KR20150092834A - 다종의 마이코플라즈마 속 세균의 동시 검출을 위한 다중 진단 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 방법 및 키트 - Google Patents
다종의 마이코플라즈마 속 세균의 동시 검출을 위한 다중 진단 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 방법 및 키트 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 다종의 마이코플라즈마 속 세균의 동시 검출을 위한 마이코플라즈마 다중 진단 프라이머 세트(primer set), 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 방법 및 키트에 관한 것으로, 구체적으로는 마이코플라즈마 컨센서스, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 프라이머 세트의 반응 조건을 동일화하는 방법으로 제작된 것을 특징으로 하는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 키트 및 방법에 관한 것이다.
본 발명은 마이코플라즈마 펄모니스의 종(species) 특이적 영역인 프로테인(protein) 16s rRNA 영역, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 종 특이적 영역인 프로테인 P97 영역, 마이코플라즈마 하이오라이니스의 종 특이적 영역인 프로테인 16s rRNA ~ 23s rRNA 영역을 표적으로 하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명은 마이코플라즈마 속 세균에만 특이성이 있는 효과 및 다종의 마이코플라즈마 속 세균을 동시에 검출할 수 있는 효과를 보유하고 있다.
본 발명은 돼지 유행성 폐렴, 닭 만성호흡기질병, 칠면조 마이코플라즈마 감염증, 마이코플라즈마 폐렴, 마이코플라즈마성 요도염 및 마이코플라즈마성 질염을 진단할 수 있는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명은 마이코플라즈마 펄모니스의 종(species) 특이적 영역인 프로테인(protein) 16s rRNA 영역, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 종 특이적 영역인 프로테인 P97 영역, 마이코플라즈마 하이오라이니스의 종 특이적 영역인 프로테인 16s rRNA ~ 23s rRNA 영역을 표적으로 하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명은 마이코플라즈마 속 세균에만 특이성이 있는 효과 및 다종의 마이코플라즈마 속 세균을 동시에 검출할 수 있는 효과를 보유하고 있다.
본 발명은 돼지 유행성 폐렴, 닭 만성호흡기질병, 칠면조 마이코플라즈마 감염증, 마이코플라즈마 폐렴, 마이코플라즈마성 요도염 및 마이코플라즈마성 질염을 진단할 수 있는 것을 특징으로 하고 있다.
Description
본 발명은 마이코플라즈마 속 세균, 즉 마이코플라즈마(Mycoplasma)의 다중 검출을 위한 마이코플라즈마 다중 진단 프라이머 세트(primer set), 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 방법 및 키트에 관한 것으로, 구체적으로는 마이코플라즈마 컨센서스, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 프라이머 세트의 반응 조건을 동일화하는 방법으로 제작된 것을 특징으로 하는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 키트 및 방법에 관한 것이다.
본 발명은 마이코플라즈마 펄모니스의 종(species) 특이적 영역인 프로테인(protein) 16s rRNA 영역, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 종 특이적 영역인 프로테인 P97 영역, 마이코플라즈마 하이오라이니스의 종 특이적 영역인 프로테인 16s rRNA ~ 23s rRNA 영역을 표적으로 하는 것을 특징으로 하고 있다.
본 발명은 마이코플라즈마 속 세균에만 특이성이 있는 효과 및 다종의 마이코플라즈마 속 세균을 동시에 검출할 수 있는 효과를 보유하고 있다.
본 발명은 돼지 유행성 폐렴, 닭 만성호흡기질병, 칠면조 마이코플라즈마 감염증, 마이코플라즈마 폐렴, 마이코플라즈마성 요도염 및 마이코플라즈마성 질염을 진단할 수 있는 것을 특징으로 하고 있다.
마이코플라즈마 속 세균(Mycoplasma genus) 세균은 분류학적으로 몰리큐트 강(Mollicutes class)에 속하는 원핵세균으로, 현재까지 수백여 종(species)이 알려져 있다. 크기가 약 0.15~0.8 ㎛이며 세포벽이 없는 세균이다.
마이코플라즈마 속 세균은 상기 언급한 바와 같이 크기가 약 0.15~0.8 ㎛으로 작기 때문에 여과가 용이하지 않으며, 세포벽이 없으므로 페니실린, 스트렙토마이신 등 세포벽 합성을 저해하는 항생제에 내성이 있어 멸균 역시 용이하지 않다. 또한 마이코플라즈마 속 세균은 형태학적으로도 다형적(pleomorphic)이므로 관찰을 이용한 동정이 용이하지 않다.
마이코플라즈마 속 세균은 인간 및 동물의 호흡기, 생식기 등 각종 장기에 상주하며 다양한 질병을 일으키는 병원체로서 문제가 되어 왔으며, 최근에는 실험실에서 세포 배양시 및 의약품의 제조 또는 보관시에 빈번하게 세포 또는 의약품을 오염시키는 오염체로서 문제가 되고 있다.
특히 세포가 배양 중에 마이코플라즈마 속 세균에 오염되면 세포의 증식 속도가 저하됨과 동시에 세포 기능에 심각한 변화가 발생할 수 있는데, 세포 배양시의 마이코플라즈마 속 세균 오염률은 30 ~ 87%에 달한다.
따라서 수의학적 및 의약학적 측면에서, 인간 및 동물의 마이코플라즈마 속 세균 감염 여부와 실험실의 배양 세포 및 의약품 등의 마이코플라즈마 속 세균 오염 여부를 진단하는 것은 매우 중요하다 하겠다.
