기능 장애까지 유발시킨다.
또한 돼지의 폐포 대식세포(Pulmonary Alveolar Macropharge; PAM) 의 기능을 심각하게 저하시켜 흉막 폐렴군 및 파스튜렐라 균 등 2차 세균감염이 쉽게 나타나서 복합적인 폐렴이 발생하며 점진적으로 소모성질병으로 악화되는 발병기전을 일으키는 것으로 알려져 있다.
따라서 마이코플라즈마 하이오라이니스가 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 만큼이나 돼지 유행성 폐렴에 중요한 병원체라는 것이 밝혀지고 있으므로, 마이코플라즈마 하이오라이니스의 정확한 진단 필요성이 크게 대두되고 있는 실정이다.
종래에는, 이러한 돼지의 유행성 폐렴을 진단하는 방법으로는 신선한 가검물을 채취하여 원인 병원체를 분리 및 동정하는 균분리 동정방법, 혈청학적 방법 또는 조직을 이용한 방법이 이용되어 왔다.
그러나 균분리 동정방법은 병원체의 특성상 배양조건이 까다로울 뿐만 아니라, 성장속도가 매우 느리기 때문에 균 분리 배양에 10일 내지 30일 이상이 걸려 병원체의 진단에 장기간이 소요되고, 따라서 이들의 감염에 대하여 즉시적으로 대처할 수 없는 문제점이 있었다.
최근에, 마이코플라즈마 하이오라이니스 검출방법 중에서 가장 선호되는 방법은 유전물질인 핵산을 증폭하는 중합효소연쇄반응(PCR; polymerase chain reaction)을 이용한 방법이다.
여기에서, PCR은 생체 내에 존재하는 적은 양의 DNA를 분리하여 주형으로 사용하고 표적 DNA 서열의 양 말단에 상보적인 올리고뉴클레오타이드 (oligonucleotide)를 프라이머로 이용하여 표적 DNA 단편만을 짧은 시간 안에 수십만 배 이상 증폭시키는 기법이다.
한편 종래에 돼지의 유행성 폐렴 및 마이코플라즈마 검출과 관련되어 출원된 특허문헌을 살펴보면, 먼저, 한국공개특허공보 10-1999-0073181호(특허문헌 1)에는 조직내 교잡법을 이용한 돼지 유행성 폐렴 진단방법이 기재되어 있다.
이는 마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 특이적 DNA 탐침자(probe)를 돼지의 조직절편상에 적용시키는 조직내 교잡법을 이용하여 세균분리 없이 병원체의 감염 여부를 진단하는 것에 대한 것을 특징으로 하고 있다.
두 번째로, 한국공개특허공보 10-2001-0032493호(특허문헌2)에는 재조합 DNA 또는 합성수단에 의해 만들어진 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 단백질, 단백질을 코딩한 DNA 서열, 단백질에 기초한 백신, DNA 서열에 기초한 백신 등을 이용하여 돼지 유행성 폐렴을 예방하는 방법 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 감염의 존재를 검출하기 위하여 이에 대항하여 생성된 단백질 또는 항체에 기초한 진단 방법이 기재되어 있다.
세 번째로, 한국공개특허공보 10-2010-0043619호(특허문헌 3)에는 돼지의 흉막 폐렴 예방을 위한 재조합 항원 단백질로서 사용되는 ApxIIA를 수용성 형태로 생산하기 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용하여 ApxIIA 단백질을 수용성 형태로 생산하는 방법에 대한 것이 기재되어 있다.
네 번째로, 한국등록특허공보 10-0615424호(특허문헌4)에는 마이코플라즈마 및 유사 균종의 유전자형 감별을 위한 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이와 이를 이용한 균종 검출방법이 개시되어 있다.
개략적으로 살펴보면, 청구항 1에는 서열번호 1 ~ 6을 갖는 표적 DNA를 청구하고 있으며, 청구항 2 및 3에는 서열번호 7 ~ 21 및 28 ~ 127을 갖는 마이코플라즈마 균주 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 청구하고 있다.
여기에서, 서열번호 7 ~ 21 및 28 ~ 127의 올리고뉴클레오티드는 주로 개별 마이코플라즈마 탐색을 위한 프로브(probe)로서의 기능을 하게 되는데, 특히 서열번호 41 ~ 48 에는 마이코플라즈마 하이오라이니스 검출을 위한 프로브 염기서열이 기재되어 있다.
