KR20110003397A - 나무 조각으로부터의 소나무 재선충의 ｄｎａ 추출 방법, 소나무 재선충의 ｌａｍｐ 프라이머 세트 및 나무 조각으로부터의 소나무 재선충 검출 방법 - Google Patents

나무 조각으로부터의 소나무 재선충의 ｄｎａ 추출 방법, 소나무 재선충의 ｌａｍｐ 프라이머 세트 및 나무 조각으로부터의 소나무 재선충 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 나무 조각으로부터의 소나무 재선충 분리 없이 소나무 속 등의 나무 식물로부터 수득된 나무 조각에서 소나무 재선충 DNA를 추출하고, 소나무 재선충을 검출하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 소나무 재선충이 포함된 수집 나무 조각으로부터의 소나무 재선충의 DNA 추출 방법, 소나무 재선충 DNA의 특정 부위에 어닐링하는 프라이머를 포함하는 LAMP 프라이머 세트 및 상기 프라이머를 사용하는 LAMP 방법에 의해 DNA가 증폭되고 검출되는 나무 조각으로부터의 소나무 재선충의 검출 방법에 관한 것이다.

Description

나무 조각으로부터의 소나무 재선충의 ＤＮＡ 추출 방법, 소나무 재선충의 ＬＡＭＰ 프라이머 세트 및 나무 조각으로부터의 소나무 재선충 검출 방법{DNA extraction method for Bursaphelenchus xylophilus from wood chips, LAMP primer set for Bursaphelenchus xylophilus, and detection method for Bursaphelenchus xylophilus from wood chips}
본 발명은 소나무 재선충이 포함된 나무 조각으로부터 소나무 재선충 DNA를 추출하는 방법, 소나무 재선충 DNA의 특정 부분에 어닐링하는 프라이머를 포함하는 LAMP 프라이머 세트, 나무 조각으로부터 소나무 재선충을 검출하는 방법 및 유전자 증폭을 사용하여 소나무 재선충을 검출하는 방법에 관한 것이다.
소나무 재선충(Bursaphelenchus xylophilus)은 일본 내의 숲에 가장 심각한 손상을 유발하는 소나무 재선충병(pine wilt disease) 병원균이다. 소나무 재선충은 소나무 재선충에 대한 내성이 부족한 일본 소나무에 심각한 손상을 유발한 북미에서 전달된 침습성(invasive) 종이다. 현재, 훗카이도 및 아오모리현을 제외한 일본 전역에 소나무 재선충이 퍼져있다.
소나무 재선충병을 진단하기 위해서는 죽은 소나무로부터 얻은 나무 조각으로부터 소나무 재선충을 검출하는 것이 필수적이다. 일반적으로는 베르만(Baermann) 방법을 사용하여 나무 조각으로부터 소나무 재선충을 분리하고 형태 관측을 실시한다. 상기 베르만 방법(예를 들어, 비특허 문헌 1 참조)은 검체를 조직 종이에 감싸고 물로 채워진 깔때기에 담그는 방법이다. 선충이 검체 내에 존재할 경우, 깔때기 하단에 가라앉는다. 이후, 가라앉은 선충의 형태를 현미경으로 확인하여 소나무 재선충인지 결정할 수 있다.
하지만, 상기 베르만 방법은 나무 조각으로부터 선충을 분리하는 것이 매우 장시간이 걸릴 뿐만 아니라, 선충의 형태에 대한 지식이 있는 전문가를 요구한다. 또한, 선충의 검출을 위해 현미경과 같은 고가의 장비가 필요하다. 그렇기 때문에 현재까지 소나무 재선충의 검출은 선충을 구별할 수 있는 전문가와 장비를 구비한 전문 기관에서만 실시되고 있다. 즉, 소나무 재선충을 검출하기 위한 손쉬운 방법은 현재까지 존재하지 않는다.
[비특허 문헌 1] Masahara Mamiya, Kazuyoshi Futai, Hajime Kosaka, Natsumi Kanzaki(2004), Wood Nematodes (Nematode Experiment Methods, edited by the Japanese Nematological Society, Japanese Nematological Society, Ibaraki) 134-153.