그러나 마이코플라즈마 속 세균은 분리가 용이하지 않으며, 배양 조건이 특수하고 등 배양에만 2주 이상이 소요된다.
또한 마이코플라즈마 속 세균의 각 종(species)에 따라 배양 기법이 각각 상이한데, 마이코플라즈마 속 세균은 수백 종에 이르므로, 마이코플라즈마 속 세균의 진단에는 오랜 시간과 노력이 소모되고 있는 실정이다.
마이코플라즈마 속 세균의 검출을 위해 통상적으로 사용되어 온 방법으로써 직접배양법을 들 수 있으나, 직접배양법은 세포 또는 조직 배양시 기질 및 생체 재료에 오염이 쉽게 된다.
더불어 통상적으로는 마이코플라즈마 속 세균에 오염이 되었을시 세포의 형태 변이, 배양용 배지의 색깔 변이 등의 증상이 나타나나, 때로 증상이 나타나지 않을 수도 있다. 따라서 직접배양법으로는 마이코플라즈마 속 세균의 검출 및 진단이 정확하지 않다.
따라서 마이코플라즈마 속 세균의 감염이나 오염 여부를 신속하게 한 번의 작업으로 검출할 수 있는 기술이 절실하다.
최근에는 마이코플라즈마 속 세균을 신속하게 동정하기 위한 방법들로서 DNA 플루오로크롬(fluorochrome) 염색법, 효소면역법, 형광염색법, 생화학 검사법 및 DNA 프로브(probe)기법 등 다양한 방법 등이 모색되고 있다.
최근 도입되는 마이코플라즈마 속 세균의 검출 방법 중에서 가장 선호되는 방법은 유전물질인 핵산을 증폭하는 중합효소연쇄반응 (PCR; polymerase chain reaction)이다. PCR은 생체 내에 존재하는 적은 양의 DNA를 분리하여 주형으로 사용하고 표적 DNA 서열의 양 말단에 상보적인 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)를 프라이머 세트(primer set)로 이용하여 표적 DNA 단편만을 짧은 시간 안에 수십만 배 이상 증폭시키는 기법이다.
이러한 PCR을 이용한 유전자 증폭방법을 이용하면 마우스 폐 병변, 점막 세포 및 조직을 체외 조작할시 또는 배양할시 고빈도로 오염되는 마이코플라즈마 속 세균을 신속하고 정확하게 검출할 수 있다. 그러나 아직까지 상기 마이코플라즈마 속 세균을 다중진단할 수 있는 프라이머의 조합은 보고된 바 없다.
한편 본 출원인은 본 발명에 앞서 마이코플라즈마 속 세균을 검출하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 속 세균 검출 방법 및 키트(대한민국 등록특허공보 제10-1279396호), 마이코플라즈마 하이오뉴모니에를 검출하기 위한 프라이머, 상기 프라이머를 이용한 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 검출키트 및 방법, 및 상기 프라이머를 이용한 돼지 유행성 폐렴 진단키트 및 방법(대한민국 등록특허공보 제10-1329114호)과, 마이코플라즈마 하이오라이니스를 검출하기 위한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 하이오라이니스 검출 키트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 돼지 유행성 폐렴 진단키트(대한민국 등록특허공보 제10-1279395호)를 출원한 바 있다.
본 출원인은 상기 기재된 발명을 출원한 후 연구를 더욱 진행하여 마이코플라즈마 속 세균, 특히 마이코플라즈마 하이오뉴모니에(Mycoplasma hyopneumoniae), 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis ) 및 마이코플라즈마 펄모니스(Mycoplasma pulmonis)에 특이적인 영역을 표적으로 하는 프라이머를 개발하고 상기 프라이머들의 중합효소 반응 조건을 동일화함으로써 마이코플라즈마 속 세균 특히 마이코플라즈마 하이오뉴모니에, 마이코플라즈마 하이오라이니스 및 마이코플라즈마 펄모니스를 특이적으로 신속하게 동시 진단할 수 있는 방법을 제공할 수 있다고 판단하여 본 발명을 안출하였다.
본 발명과 관련된 선행 문헌을 살펴보면, 대한민국 등록특허공보 제10-0974861호에는 생물학적 의약품으로부터 마이코플라즈마 속 세균을 검출하기 위한 PCR 프라이머 세트 및 이를 포함하는 마이코플라즈마 속 세균 검출용 키트에 관하여 기재되어 있으며, 대한민국 공개특허공보 제10-2013-0047122호에는 리얼타임 PCR을 이용하여 세포 배양물 내의 마이코플라즈마 속 세균 오염을 검출하는 방법 및 키트에 관하여 기재되어 있다.
또한 대한민국 공개특허공보 제10-2012-0107983호에는 마이코플라즈마 뉴모니에 및/또는 마이코플라즈마 제니탈륨에 속하는 미생물을 검출하는 방법에 관하여 기재되어 있다.
상기 선행 문헌들은 모두 마이코플라즈마 속 세균 검출 프라이머를 이용한 검출 방법에 관한 것이나, 2종 이하의 미생물을 마이코플라즈마 속 세균 중 다종을 동시에 검출하는 기술에 관하여는 기재되어 있지 않았다.
따라서 본 발명은 국내에서 시도되지 않은 신규한 발명이라 할 수 있겠다.
