KR101395938B1 - 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 프라이머 및 그 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 장수풍뎅이의 질병을 유발하는 세균의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 장수풍뎅이의 세균성 질병을 유발하는 원인균인 페니바실러스(Paenibacillus sp .) 특이 DNA 단편을 진단할 수 있는 프라이머(Primer) 세트를 제공하고, 이 프라이머를 이용한 PCR 증폭방법을 통해 신속하고 정밀하게 장수풍뎅이 세균성 질병의 감염 여부를 진단할 수 있는 방법을 확립함으로써, 장수풍뎅이의 세균성 질병을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있음을 알 수 있다.

Description

장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 프라이머 및 그 진단방법{PCR DIAGNOSIS USING SPECIFIC PRIMER FOR BACTERIA THAT CAUSE DISEASES OF ALLOMYRINA DICHOTOMA}

본 발명은 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 프라이머 및 그 진단방법에 관한 것으로써, 보다 상세하게는 장수풍뎅이의 질병을 유발하는 세균의 감염 여부를 신속하고 정확하게 진단할 수 있는 방법에 관한 것이다.

장수풍뎅이(Allomyrina dichotoma)는 딱정벌레목(Coleoptera), 장수풍뎅이과 (Family Dynastidae)에 속하는 곤충이다. 장수풍뎅이는 습도나 온도에 민감하지 않고 먹이가 까다롭지 않아 사육이 간편하여 애완곤충으로 각광받고 있으며, 최근에는 장수풍뎅이의 애벌레인 굼벵이가 간 질환에 효과가 있다는 민간요법이 알려지면서 이를 건강보조용 약재로 이용하는 경향이 증가 되고 있다. 예로부터 한약재로 자주 이용되어 온 굼벵이, 누에, 동충하초, 지네 등은 유용한 곤충자원으로 이용되고 있으며 최근 신약 개발에 있어서 이러한 천연자원의 기능에 대한 연구도 활발하게 진행되고 있다. 이와 같이 장수풍뎅이는 애완용으로도 널리 이용되며 유용한 곤충자원의 하나로 자리 잡고 있는데에 비해 생리 기능성에 대한 연구 자료는 매우 미흡한 실정이고 장수풍뎅이의 질병 및 질병 유발 세균의 진단방법은 전무한 상태이다.

세균의 진단 방법에 있어서 최근 가장 흔하게 이루어지고 있는 방법은 PCR 진단(분자진단)법이다. 이는 유전자의 최소단위인 DNA 또는 RNA의 특정영역을 시험관 내에서 인위적으로 대량 증폭하는 획기적인 기술이다. PCR의 원리는 단순하고 실제로 쉽게 응용할 수 있어 생명공학을 포함하는 의학, 이학, 농학, 수의학, 식품과학, 환경과학 등 다양한 분야에서 활용되고 있다. 사람이나 동물에 감염되어 질병을 일으키는 박테리아(세균)나 바이러스 또는 기타 감염성 기생충은 모두 생명체를 유지하고 증식하기 위한 최소단위의 유전정보인 DNA(RNA)를 가진다. PCR 진단방법은 이러한 최소단위의 DNA 또는 RNA를 실험실 내에서 인공적으로 증폭하는 기술을 말한다. 사람이나 동물이 세균 또는 바이러스 등에 감염되면 이들은 숙주의 세포에 침투하여 증식을 하게 되는데, 주로 적혈구 또는 백혈구에 감염되어 혈류를 통해 온몸으로 퍼지게 된다. 장내세균 같은 경우에는 장관세포에 감염된다. PCR 진단방법은 동물의 혈액(장내세균일 경우에는 분변)을 채취하여 혈액(분변)으로부터 DNA(RNA)를 추출하여 추출된 DNA(RNA)에 감염성 병원체(세균, 바이러스 등)의 유전정보가 존재하는지 검사하는 방법이다. PCR 진단방법이 기존 진단방법에 비해 특이도가 매우 뛰어난 이유는 검체내에 존재하는 병원체(세균, 바이러스 등)가 가지는 특정 DNA(RNA)만을 Target으로 하기 때문이며, 1개의 유전자만 존재하더라도 이를 최소 수 억배로 증폭하기 때문에 민감도가 다른 검사법에 비해 최소 수천배 이상 뛰어나다.