그러나 이하에서 서술하는 본 발명의 실시예에 따른 프라이머의 염기서열과는 일치되지 않는다.
다섯 번째로, 한국등록특허공보 10-0502765호(특허문헌5)에는 PCR을 이용하여 마이코플라즈마의 동정 및 탐지를 하기 위한 프라이머가 개시되어 있는데, 청구항 4에는 서열번호 28 ~ 31을 갖는 동정 프라이머가, 청구항 5에는 서열번호 32 ~ 37을 갖는 탐지 프라이머가 기재되어 있다.
여기에서, 서열번호 28 ~ 29 및 32 ~ 33은 뉴모니에(Pneumoniae) 그룹, 서열번호 30 ~ 31 및 34 ~ 37은 호미니스(Hominis) 그룹을 위한 프라이머이다.
여섯 번째로, 한국등록특허공보 10-0974861호(특허문헌 6)에는 생물학적 의약품으로부터 마이코플라즈마를 검출하는 PCR 프라이머 세트가 개시되어 있다.
개략적으로 살펴보면, 1, 2차 중합효소연쇄반응을 실시하되, 1차에는 1, 2 및 10 서열의 전방향 프라이머 및 3, 4, 5, 6 및 11서열의 역방향 프라이머를 사용하며, 2차에는 7 및 12 서열의 전방향 프라이머 및 8, 9 및 13 서열의 역방향 프라이머를 이용하게 된다.
그러나 상기 1 ~ 13 서열의 프라이머들은 이하에서 서술하는 본 발명의 실시예에 따른 프라이머와는 일치되지 않는다.
총괄적으로 정리하여 보면, 돼지의 유행성 폐렴을 진단하기 위해서 병원체인 마이코플라즈마 하이오라이니스를 신속하게 검출하는 것이 요구되나, 병원체의 특성상 균분리 동정방법 등은 진단을 위해서 장기간이 소요되는 문제점이 존재해왔다.
또한 종래의 특허기술 중에서는, 돼지의 유행성 폐렴을 진단하기 위한 방법으로 DNA 프로브 방법을 사용하거나, 단백질 또는 항체에 기초하고 있는 것이 공지되어 있을 뿐으로서, 그 외의 경우는 유행성 폐렴을 예방 및 치료하는 것에 초점이 맞추어져 왔다.
또한 종래의 특허기술 중에서는, 개별 마이코플라즈마 탐색을 위한 프로브(probe), 뉴모니에(Pneumoniae) 또는 호미니스(Hominis) 그룹을 위한 프라이머, 13종의 전방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 두 번의 중합효소연쇄반응을 실시하는 방법 등이 있었으나, 마이코플라즈마 하이오라이니스를 특이적이고 민감하게 검출하는 방법은 개발되지 않았다.
따라서 본 발명자들은 돼지의 유행성 폐렴을 진단하기 위해서 병원체인 마이코플라즈마 하이오라이니스를 신속하게 검출하는 방법으로PCR 방법을 적용하되, 프라이머가 특이도 및 민감도를 보유하게 함으로써, 다양한 마이코플라즈마 종들 중에서 마이코플라즈마 하이오라이니스 만을 특이적으로 검출할 수 있는 기술을 안출하였다.
KR 10-1999-0073181 A KR 10-2001-0032493 A KR 10-2010-0043619 A KR 10-0615424 B1 KR 10-0502765 B1 KR 10-0974861 B1
본 발명의 목적은, 다양한 마이코플라즈마 종들 중에서 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 만을 특이적으로 검출할 수 있는, 특이도 및 민감도를 보유한 프라이머를 제공함에 있다.
본 발명의 목적은, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 병원체의 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하는 프라이머를 제공함에 있다.
본 발명의 목적은, 마이코플라즈마 하이오라이니스를 신속하게 검출하는 방법으로PCR 방법을 적용하되, 마이코플라즈마 하이오라이니스 만을 특이적으로 신속하게 검출할 수 있는 검출키트를 제공함에 있다.
본 발명의 목적은, 돼지의 유행성 폐렴을 진단하기 위해서 병원체인 마이코플라즈마 하이오라이니스를 신속하게 검출하는 방법으로PCR 방법을 적용하되, 돼지 유행성 폐렴을 신속하게 진단할 수 있는 진단키트를 제공함에 있다.