본 발명의 목적은 마이코플라즈마 속 세균의 다중 검출을 위한 마이코플라즈마 다중 진단 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 방법 및 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 마이코플라즈마 속 세균에만 특이성이 있는 효과 및 다종의 마이코플라즈마 속 세균을 동시에 검출할 수 있는 효과를 보유한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 키트 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 마이코플라즈마 속 세균으로 인하여 유발된 질병을 진단할 수 있는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 키트 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 마이코플라즈마 컨센서스, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 프라이머 세트의 반응 조건을 동일화하는 방법으로 제작된 것을 특징으로 하는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 속 세균 다중 진단 키트 및 방법을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 마이코플라즈마 펄모니스의 종(species) 특이적 영역인 프로테인(protein) 16s rRNA 영역, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 종 특이적 영역인 프로테인 P97 영역, 마이코플라즈마 하이오라이니스의 종 특이적 영역인 프로테인 16s rRNA ~ 23s rRNA 영역을 표적으로 하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 키트 및 방법을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 마이코플라즈마 속 세균에만 특이성이 있는 효과 및 다종의 마이코플라즈마 속 세균을 동시에 검출할 수 있는 효과를 보유한 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 키트 및 방법을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명은 돼지 유행성 폐렴, 닭 만성호흡기질병, 칠면조 마이코플라즈마 감염증, 마이코플라즈마 폐렴, 마이코플라즈마성 요도염 및 마이코플라즈마성 질염을 진단할 수 있는 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 키트 및 방법을 제공함으로써 기술적 과제를 해결하고자 한다.
본 발명에 따른 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 키트는 마이코플라즈마 펄모니스(Mycoplasma pulmonis), 마이코플라즈마 하이오뉴모니에(Mycoplasma hyopneumoniae), 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis)를 포함하는 마이코플라즈마 속 세균을 원-스텝(One-step)으로 신속하게 검출하는 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른 마이코플라즈마 다중 진단 키트는 마이코플라즈마 속 세균이 유발하는 질병인 돼지 유행성 폐렴, 닭 만성호흡기질병, 칠면조 마이코플라즈마 감염증, 마이코플라즈마 폐렴, 마이코플라즈마성 요도염 및 마이코플라즈마성 질염을 진단할 수 있어 의약학 분야에서의 활용도가 높은 효과를 보유하고 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트 및 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 키트는 세포 배양 또는 생물의약품의 제조, 보관, 투여 및 배양 과정 등에서 오염률이 높은 마이코플라즈마 속 세균을 원-스텝(One-step)으로 신속하게 검출하여 의약학 및 분자생물학 분야에서의 활용도가 높은 효과를 보유하고 있다.
도 1은 마이코플라즈마 속 세균 3종과 비교 균주인 헬리코박터 파이로리의 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다. (1:헬리코박터 파이로리 DNA, 2:마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA, 3:마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 4:마이코플라즈마 펄모니스 DNA)
도 2는 마이코플라즈마 속 세균 9종의 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다. (1: 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA, 2: 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 3: 마이코플라즈마 뉴모니에 DNA, 4: 마이코플라즈마 호미니스 DNA, 5: 마이코플라즈마 펄모니스 DNA, 6: 마이코플라즈마 아스라이티디티스 DNA, 7: 마이코플라즈마 보비스 DNA, 8: 마이코플라즈마 플루쿠라레 DNA, 9: 마이코플라즈마 마이코이데스 DNA)
도 3은 농도를 각각 달리 한 마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.(1: 103 pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA, 2: 102 pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA, 3: 10 pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA, 4: 1 pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA)
도 4는 돼지 유행성 폐렴에 감염된 돼지의 폐장으로부터 채취한 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 임상 샘플 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.(1: No. 1(sero-positive), 2: No. 2(sero-positive), 3: No.3(sero-positive), 4: No.4(sero-positive), 5: No.5(sero-positive), 6: No.6(sero-positive))
도 5는 농도를 각각 달리 한 마이코플라즈마 하이오라이니스의 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.(1: 102 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 2: 10 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 3: 1 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 4: 0.1 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA)
도 6은 돼지 유행성 폐렴에 감염된 돼지의 폐장으로부터 채취한 마이코플라즈마 하이오라이니스 임상 샘플 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.(1: No. 1(sero-positive), 2: No. 2(sero-positive), 3: No.3(sero-positive), 4: No.4(sero-positive), 5: No.5(sero-positive), 6: No.6(sero-positive))
도 7은 마이코플라즈마 속 세균 3종과 비교 균주인 살모넬라 티피넬리움의 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다. (1:살모넬라 티피넬리움 DNA, 2:마이코플라즈마 펄모니스 DNA, 3:마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 4:마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA)
도 2는 마이코플라즈마 속 세균 9종의 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다. (1: 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA, 2: 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 3: 마이코플라즈마 뉴모니에 DNA, 4: 마이코플라즈마 호미니스 DNA, 5: 마이코플라즈마 펄모니스 DNA, 6: 마이코플라즈마 아스라이티디티스 DNA, 7: 마이코플라즈마 보비스 DNA, 8: 마이코플라즈마 플루쿠라레 DNA, 9: 마이코플라즈마 마이코이데스 DNA)
도 3은 농도를 각각 달리 한 마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.(1: 103 pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA, 2: 102 pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA, 3: 10 pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA, 4: 1 pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA)
도 4는 돼지 유행성 폐렴에 감염된 돼지의 폐장으로부터 채취한 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 임상 샘플 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.(1: No. 1(sero-positive), 2: No. 2(sero-positive), 3: No.3(sero-positive), 4: No.4(sero-positive), 5: No.5(sero-positive), 6: No.6(sero-positive))
도 5는 농도를 각각 달리 한 마이코플라즈마 하이오라이니스의 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.(1: 102 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 2: 10 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 3: 1 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 4: 0.1 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA)
도 6은 돼지 유행성 폐렴에 감염된 돼지의 폐장으로부터 채취한 마이코플라즈마 하이오라이니스 임상 샘플 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.(1: No. 1(sero-positive), 2: No. 2(sero-positive), 3: No.3(sero-positive), 4: No.4(sero-positive), 5: No.5(sero-positive), 6: No.6(sero-positive))
도 7은 마이코플라즈마 속 세균 3종과 비교 균주인 살모넬라 티피넬리움의 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다. (1:살모넬라 티피넬리움 DNA, 2:마이코플라즈마 펄모니스 DNA, 3:마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 4:마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA)
본 명세서 및 청구 범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
따라서 본 명세서에 기재된 실시예, 참조예 및 도면에 기술된 사항은 본 발명의 가장 바람직한 일 예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
실시예
1.