관련 선행기술로는 대한민국등록특허 제10-1092988호(등록일: 2011년 12월 06일, 명칭: 감자 풋마름병 레이스 특이 진단용 프라이머)이 있다.

본 발명의 목적은 장수풍뎅이의 세균성 질병 원인균인 페니바실러스를 유전자 수준에서 효과적으로 진단할 수 있는 PCR용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 이용한 페니바실러스 진단용 조성물 또는 진단용 키트, 상기 프라이머 세트 또는 조성물 또는 키트를 이용하는 단계를 포함하는 페니바실러스의 진단 방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기위한 본 발명의 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 프라이머 세트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 것이 특징이다.

상기 장수풍뎅이 질병 유발 세균은 페니바실러스(Paenibacillus sp.)인 것이 특징이다.

본 발명의 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 조성물은 상기 프라이머 세트를 포함하여 페니바실러스 ( Paenibacillus sp .) 진단하는 것이 특징이다.

상기 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 조성물에는 DNA 중합효소 또는 역전사 효소를 추가적으로 포함하는 것이 특징이다.

본 발명의 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 키트는 상기 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 조성물을 포함하는 것이 특징이다.

본 발명의 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단 방법은 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 프라이머 세트를 제조하는 제 1단계, 상기 프라이머 세트와 DNA 중합효소 및 역전사 효소를 포함하는 조성물을 제조하는 제 2단계, 상기 제조된 조성물에 검체 DNA 또는 RNA를 첨가하여 반응액을 제조하는 제 3단계, 상기 제조된 반응액을 역전사 반응 및 PCR 또는 실시간 PCR 반응을 수행하여 페니바실러스(Paenibacillus sp .) 진단하는 제 4단계를 포함하는 것이 특징이다.

본 발명에 의한 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단방법은 장수풍뎅이의 세균성 질병 원인균인 페니바실러스 균종을 특이적으로 진단함으로써 장수풍뎅이의 세균성 질병의 감염 여부를 신속 정밀하게 진단 가능하며, 이를 통해 세균성 질병 원인균의 감염경로를 추적하는 데에도 유용하게 이용될 수 있으므로 결과적으로는 장수풍뎅이의 세균성 질병을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있다.

도 1은 장수풍뎅이의 유충 사진으로 건강충과 이병충의 모습이다.
도 2는 영암(1), 화순(2), 남양주(3), 횡성(4), 영동(5,6) 유성(7,8) 등 총 6개 지역의 8개 샘플을 대상으로 Pd37F 및 Pd156R, Pd37F 및 Pd198R를 사용하여 PCR 증폭한 후 전기영동한 것이다. 구체적으로 상기 도 2에서 1~6은 건강충, 7~8은 이병충의 PCR 산물을 나타낸다.
도 3은 Pd37F 및 Pd198R 프라이머 세트를 이용하여 PCR 반응시 페니바실러스(Paenibacillus sp.)의 유전자 중 증폭되는 위치를 나타낸다.

본 명세서에 기재된 용어, 기술 등은 특별한 한정이 없는 한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 의미로 사용된다.

본 발명에서 말하는 세균성 질병은 먹이를 섭취할 때 감염되는 경구 전염성 질병으로 장수풍뎅이의 세균성 질병의 원인균을 동정하고 이 원인균에 의한 세균성 질병에 대한 진단 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은

1) 장수풍뎅이의 세균성 질병 원인균을 순수 분리하는 단계;

2) 단계 1)의 원인균의 16S rRNA 유전자 서열을 확보하는 단계;

3) 단계 2)의 확보한 유전자 서열을 토대로 진단 프라이머 세트 제작 및 진단 프라이머 세트를 이용한 진단방법을 제공한다.

상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 장수풍뎅이의 세균성 질병의 원인균을 동정하기 위해서는 건강충과 이병충간의 세균상을 조사하여 이병충에서만 발견되는 세균을 동정하는 것이 바람직하고, 건강충과 이병충간의 균상 차이는 장수풍뎅이의 장을 적출하여 장내 세균 상을 비교 조사하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 장내 세균 상을 비교하기 위해서는 장수풍뎅이 유충의 장을 적출하여 적출된 장을 미세하게 분쇄하는 마쇄(grinding) 과정을 진행하는 것이 바람직하다.