본 발명은, 서열번호 1 및 서열번호 2 의 프라이머 쌍을 포함하는, 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis)를 검출하기 위한 프라이머를 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 상기 마이코플라즈마 하이오라이니스를 검출하되, 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하여 검출하는 것을 특징으로 하는 프라이머를 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 마이코플라즈마 하이오라이니스를 검출하는 키트로서, 상기 프라이머를 포함하는, 마이코플라즈마 하이오라이니스 검출키트를 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은, 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 돼지 유행성 폐렴(SEP)를 진단하는 키트로서, 상기 프라이머를 포함하는, 돼지 유행성 폐렴 진단키트를 제공함으로써, 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에 따른 프라이머는, 6개 종류의 마이코플라즈마 균주들의 102 pg의 DNA 샘플들에서, 마이코플라즈마 하이오라이니스만 특이적으로 반응하는 현저한 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른 프라이머는, 마이코플라즈마 하이오라이니스의 1 pg 이상 DNA 샘플들에서 유의미할 정도로 민감하게 반응하는 현저한 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른 프라이머는, 임상적으로 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의한 돼지의 폐장으로부터, 마이코플라즈마 하이오라이니스를 효과적으로 검출하는 현저한 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른 프라이머는, 마이코플라즈마 하이오라이니스 병원체의 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 함으로써, 특이도 및 민감도를 보유함은 물론 임상적으로 신속하고도 현저하게 마이코플라즈마 하이오라이니스를 검출할 수 있는 현저한 효과를 보유하고 있다.
본 발명은, 농업 축산 분야에서 막대한 피해를 끼치고 있는 돼지 유행성 폐렴의 병원체인 마이코플라즈마 하이오라이니스 병원체를 신속 정확하게 검출하여 조기에 치료 및 전염 예방을 할 수 있는 방법을 제시할 수 있어 양돈 산업에 매우 유익한 효과를 보유하고 있다.
본 발명은 농업 축산 분야뿐만 아니라 의약학 분야에서 수행되는 세포 배양이나 생물의약품의 제조, 보관, 투여, 배양에서 빈번하게 오염되는 마이코플라즈마 병원체를 직접 배양 방법에 의하지 않고 신속하고 정확하게 고민감도로 검출할 수 있어 의약학 및 바이오 생물 산업 분야에도 적용할 수 있는 현저한 효과를 보유하고 있다.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머의 특이도(specificity) 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명에 따른 프라이머의 민감도(sensitivity) 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 유행성 폐렴에 감염된 돼지 및 음성이 확인된 돼지의 폐장으로부터 획득한 임상샘플을 이용하여 마이코플라즈마 하이오라이니스 병원체를 검출한 결과를 나타낸 도면이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참고예, 실험예 및 도면에 도시된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
먼저, 여기에서 "프라이머(primer)"는 중합효소연쇄반응에서 이용되는 타깃 핵산에 인접해 있는 5'말단 서열 및 3'말단 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 의미한다.
또한 "전방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 중합효소연쇄반응에 의해 증폭되는 유전자의 일정 부위의 3'말단 및 5'말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다.
실시예 1. 마이코플라즈마 하이오라이니스를 특이적으로 검출하는 프라이머의 제조
마이코플라즈마 하이오라이니스 게놈서열 중에서 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 함으로써, 마이코플라즈마 하이오라이니스 만을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머를 아래와 같이 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 쌍을 포함하도록 제조한다.
서열번호 1. 전방향 프라이머(Forward primer)
5'-ACT TCG GAG ACC ATT GCC TAA G-3'
(22 mer, 뉴클레오타이드 19731 ∼ 19750)
서열번호 2. 역방향 프라이머(Reverse primer)
5'-AAA GCT CTC AAA ACT AGA CAC GAA-3'
(24 mer, 뉴클레오타이드 19889 ∼ 19866)
상기 프라이머는 ㈜ 바이오니아(대한민국)에 의뢰하여 합성 후 OPC 방법으로 정제하여 사용한다.
실시예 2. 마이코플라즈마 하이오라이니스를 특이적으로 검출하는 방법
(1) 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계
배양된 세포(cultured cell), 또는 돼지 폐렴 조직 등을 시료로 사용하며, 이로부터 DNA를 분리 추출한다.