마이코플라즈마
다중 진단
프라이머
세트 제작
병원체의 PCR 진단을 위한 프라이머의 개발에 있어 중요한 점은, 모든 마이코플라즈마 속 세균 계통 및 분리주를 검출할 수 있어야 한다는 것이다.
이를 위하여 검출 대상 마이코플라즈마 속 세균의 모든 계통 및 분리주에 있어서 공통되는 염기서열을 대상으로 프라이머를 설계하여야 한다.
(1) 시료(sample)로부터 DNA를 추출하는 단계
본 발명의 시료는 배양된 세포(cultured cell), 또는 돼지 폐렴 조직 등에서 DNA를 분리할 수 있다.
(2) 중합효소 연쇄반응을 수행하는 단계
상기 추출된 시료의 DNA에, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에, 마이코플라즈마 하이오라이니스 병원체에 특이적인 프라이머 세트(primer set)를 사용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한다.
상기 "프라이머(primer)"는 중합효소 연쇄반응에서 이용되는 타깃 핵산에 인접해 있는 5'말단 서열 및 3'말단 서열에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 의미한다.
또한 "전방향(forward) 프라이머" 및 "역방향(reverse) 프라이머"는 중합효소연쇄반응에 의해 증폭되는 유전자의 일정 부위의 3'말단 및 5'말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.
1) 프라이머 세트 준비
마이코플라즈마 컨센서스, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 및 마이코플라즈마 하이오라이니스의 프라이머 세트를 각각 준비한다.
서열번호 1 및 2는 마이코플라즈마 컨센서스 프라이머 세트의 염기서열이며, 3 및 4는 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 프라이머 세트의 염기서열이다. 또한 5 및 6은 마이코플라즈마 하이오라이니스 프라이머 세트의 염기서열이다.
서열번호 1.
마이코플라즈마
컨센서스
전방향
프라이머
(
forward
primer
)
5'-GGC GAA TGG GTG AGT AAC ACG-3'
(21 mer, 뉴클레오타이드 543 ~ 522)
서열번호 2.
마이코플라즈마
컨센서스
역방향
프라이머
(
reverse
primer
)
5'-CGG ATA ACG CTT GCG ACC TAT G-3'
(22 mer, 뉴클레오타이드 81 ~ 101)
서열번호 3.
마이코플라즈마
하이오뉴모니에
전방향
프라이머
(
forward
primer
)
5'-AGA TCT TAG TCA AAG TGC CCG T-3'
(22 mer, 뉴클레오타이드 241773 ~ 241793)
서열번호 4.
마이코플라즈마
하이오뉴모니에
역방향
프라이머
(
reverse
primer
)
5'-TCT GCC TTG GTA TGA CTG GAT C-3'
(22 mer, 뉴클레오타이드 242033 ~ 242012)
서열번호 5.
마이코플라즈마
하이오라이니스
전방향
프라이머
(
forward
primer
)
5'-ACT TCG GAG ACC ATT GCC TAA G-3'
(22 mer, 뉴클레오타이드 19894 ~ 19915)
서열번호 6.
마이코플라즈마
하이오라이니스
역방향
프라이머
(
reverse
primer
)
5'-AAA GCT CTC AAA AAC TAG ACA CGA A-3'
(25 mer, 뉴클레오타이드 20053 ~ 20030)
상기 프라이머는 합성 후 OPC 방법으로 정제하여 사용한다.
2) PCR 용액의 제조
PCR 용액 제조 방법은 다음과 같다.
① 1㎕ 전방향, 역방향 프라이머 (10 pmol/㎕), 2.5㎕ 10× 반응버퍼, 500 μM 디옥시뉴클레오타이드, 1.5 U Taq 중합효소를 각각 주입하여 PCR 용액을 제조한다.
② ①의 PCR 용액의 총 반응량이 25㎕가 되도록 멸균된 증류수를 혼합한 후, 써모 사이클러(Thermocycler; ABI, USA)를 이용하여 중합효소 연쇄반응을 수행한다.