상기 방법에 있어서, 상기 단계 1)의 동정을 위한 원인균의 순수 분리는 특수 배지를 이용하여 선택 배양하는 것이 바람직하고, 특수 배지는 항생제를 처리한 액체 배지를 사용하는 것이 더욱 바람직하다. 액체 배지를 통해 18시간~30시간, 바람직하게는 24시간(1일) 배양 후 고체 배지로 옮겨 단일 균주 별로 순수 분리하는 것이 바람직하다.

상기 방법에 있어서, 상기 단계 2)의 원인균에 대한 유전자 서열을 확보하기 위해서는 미생물의 분자생물학적 동정 방법을 이용한 분석을 통하여 진행하는 것이 바람직하고, 순수 분리된 원인균의 16S rRNA 유전자 서열을 분석하여 병원성을 검정하는 것이 가장 바람직하다.

상기 실험에 있어서 16S rRNA 유전자 서열을 얻기 위해 이용하는 프라이머는 통상적으로 이용되는 universal primer인 세균 동정용 프라이머들 중 한 세트를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 방법에 있어서, 상기 단계 3)은 sequencing하여 얻은 16S rRNA 유전자 서열정보를 가지고 NCBI의 BLAST를 통해 유전자은행(GenBank)에 등록된 서열 정보와 일치하는 데이터를 준해 원인균이 어떤 균인지를 파악하고 원인균의 특이 서열정보를 얻어 그 특이 서열 정보를 바탕으로 프라이머를 제작하는 것이 바람직하다.

본 발명에서의 용어,"프라이머"란 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide)로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사 효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynucleoside triphospate)의 존재하에서 DNA합성을 개시할 수 있다. 본 발명에 의하면, 상기 프라이머는 10 내지 30개의 염기서열을 가지는 각각의 정방향 및 역방향의 핵산으로 구성됨이 바람직하다.

본 발명은 장수풍뎅이로부터 유래된 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드로 구성되는 프라이머 세트를 이용하여 증폭하는 단계를 포함한다.

상기 장수풍뎅이로부터 유래된 DNA란, 장수풍뎅이 또는 장수풍뎅이 유충으로부터 분리된 gDNA 뿐 아니라, 장수풍뎅이로부터 분리한 RNA로부터 수득한 cDNA 등 장수풍뎅이로부터 얻을 수 있는 모든 종류의 DNA를 의미한다.

상기 증폭은 중합연쇄효소를 이용한 중합효소연쇄반응(PCR) 또는 실시간 중합효소연쇄반응 (real-time PCR)일 수 있다.

상기 본 발명을 다른 관점에서 살펴보면, 본 발명의 장수풍뎅이 세균성 질병 진단용 조성물은 상기 프라이머 세트 뿐만 아니라, 중합효소 연쇄반응을 수행하기 위한 DNA 중합효소 또는 Hot start Taq-폴리머라아제를 추가로 포함할 수도 있다.

상기 본 발명을 다른 관점에서 살펴보면, 본 발명은 상기 장수풍뎅이 세균성 질병 진단용 조성물을 포함하는 장수풍뎅이 세균성 질병 진단용 키트에 관한 것이다. 상기 키트를 이용하면, 장수풍뎅이가 세균, 바람직하게는 페니바실러스(Paenibacillus sp.)에 감염되었는지의 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 진단용 키트는, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 진단용 키트 및 진단용 조성물은 역전사 반응 및 실시간 다중 PCR(real-time multiplex PCR)을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. 본 발명의 진단용 키트는, 진단 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 세트 외에도 장수풍뎅이 세균성 질병 원인균의 유전자인 RNA로부터 상보적인 cDNA를 합성하기 위한 역전사 효소, 상보적인 DNA를 증폭하기 위한 DNA 중합효소, 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Hot start Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

뿐만 아니라, 상기 키트를 이용하면, 장수풍뎅이과 곤충의 세균성 질병 진단 방법을 제공할 수도 있다.