(2) 실시예 1에서 제조된 마이코플라즈마 하이오라이니스 병원체에 특이적인 프라이머를 준비하는 단계
마이코플라즈마 하이오라이니스 게놈서열 중에서 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하는 프라이머를 준비한다.
(3) 추출된 시료 DNA 및 프라이머를 가지고 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하는 단계
PCR을 위한 반응시약의 조성은, 1㎕ 전방향, 역방향 프라이머 (10 pmol/㎕), 2.5㎕ 10× 반응버퍼, 500 μM 디옥시뉴클레오타이드, 1.5 U Taq 중합효소를 각각 넣고, 25 ㎕의 반응량이 되도록 멸균된 증류수를 첨가하여 섞어 제조한다.
중합효소연쇄반응은 써모사이클러(Thermocycler; ABI, USA)를 이용하여 반응을 실시한다.
반응조건은 95℃에서 5 분(min)간 프리디내츄레이션(pre-denaturation)을 실시 한 후 95℃에서 1 분(min), 62℃에서 1분(min), 72℃에서 1분(min)을 30 주기로 시행하고 마지막으로 72℃에서 3분(min)간 포스트폴리머라이제이션(post-polymerization)을 실시한다.
중합효소 연쇄반응의 산물은 2% 아가로즈겔에 전기영동하여 140 bp의 밴드를 확인한다.
참고예 1. 실험 준비
본 발명의 실시예에 따라 개발된, 마이코플라즈마 하이모라이니스에 특이적인 프라이머의 특이도 및 민감도를 확인하기 위하여 아래와 같이 실험을 준비하였다.
1-1. 마이코플라즈마 균주 준비와 배양
본 발명에 따른 프라이머의 특이도 및 민감도 등을 확인하기 위한 비교 실험을 수행하기 위하여 아래와 같이 총 6 개 종류의 마이코플라즈마 종 별 균주들을 구입하여 배양하였다.
Mycoplasma species
1 Mycoplasma hyorhinis (ATCC strain 27717)
2 Mycoplasma hyopneumoniae (ATCC strain 25934)
3 Mycoplasma pneumoniae (ATCC 15531)
4 Mycoplasma pulmonis (ATCC 19612)
5 Mycoplasma hominis (ATCC 23114)
6 Mycoplasma arthritiditis (ATCC 19611)

상기 마이코플라즈마 균주의 배양은 modified Friis 배지를 이용하여 37 ℃에서 58 rpm으로 10일간 배양하여 13,000 g에서 30분 동안 원심 분리하여 Friss 배지성분을 제거하였다.
1-2. 마이코플라즈마 균주 별 DNA 추출 시료 준비
배양한 각각의 마이코플라즈마 균주들의 DNA 추출은 비드 비터-페놀 추출 방법(bead beater-phenol extraction method)를 사용하였다.
배양된 균주들을 13,000 g에서 30분 동안 원심분리하여 얻은 펠렛 검체를 1 ml 멸균 증류수가 들어있는 Mini-Bead Beater(Biospec product) 전용 2 ml 튜브에 무균 채취하여 세절한 후 멸균 3차 증류수에 부유시킨 glass bead(0.1 mm size, Biospec product) 200 μl와 phenol-chlorform-isoamyl alcohol 용액(50:49:1(v/v/v)) 200μl를 넣어 Mini-Bead Beater(Biospec product)로 30초간 5,000rpm으로 진탕하였다.
진탕 후 4 ℃에서 12,000 rpm으로 15분간 원심 분리한 후 상층액을 멸균 2ml 튜브에 옮겼다.
3 M 초산나트륨(sodium acetate) 10 μl와 ice-cold 에탄올 250μl를 넣어 -20℃에서 10분간 정체시킨 후, 15,000rpm으로 15분간 원심분리 하였다.
침전물은 70% 알코올로 세척하여 실온에서 건조시키고 Tris EDTA(pH 8.0) 60μl에 용해시켜 실험에 사용하였다.
1-3. 중합효소연쇄반응 조건
실시예 1에서 제조된 마이코플라즈마 하이오라이니스 병원체에 특이적인 프라이머를 이용하되, 이는 마이코플라즈마 하이오라이니스 게놈서열 중에서 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하고 있다.