3) 마이코플라즈마 다중 중합효소 반응 조건의 동일화
마이코플라즈마 속 세균의 다중 검출하기 위하여, 모든 마이코플라즈마 속 세균 프라이머의 중합효소 반응 조건을 동일화한다.
하기 [표 1]은 본 실험에서 수행된 반응조건을 나타낸 것이다.
| 주기 단계 |
과정 | 주기 |
|
| 온도 | 시간 | ||
| 프리-디내츄레이션(pre-denaturation) | 95℃ | 1분 | 1 |
| 디내츄레이션(denaturation) | 95℃ | 1분 | 30 |
| 어닐링(annealing) | 60℃ | 1분 | |
| 익스텐션(extension) | 72℃ | 1분 | |
| 포스트-폴리머라이제이션(post-polymerization) | 72℃ | 1분 | 1 |
증폭할 각 DNA의 크기가 중복되지 않도록 프라이머 세트의 Tm 값을 유사하게 하고, 전체 증폭 DNA는 100bp ~ 1000bp 미만이 되도록 하며, 증폭 반응시 어닐링 온도는 59℃ 이상이 되게 하여 비특이적 반응을 최소화시킴으로써 반응조건을 최적화한다.
4) 중합효소 연쇄반응 수행
앞서 구축한 조건에 따라 중합효소 연쇄반응을 수행한다.
실험예
1. 다중 검출
프라이머
세트의 종 특이도 확인(1)
실시예 1에 기재된 과정으로 제작된 마이코플라즈마 다중 검출 프라이머 세트의 특이도를 확인하기 위하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.
편의상 실험예의 제목에는 '다중 검출 프라이머 세트'로 표기하였음을 밝혀둔다.
또한 실험예 1 이하 수행된 모든 실험예에서의 실험 준비 및 실험 과정은 실험예 1에 기재된 과정과 동일하게 수행되었음을 밝혀둔다. 단, 실험 대상은 각각 상이하게 설정되었다.
(1) 실험 준비
1) 마이코플라즈마 속 균주 및 비교 균주의 준비와 배양
모디파이드 프리스(modified Friis) 배지(Zhang 등, 1994)를 이용하여 37 ℃에서 58 rpm으로 1주일간 배양하여 13,000 g에서 30분 동안 원심분리하여 프리스 배지 성분을 제거하였다.
마이코플라즈마 속 균주로는 마이코플라즈마 하이오뉴모니에, 마이코플라즈마 하이오라이니스 및 마이코플라즈마 펄모니스를 사용하였으며, 비교 균주로는 헬리코박터 파이로리를 사용하였다.
(2) 실험 과정
1) 마이코플라즈마 균주별 DNA 추출 시료 준비
배양된 각 마이코플라즈마 균주들의 DNA를 추출한다.
DNA 추출은 비드 비터-페놀 엑스트랙션 메소드(bead beater-phenol extraction method)로 수행되었다.
배양된 균주들을 12,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하여 펠렛 검체를 수득하였다.
수득된 펠렛 검체를 1 ml 멸균 증류수가 들어있는 미니-비드 비터(Mini-Bead Beater)(Biospec product) 전용 2 ml 튜브에 무균 채취하여 세절하였다.
세절된 펠렛 검체를 멸균 3차 증류수에 부유시킨 글라스 비드(glass bead)(0.1 mm size, Biospec product) 200 μl와 페놀-클로로포름-아이소아밀-알콜(phenol-chlorform-isoamyl alcohol) 용액(50:49:1(v/v/v)) 200 μl를 넣어 미니-비드-비터로 30초간 5,000rpm으로 진탕하였다.
진탕한 펠렛 검체를 4 ℃에서 12,000 rpm으로 15분간 원심분리한 후 상층액을 멸균 2 ml 튜브에 옮겼다.
3 M 초산나트륨(sodium acetate) 10 μl와 아이스-콜드 에탄올 250 μl를 넣어 -20℃에서 10분간 정체시킨 후, 15,000 rpm으로 15분간 원심분리 하였다.
침전물은 70% 알코올로 세척하여 실온에서 건조시키고 트리스(Tris) EDTA(pH 8.0) 60 μl에 용해시켜 실험에 사용하였다.
2) 프라이머 세트 제작 및 PCR 용액 제조
프라이머 세트 제작 및 PCR 용액의 제조 방법은 실시예 1에 기재된 사항과 동일하게 수행되었다.
반응조건 역시 실시예 1의 [표 1]에 기재된 사항과 동일하게 수행되었다.
(3) 실험 결과
하기의 [표 2]는 마이코플라즈마 속 세균 3종과 비교 균주인 헬리코박터 파이로리가 다중 검출 프라이머 세트에 반응한 결과를 나타낸 것이다.
| 종(species) | PCR 결과 | |
| 1 | Helicobacter pylori | - |
| 2 | M. hyopnenmoniae | ++ |
| 3 | M. hyorhinis | ++ |
| 4 | M. pulmonis | ++ |
실험 결과, 마이코플라즈마 속 세균에 속하는 마이코플라즈마 펄모니스, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA 샘플들에만 특이적으로 반응이 발생하였으며, 마이코플라즈마 속 세균에 속하지 않는 헬리코박터 파이로리 DNA 샘플에서는 반응이 발생하지 않았음을 확인할 수 있었다.