상기 본 발명을 다른 관점에서 살펴보면, 본 발명의 장수풍뎅이과 곤충의 세균성 질병 진단 방법은 a) 상기 장수풍뎅이과 곤충의 세균성 질병 진단용 조성물에 DNA 중합 효소 및 역전사 효소를 포함하는 효소 조성물을 혼합하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 제조된 혼합물에 검체 DNA, RNA 또는 DNA 및 RNA를 첨가하는 단계; 및, c) 상기 b) 단계에서 제조된 검체 DNA, RNA 또는 DNA 및 RNA를 포함하는 반응액을 역전사 반응 및 PCR 또는 실시간 PCR 반응을 수행하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 검체로는 장수풍뎅이과 곤충 바람직하게는 장수풍뎅이 또는 장수풍뎅이 유충, 더욱 바람직하게는 장수풍뎅이 유충의 장 적출물로부터 얻은 장내 세균이 대상이 된다. 이때, 상기 c) 단계에서 DNA 또는 DNA 및 RNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응, 경쟁적 PCR , 실시간 PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 포함될 수 있으며 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 진단 방법들을 통하여 장수풍뎅이의 세균 감염이 의심되는 이병충의 유전체(genome)를 진단하여 페니바실러스(Paenibacillus sp.)의 감염 여부를 예측할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1> 장수풍뎅이의 장내 세균의 순수 분리 및 동정

장수풍뎅이 유충의 장을 적출하여 마쇄 후 항생제인 Nalidixic acid 12.5μl/mg을 0.1%로 처리한 MYPGPNAL액체 배지에 접종하였다. 1일 배양 후 70℃로 고온처리하여 배양 후 MYPGPNAL 고체 배지에서 배양하여 단일 균주 별로 순수 분리하였다. 순수 분리된 균주를 MYPGPNAL 액체 배지에 배양 후 3ml을 분리하여 QIAamp DNA mini Kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 사용자 매뉴얼에 기재된 방법으로 균주의 genomic DNA를 추출하였고 추출된 DNA를 template로 이용하여 polymerase chain reaction(PCR)을 수행하였다. 이때 사용된 프라이머는 universal bacterial primer로 27F와 1492R 프라이머를 사용하였다. 27F와 1492R 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.

서열번호	명칭	서열
3	27F primer	5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'
4	1492R primer	5'-GGTTACCTTTGTTACGACTT-3'

분석된 염기서열은 Basic Local Alignment Search Tool(BLAST) algorithm을 이용하여 Genbank database와 비교하였다. 상기 비교 분석 결과 확보한 16S rRNA 유전자 염기서열은 장수풍뎅이에 세균성 질병 원인균이 페니바실러스(Paenibacillus sp.)인 것으로 확인하였다.

확보한 16S rRNA 유전자 염기서열 중 페니바실러스(Paenibacillus sp.)와 일치하는 특이 서열은 하기 표 2와 같다.

특이서열

TCGCATGAGGGAATCATGAAACACGGAGCAATCTGTGGCTTACGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCT

<실시예 2>페니바실러스(Paenibacillus sp.)의 진단 프라이머 제작

페니바실러스(Paenibacillus sp.)의 16S rRNA 유전자를 토대로 하여 약 156bp 크기의 유전자 단편을 증폭할 것으로 예상되는 프라이머 세트를 Primer3 프로그램(Rozen & Skaletsky, 2000)을 이용하여 정방향 프라이머(Pd37F)와 역방향 프라이머(Pd198R)를 구성하였다. 프라이머 서열은 하기 표 3과 같고 증폭 위치는 도 3에 나타내었다. 상기 프라이머는 Blast search를 통해 유전자은행(GenBank)에 등록된 16S rRNA 유전자 서열정보와 비교하여 특이성 확인 후 제작하였다.

서열번호	명칭	서열
1	정방향 프라이머 Pd37F	5'-TCTCCTTCGGGTGCAGTTAGC-3'
2	역방향 프라이머 Pd198R	5'-TGAGCCGTTACCTCACCAACT-3'

<실시예 3>프라이머 세트를 이용한 페니바실러스(Paenibacillus sp.)의 진단

1. 실험방법

1) PCR 증폭 반응

제작된 Pd37F와 Pd198R 프라이머 세트가 장수풍뎅이 질병 유발 세균을 효과적으로 진단할 수 있는지를 PCR 방법을 이용하여 확인하였다. 상기 PCR 방법은 3 stage 3 step의 조건으로 수행하였으며 총 53분 소요되었다.