중합효소연쇄반응을 위한 반응시약 조성, 반응을 위한 써모사이클러, 반응조건 및 반응산물의 확인은, 실시예 2와 동일하게 진행한다.
실험예 1. 본 발명에 따른 프라이머의 마이코플라즈마 하이오라이니스에 대한 특이도(specificity) 확인
참고예 1의 실험준비에 따라서, 6개 종류의 마이코플라즈마 균주들인 마이코플라즈마 하이오라이니스(M. hyorhinis), 마이코플라즈마 하이오뉴모니에(M. hyopneumoniae), 마이코플라즈마 뉴모니에(M. pneumoniae), 마이코플라즈마 펄모니스(M. pulmonis), 마이코플라즈마 호미니스(M. hominis), 마이코플라즈마 아쓰라이티디티스(M. arthritiditis) 의 102 pg의 DNA 샘플들을 준비하였다.
샘플들 각각에 대하여, 실시예 1에서 제조된 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis) 게놈서열 중에서 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하는 프라이머를 가지고 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
중합효소연쇄반응의 조건은 실시예 2와 동일하게 진행하였다.
도 1은 본 발명에 따른 프라이머의 특이도(specificity) 실험 결과를 나타낸 도면이고, 이를 표로서 나타낸 것이 다음의 표 2이다.
Mycoplasma species PCR result
1 M. hyorhinis +++
2 M. hyopneumoniae -
3 M. pneumoniae -
4 M. pulmonis -
5 M. hominis -
6 M. arthritiditis -
+++: Strong reaction, -: No reaction
도 1 및 표 2에 나타난 것과 같이, 본 발명에서 개발한 마이코플라즈마 하이오라이니스 게놈서열 중에서 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하는 프라이머는, 1번 균주인 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis) DNA에만 특이적으로 반응하였음을 알 수 있다.
반면에 2번 내지 6번 균주들에 대해서는 반응이 일어나지 않았음을 알 수 있다.
따라서 실험예 1의 결과는, 본 발명에서 개발된 마이코플라즈마 하이오라이니스 게놈서열 중에서 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하는 프라이머가 마이코플라즈마 하이오라이니스에만 특이적으로 반응하는 것이 확인되었다.
실험예 2. 본 발명에 따른 프라이머의 마이코플라즈마 하이오라이니스에 대한 민감도(sensitivity) 확인
참고예 1의 실험준비에 따라, 마이코플라즈마 하이오라이니스 균주의 배양 및 DNA 추출 시료를 준비하였다.
추출된 마이코플라즈마 하이오라이니스는 분광광도계(Spectrophotometer)를 이용하여 DNA 정량을 한 후 단계 희석하여 준비한 정제(purified) 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA 샘플들(102, 10, 1, 0.1 pg) 각각에 대하여 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
실시예 1에서 제조된 마이코플라즈마 하이오라이니스 게놈서열 중에서 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하는 프라이머를 가지고 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
중합효소연쇄반응의 조건은 실시예 2와 동일하게 진행하였다.
도 2는 본 발명에 따른 프라이머의 민감도(sensitivity) 실험 결과를 나타낸 도면이고, 이를 표로서 나타낸 것이 다음의 표 3이다.
Template DNA(pg) 102 10 1 0.1
Positive reaction ++ + + -
+++: Strong band, ++: moderate band, +: mild band, -: No reaction
도 2및 표 3에 나타난 것과 같이, 본 발명에서 개발한 마이코플라즈마 하이오라이니스 게놈서열 중에서 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하는 프라이머는 1 pg 이상의 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA 샘플에서 유의미한 반응이 일어났음을 알 수 있다.
따라서 실험예 2의 결과는, 본 발명에서 개발된 마이코플라즈마 하이오라이니스 게놈서열 중에서 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하는 프라이머는 마이코플라즈마 하이오라이니스에 유의미할 정도로 민감하게 반응하는 것이 확인되었다.
실험예 3. 임상 샘플을 이용한 마이코플라즈마 하이오라이니스 병원체 검출
임상적으로 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의한 유행성 폐렴에 감염된 돼지의 폐장으로부터 본 발명으로 개발한 프라이머의 효용성을 확인하고자, 임상샘플을 이용한 마이코플라즈마 병원체 검출 실험을 수행하였다.