도 1은 마이코플라즈마 속 세균 3종과 비교 균주인 헬리코박터 파이로리의 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다. (1: 헬리코박터 파이로리 DNA, 2: 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA, 3: 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 4: 마이코플라즈마 펄모니스 DNA)
실험 결과, 1번 레인(lane)의 헬리코박터 파이로리에서는 밴드가 관찰되지 않았으며, 2번 레인의 마이코플라즈마 펄모니스, 3번 레인의 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 및 4번 레인의 마이코플라즈마 하이오라이니스에서는 밴드가 관찰되었음을 알 수 있다.
이로써, 본 발명의 마이코플라즈마 다중 진단 프라이머 세트는 마이코플라즈마 속 세균에만 특이적으로 반응함은 물론, 3종 이상의 마이코플라즈마 세균에 동시적으로 반응하여 검출이 가능하다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예
2. 다중 검출
프라이머
세트의
마이코플라즈마
속 세균에 대한 민감도 확인
실험 대상으로는 마이코플라즈마 하이오뉴모니에, 마이코플라즈마 하이오라이니스, 마이코플라즈마 뉴모니에, 마이코플라즈마 호미니스, 마이코플라즈마 펄모니스, 마이코플라즈마 아스라이티디티스, 마이코플라즈마 보비스, 마이코플라즈마 플루쿠라레, 마이코플라즈마 마이코이데스를 사용하였다.
(1) 실험 결과
하기의 [표 3]은 마이코플라즈마 속 세균의 민감도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
| Mycoplasma 속 세균 | PCR 결과 | |
| 1 | Mycoplasma hyopneumoniae | + |
| 2 | Mycoplasma hyorhinis | + |
| 3 | Mycoplasma pneumoniae | +++ |
| 4 | Mycoplasma hominis | +++ |
| 5 | Mycoplasma pulmonis | ++ |
| 6 | Mycoplasma arthritiditis | + |
| 7 | Mycoplasma bovis | + |
| 8 | Mycoplasma fluccurare | +++ |
| 9 | Mycoplasma mycoides | ++ |
실험 결과, 마이코플라즈마 뉴모니에, 마이코플라즈마 호미니스 및 마이코플라즈마 플루쿠라레에서 민감도가 강하였으며, 마이코플라즈마 펄모니스 및 마이코플라즈마 마이코이데스에서는 민감도가 중간 정도였다. 마이코플라즈마 아스라이티디티스 및 마이코플라즈마 보비스에서는 민감도가 약하였다.
도 2는 마이코플라즈마 속 세균 9종의 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다. (1: 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA, 2: 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 3: 마이코플라즈마 뉴모니에 DNA, 4: 마이코플라즈마 호미니스 DNA, 5: 마이코플라즈마 펄모니스 DNA, 6: 마이코플라즈마 아스라이티디티스 DNA, 7: 마이코플라즈마 보비스 DNA, 8: 마이코플라즈마 플루쿠라레 DNA, 9: 마이코플라즈마 마이코이데스 DNA)
실험 결과, 1~9번 레인 모두에서 밴드가 관찰되었으며, 특히 마이코플라즈마 뉴모니에, 마이코플라즈마 호미니스, 마이코플라즈마 플루쿠라레 및 마이코플라즈마 마이코이데스에서 밴드의 농도가 높은 것을 관찰할 수 있었다.
마이코플라즈마 하이오뉴모니에, 마이코플라즈마 펄모니스 및 마이코플라즈마 아스라이티디티스의 밴드의 농도는 중간 정도였으며, 마이코플라즈마 하이오라이니스 및 마이코플라즈마 보비스의 밴드의 농도는 낮았다.
이로써, 본 발명의 마이코플라즈마 다중 검출 프라이머 세트는 마이코플라즈마 속 세균의 다중 검출이 가능하다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예
3. 다중 검출
프라이머
세트의
마이코플라즈마
하이오뉴모니에에
대한 민감도 확인
실험 대상으로는 103pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에, 102pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에, 10pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에, 1pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에를 사용하였다.
(1) 실험 결과
하기의 [표 4]는 농도를 각각 달리 한 마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 민감도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
| template DNA(pg) |
103 | 102 | 10 | 1 |
| Positive reaction | +++ | ++ | + | - |
실험 결과, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA의 농도를 1, 10, 102, 103으로 높일 수록 민감도가 높아짐을 확인할 수 있었다.
도 3은 농도를 각각 달리 한 마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.(1: 103 pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA, 2: 102 pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA, 3: 10 pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA, 4: 1 pg 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA)
실험 결과, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA의 농도를 1, 10, 102, 103으로 높일 수록 밴드의 농도가 높아짐을 확인할 수 있었다.
이로써, 본 발명의 마이코플라즈마 다중 진단 프라이머 세트는 마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 DNA의 농도에 따라 반응하는 정도가 다르다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예
4. 다중 검출
프라이머
세트의
마이코플라즈마
하이오뉴모니에
임상 샘플에 대한 민감도 확인
실험 대상으로는 돼지 유행성 폐렴에 감염된 돼지의 폐장에서 추출한 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 임상 샘플 No.1~6(sero-positive)을 사용하였다.
(1) 실험 결과
하기의 [표 5]는 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 임상 샘플의 민감도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
| 임상 샘플 | PCR 결과 |
| No. 1(sero-positive) | ++ |
| No. 2(sero-positive) | ++ |
| No. 3(sero-positive) | ++ |
| No. 4(sero-positive) | ++ |
| No. 5(sero-positive) | - |
| No. 6(sero-positive) | - |
실험 결과, No.5~6을 제외한 모든 임상 샘플에서 반응이 발생하였음을 확인할 수 있었다.