1 stage: Genomic DNA를 단일 서열로 분리시키기 위하여 95℃에서 5분간 열처리하였다.

2 stage: 1 step에서는 Genomic DNA와 프라이머를 변성시키기 위해 95℃에서 10초간 처리, 2 step에서는 Genomic DNA에 프라이머를 접촉시키기 위해 54℃에서 15초간 처리, 3 step에서는 DNA를 합성하기 위하여 72℃에서 20초간 처리하였으며, 이는 40회 반복 수행하여 특이 서열을 증폭하였다.

3 stage: 72℃에서 5분간 반응시켜 PCR 반응을 종료하였다.

2) 프라이머 세트의 특이성 확인

영암(1), 화순(2), 남양주(3), 횡성(4), 영동(5, 6), 유성(7, 8) 등 총 6개 지역 8개 샘플을 선정하여 장수풍뎅이 유충에 대하여 비교하였으며, 이 중 1~6은 건강충, 7~8은 이병충이 사용되었다.

프라이머 대조군으로는 페니바실러스(Paenibacillus sp.)의 16S rRNA를 기반으로 제작한 프라이머 Pd156R(5‘-TCCGTAAGCCACAGATTGCTC-3’)을 역방향 프라이머로 사용하여 비교하였다.

증폭반응 후 증폭산물을 전기영동하여 확인하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과 도 2와 같이 나타났다.

즉, 도 2를 통해 알 수 있듯이, PCR 증폭 산물을 나타내는 밴드가 결과 프라이머 대조군에서는 나타나지 않았으나, 진단용 프라이머를 사용한 실험군에서는 이병충인 7~8에서 확인되었다. 이를 통해 본 발명에 따른 프라이머 세트가 페니바실러스(Paenibacillus sp .) 균주를 특이적으로 진단 할 수 있음을 알 수 있다.

이에, 상기 본 발명의 프라이머 세트 및 이를 이용한 진단방법은 장수풍뎅이의 세균성 질병 원인균인 페니바실러스(Paenibacillus sp .) 균종을 특이적으로 진단함으로써 장수풍뎅이의 세균성 질병의 감염 여부를 신속 정밀하게 진단 가능하며, 이를 통해 세균성 질병 원인균의 감염경로를 추적하는 데에도 유용하게 이용될 수 있으므로 결과적으로는 장수풍뎅이의 세균성 질병을 예방하고 방제하는데 기여할 수 있다.

상기의 본 발명은 바람직한 실시예 및 시험예를 중심으로 살펴보았으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적 기술 범위 내에서 상기 본 발명의 상세한 설명과 다른 형태의 실시예들을 구현할 수 있을 것이다. 여기서 본 발명의 본질적 기술범위는 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

1. 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는,
   장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 프라이머 세트.
   
2. 제 1항에 있어서, 상기 장수풍뎅이 질병 유발 세균은 페니바실러스(Paenibacillus sp.)인 것을 특징으로 하는,
   장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 프라이머 세트.
   
3. 제 1항의 프라이머 세트를 포함하여 페니바실러스(Paenibacillus sp .) 진단하는,
   장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 조성물.
   
4. 제 3항에 있어서, 상기 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 조성물에는 DNA 중합효소 또는 역전사 효소를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는,
   장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 조성물.
   
5. 제 3항 또는 제 4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는,
   장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 키트.
   
6. 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단용 프라이머 세트를 제조하는 제 1단계;
   상기 프라이머 세트와 DNA 중합효소 및 역전사 효소를 포함하는 조성물을 제조하는 제 2단계;
   상기 제조된 조성물에 검체 DNA 또는 RNA를 첨가하여 반응액을 제조하는 제 3단계 및,
   상기 제조된 반응액을 역전사 반응 및 PCR 또는 실시간 PCR 반응을 수행하여 페니바실러스(Paenibacillus sp .) 진단하는 제 4단계;를 포함하는,
   장수풍뎅이 질병 유발 세균 진단 방법.
   

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