전북 익산에 소재하고 있는 도축장에서 도축전 혈액 검사를 통하여 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염이 확인된 돼지로부터 육안적으로 폐렴이 확인된 폐장의 일부를 무균 채취하였다.
또한 도축전 혈액 검사를 통하여 음성인 돼지로부터 폐장의 일부를 무균 채취하였다.
참고예 1의 DNA 추출 시료 준비와 동일한 과정을 수행하여, DNA 샘플을 준비하되, 유행성 폐렴에 감염된 돼지의 DNA 샘플을 3개, 음성인 돼지의 DNA 샘플을 3개 준비하였다.
DNA 샘플 각각에 대하여, 실시예 1에서 제조된 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis) 게놈서열 중에서 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하는 프라이머를 가지고 중합효소연쇄반응을 수행하였다.
중합효소연쇄반응의 조건은 실시예 2와 동일하게 진행하였다.
도 3은 유행성 폐렴에 감염된 돼지 및 음성이 확인인 돼지의 폐장으로부터 획득한 임상샘플을 이용하여 마이코플라즈마 하이오라이니스 병원체를 검출한 결과를 나타낸 도면이고, 이를 표로 나타낸 것이 표 4이다.
Clinical samples (Lung) PCR result
No. 1(sero-positive) +
No. 2(sero-positive) ++
No. 3(sero-positive) +++
No. 4(sero-negative) -
No. 5(sero-negative) -
No. 6(sero-negative) -
++: Strong reaction, -: No reaction
도 3 및 표 4에 나타난 것과 같이, 본 발명에서 개발한 마이코플라즈마 하이오라이니스 게놈서열 중에서 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하는 프라이머는 임상적으로 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의한 돼지 유행성 폐렴에 감염된 돼지의 폐장으로부터 마이코플라즈마 하이오라이니스를 검출할 수 있었다.
반면에 도축 전 혈청 검사에서 음성인 개체인 No. 4, 5, 6의 돼지 폐장 조직에서는 마이코플라즈마 하이오라이니스를 검출할 수 없었다.
따라서 본 발명에서 개발한 마이코플라즈마 하이오라이니스 게놈서열 중에서 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하는 프라이머는 임상적으로 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의한 돼지 유행성 폐렴에 감염된 돼지의 폐장으로부터 마이코플라즈마 하이오라이니스를 효과적으로 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실험예 1 내지 실험예 3을 총괄하여 정리하여 보면, 6개 종류의 마이코플라즈마 균주들의 102 pg의 DNA 샘플들에서, 본 발명의 실시예 1에 따른 프라이머는 마이코플라즈마 하이오라이니스에만 특이적으로 반응하였음이 확인되었다.
또한 마이코플라즈마 하이오라이니스의 1 pg 이상 DNA 샘플들에서, 본 발명의 실시예 1에 따른 프라이머가 유의미할 정도로 민감하게 반응하였음이 확인되었다.
또한 임상적으로 마이코플라즈마 하이오라이니스 감염에 의한 돼지의 폐장으로부터, 본 발명의 실시예 1에 따른 프라이머는 마이코플라즈마 하이오라이니스를 효과적으로 검출하였음이 확인되었다.
따라서 본 발명의 실시예 1에 따른 프라이머는 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis) 게놈서열 중에서 종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 함으로써, 특이도 및 민감도가 매우 향상됨은 물론 임상적으로 신속하고도 현저하게 마이코플라즈마 하이오라이니스를 검출할 수 있다고 할 수 있겠다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (4)

  1. 서열번호 1 및 서열번호 2 의 프라이머 쌍을 포함하되,
    종(species)에 특이적인 16s rRNA와 23s rRNA 사이 영역을 표적으로 하고,
    1 pg 이상 DNA 샘플에서 민감도를 보유하는,
    마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis)를 검출하기 위한 프라이머 세트.
  2. 삭제
  3. 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 마이코플라즈마 하이오라이니스 (Mycoplasma hyorhinis)를 검출하는 키트로서,
    청구항 1의 프라이머 세트를 포함하는, 마이코플라즈마 하이오라이니스 검출키트.
  4. 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 돼지 유행성 폐렴(SEP)를 진단하는 키트로서,
    청구항 1의 프라이머 세트를 포함하는, 돼지 유행성 폐렴 진단키트.
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