도 4는 돼지 유행성 폐렴에 감염된 돼지의 폐장으로부터 채취한 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 임상 샘플 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.(1: No. 1(sero-positive), 2: No. 2(sero-positive), 3: No.3(sero-positive), 4: No.4(sero-positive), 5: No.5(sero-positive), 6: No.6(sero-positive))
실험 결과, 1~4번 레인의 임상 샘플에서는 밴드의 농도가 높게 관찰되었으며, 5~6번 레인의 임상 샘플에서는 밴드가 관찰되지 않았음을 확인할 수 있었다.
이로써, 본 발명의 마이코플라즈마 다중 검출 프라이머 세트는 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 임상 샘플에도 반응하는바, 실질적 검출 대상인 동물에서도 마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 검출이 가능한 것을 알 수 있다.
실험예
5. 다중 검출
프라이머
세트의
마이코플라즈마
하이오라이니스에
대한 민감도 확인
실험 대상으로는 102 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스, 10 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스, 1 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스, 0.1 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스를 사용하였다.
(1) 실험 결과
하기의 [표 6]은 농도를 각각 달리 한 마이코플라즈마 하이오라이니스의 민감도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
| template DNA(pg) |
102 | 10 | 1 | 0.1 |
| Positive reaction | +++ | ++ | + | - |
실험 결과, 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA의 농도를 0.1, 1, 10, 102으로 높일 수록 민감도가 높아짐을 확인할 수 있었다.
도 5는 농도를 각각 달리 한 마이코플라즈마 하이오라이니스의 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.(1: 102 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 2: 10 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 3: 1 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 4: 0.1 pg 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA)
실험 결과, 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA의 농도를 0.1, 1, 10, 102으로 높일 수록 밴드의 농도가 높아짐을 확인할 수 있었다.
이로써, 본 발명의 마이코플라즈마 다중 진단 프라이머 세트는 마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 DNA의 농도에 따라 반응하는 정도가 다른 것을 알 수 있다.
실험예
6. 다중 검출
프라이머
세트의
마이코플라즈마
하이오라이니스
임상 샘플에 대한 민감도 확인
실험 대상으로는 돼지 유행성 폐렴에 감염된 돼지의 폐장에서 추출한 마이코플라즈마 하이오라이니스 임상 샘플 No.1~6(sero-positive)을 사용하였다.
(1) 실험 결과
하기의 [표 7]은 마이코플라즈마 하이오라이니스 임상 샘플의 민감도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
| 임상 샘플 | PCR 결과 |
| No. 1(sero-positive) | + |
| No. 2(sero-positive) | ++ |
| No. 3(sero-positive) | +++ |
| No. 4(sero-positive) | - |
| No. 5(sero-positive) | - |
| No. 6(sero-positive) | - |
실험 결과, No.4~6을 제외한 모든 임상 샘플에서 반응이 발생하였음을 확인할 수 있었다.
도 6은 돼지 유행성 폐렴에 감염된 돼지의 폐장으로부터 채취한 마이코플라즈마 하이오라이니스 임상 샘플 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다.(1: No. 1(sero-positive), 2: No. 2(sero-positive), 3: No.3(sero-positive), 4: No.4(sero-positive), 5: No.5(sero-positive), 6: No.6(sero-positive))
실험 결과, 1~3번 레인의 임상 샘플에서는 밴드가 관찰되었으며, 4~6번 레인의 임상 샘플에서는 밴드가 관찰되지 않았음을 확인할 수 있었다.
이로써, 본 발명의 마이코플라즈마 다중 검출 프라이머 세트는 마이코플라즈마 하이오라이니스 임상 샘플에도 반응하는바, 실질적 검출 대상인 동물에서도 마이코플라즈마 하이오라이니스의 검출이 가능하다는 결론을 도출할 수 있다.
실험예
7. 다중 검출
프라이머
세트의 종 특이도 확인(2)
실험 대상으로는 살모넬라 티피뮤리움(비교 균주), 마이코플라즈마 펄모니스, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 및 마이코플라즈마 하이오라이니스를 사용하였다.
(1) 실험 결과
하기의 [표 7]은 마이코플라즈마 속 세균의 종 특이도를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
| 세균 종 | PCR 결과 |
| M. pulmonis | +++ |
| M. hyoneumoniae | ++ |
| M. hyorinis | ++ |
| S. typimurium | - |
실험 결과, 마이코플라즈마 속 세균에 속하는 마이코플라즈마 펄모니스, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA 샘플들에만 특이적으로 반응하였으며, 마이코플라즈마 속 세균에 속하지 않는 살모넬라 티피뮤리움 균주와는 반응이 일어나지 않음을 확인할 수 있었다.
도 7은 마이코플라즈마 속 세균 3종과 비교 균주인 살모넬라 티피넬리움의 DNA에 중합효소 연쇄반응을 수행한 결과이다. (1:살모넬라 티피넬리움 DNA, 2:마이코플라즈마 펄모니스 DNA, 3:마이코플라즈마 하이오라이니스 DNA, 4:마이코플라즈마 하이오뉴모니에 DNA)
실험 결과, 1번 레인의 살모넬라 티피뮤리움에서는 밴드가 관찰되지 않았으며, 2번 레인의 마이코플라즈마 펄모니스, 3번 레인의 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 및 4번 레인의 마이코플라즈마 하이오라이니스에서는 밴드가 관찰되었음을 알 수 있다.
이로써, 본 발명의 마이코플라즈마 다중 검출 프라이머 세트는 마이코플라즈마 속 세균에만 특이적으로 반응함은 물론, 3종 이상의 마이코플라즈마 세균에 동시적으로 반응하여 검출이 가능한 것을 알 수 있다.
상기와 같은 결과로 본 발명에서 개발한 다중진단 프라이머 키트는 다양한 마이코플라즈마 속 세균들을 검출할 수 있으며, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에(Mycoplasma hyopneumoniae), 마이코플라즈마 하이오라이니스(Mycoplasma hyorhinis ), 마이코플라즈마 펄모니스(Mycoplasma pulmonis)를 동시에 특이적으로 감별 진단할 수 있는 것을 확인할 수 있었다.
<110> KIM, OK JIN
<120> Primer set for the multidetection of Mycoplasma genus, method for
the multidetection of Mycoplasma genus by using the primer, and
kit for the multidetection of Mycoplasma genus
<160> 6
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of Mycoplasma consensus
<400> 1
ggcgaatggg tgagtaacac g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of Mycoplasma consensus
<400> 2
cggataacgc ttgcgaccta tg 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of Mycoplasma hyopneumoniae
<400> 3
agatcttagt caaagtgccc gt 22
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of Mycoplasma hyopneumoniae
<400> 4
tctgccttgg tatgactgga tc 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer of Mycoplasma hyorhinis
<400> 5
acttcggaga ccattgccta ag 22
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer of Mycoplasma hyorhinis
<400> 6
aaagctctca aaaactagac acgaa 25
Claims (7)
- 서열번호 1 내지 6에 기재된 서열목록을 포함하는 마이코플라즈마(Mycoplasma) 속 세균의 다중 검출을 위한 마이코플라즈마 다중 진단 프라이머 세트(primer set), 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 방법 및 키트.
- 청구항 1에 있어서,
상기 마이코플라즈마 다중 진단 프라이머 세트는 마이코플라즈마 컨센서스, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에 및 마이코플라즈마 하이오라이니스 프라이머 세트의 반응 조건을 동일화하는 방법으로 제작된 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
- 청구항 1에 있어서,
상기 마이코플라즈마 다중 진단 프라이머 세트는 마이코플라즈마 펄모니스의 종(species) 특이적 영역인 프로테인(protein) 16s rRNA 영역, 마이코플라즈마 하이오뉴모니에의 종 특이적 영역인 프로테인 P97 영역, 마이코플라즈마 하이오라이니스의 종 특이적 영역인 프로테인 16s rRNA ~ 23s rRNA 영역을 표적으로 하여 검출하는 것을 특징으로 하는 프라이머 세트.
- 청구항 1에 있어서,
상기 마이코플라즈마 다중 진단 프라이머 세트는 마이코플라즈마 속 세균에만 특이성이 있는 효과 및 다종의 마이코플라즈마 속 세균을 동시에 검출할 수 있는 효과를 보유한 프라이머 세트.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 마이코플라즈마 다중 진단 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 키트.
- 청구항 5에 있어서,
상기 마이코플라즈마 다중 진단 키트로 검출할 수 있는 질병은 돼지 유행성 폐렴, 닭 만성호흡기질병, 칠면조 마이코플라즈마 감염증, 마이코플라즈마 폐렴, 마이코플라즈마성 요도염 및 마이코플라즈마성 질염인 것을 특징으로 하는 마이코플라즈마 다중 진단 키트.
- 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 기재된 마이코플라즈마 다중 진단 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140013366A KR20150092834A (ko) | 2014-02-06 | 2014-02-06 | 다종의 마이코플라즈마 속 세균의 동시 검출을 위한 다중 진단 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 방법 및 키트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020140013366A KR20150092834A (ko) | 2014-02-06 | 2014-02-06 | 다종의 마이코플라즈마 속 세균의 동시 검출을 위한 다중 진단 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 방법 및 키트 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20150092834A true KR20150092834A (ko) | 2015-08-17 |
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ID=54056967
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020140013366A KR20150092834A (ko) | 2014-02-06 | 2014-02-06 | 다종의 마이코플라즈마 속 세균의 동시 검출을 위한 다중 진단 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 마이코플라즈마 다중 진단 방법 및 키트 |
Country Status (1)
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|---|---|
| KR (1) | KR20150092834A (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110904251A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-03-24 | 温氏食品集团股份有限公司 | 一种用于鸭支原体检测的引物组及试剂盒 |
| WO2024028818A1 (en) * | 2022-08-04 | 2024-02-08 | Crispr Therapeutics Ag | Method for detecting mycoplasma contamination |
-
2014
- 2014-02-06 KR KR1020140013366A patent/KR20150092834A/ko active Search and Examination
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110904251A (zh) * | 2019-11-28 | 2020-03-24 | 温氏食品集团股份有限公司 | 一种用于鸭支原体检测的引物组及试剂盒 |
| CN110904251B (zh) * | 2019-11-28 | 2023-01-13 | 温氏食品集团股份有限公司 | 一种用于鸭支原体检测的引物组及试剂盒 |
| WO2024028818A1 (en) * | 2022-08-04 | 2024-02-08 | Crispr Therapeutics Ag | Method for detecting mycoplasma contamination |
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