식품 및 의약과 같은 분야에서는 DNA 증폭을 이용한 병원균의 검출 방법이 제안되고 있다. 하지만, 하기하는 바와 같이 소나무 재선충은 특수한 환경인 나무에 존재하기 때문에 다른 분야에서 일반적으로 사용되는 방법들이 실질적으로 적용될 수 없다.
본 발명은 그러한 특수 환경을 고려하여 고안되었다. 본 발명의 목적은 소나무 재선충이 포함된 나무 조각으로부터의 소나무 재선충 DNA의 간단한 추출 방법, 소나무 재선충 LAMP 프라이머 세트 및 유전자 증폭을 이용하여 소나무 재선충을 손쉽게 검출할 수 있는 소나무 재선충 검출 방법을 제공하는 것이다.
보다 구체적으로, 본 발명은
1) 케라틴을 분해하는 효소를 함유하는 용액에 소나무 재선충이 포함된 나무 조각을 담그는 단계; 및
2) 상기 소나무 재선충의 DNA를 추출하는 단계;를 포함하는 나무 조각으로부터의 소나무 재선충 DNA의 추출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 소나무 재선충의 리보좀 RNA 유전자(rDNA)에서 특정 부위에 어닐링될 수 있고 서열 목록에서 서열 ID 번호 1 내지 4로 표현되는 각각의 염기 서열 F3, B3, FIP 및 BIP의 프라이머를 포함하는 LAMP 프라이머 세트(이러한 프라이머 세트는 본 명세서에서 "제 1의 프라이머 세트(first primer set)"로 명명함)를 제공한다. 본 발명에 따른 LAMP 프라이머 세트는 또한 서열 목록에서 서열 ID 번호 5로 나타내는 염기 서열 루프(Loop)-F 프라이머를 포함할 수 있다(염기 서열 F3, B3, FIP 및 BIP 프라이머에 루프-F 프라이머를 추가로 포함하는 프라이머 세트는 본 명세서에서 "제 2의 프라이머 세트(second primer set)"로 명명함). 이러한 프라이머 세트들은 케라틴을 분해하는 효소가 소나무 재선충이 포함된 나무 조각에서 작용할 수 있도록 함으로써 추출된 소나무 재선충 DNA의 증폭을 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은
1) 케라틴을 분해하는 효소를 함유하는 용액에 소나무 재선충이 포함된 나무 조각을 담그고 상기 소나무 재선충의 DNA를 추출하는 단계; 및
2) 상기 추출된 소나무 재선충 DNA를 증폭 및 검출하는 단계;를 포함하는 소나무 재선충의 검출 방법을 제공한다. 상기 소나무 재선충 DNA를 증폭 및 검출하는 단계는 제 1의 LAMP 프라이머 세트 또는 제 2의 LAMP 프라이머 세트를 사용하는 LAMP 방법에 의해 소나무 재선충 rDNA의 특정 부위를 증폭 및 검출함으로써 실시될 수 있다.
또한, 본 발명은 제 1의 LAMP 프라이머 세트 또는 제 2의 LAMP 프라이머 세트를 사용하는 LAMP 방법에 의해 소나무 재선충 rDNA의 특정 부위를 증폭 및 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 소나무 재선충 DNA를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면 나무 조각에 소나무 재선충이 존재하는 동안 소나무 재선충 DNA는 나무 조각으로부터 추출되기 때문에 소나무 재선충 DNA는 나무 조각으로부터 소나무 재선충의 분리 없이 추출될 수 있다. 결과적으로 DNA를 사용한 소나무 재선충의 검출을 실현할 수 있다.
더욱이, 본 발명에 따르면 LAMP 방법에 의해 소나무 재선충 rDNA의 특정 부위를 증폭함으로써 검출할 수 있다. 결과적으로 소나무 재선충의 유전자 증폭 및 검출을 보다 정확하고 용이하게, 저렴한 비용으로 실시할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 소나무 재선충 검출 방법, 예를 들어, 소나무속(genus pinus)에 속하는 나무로부터 얻은 나무 조각을 케라틴을 분해하는 효소가 들어있는 용액에 담그고, 나무 조각에 존재하는 소나무 재선충의 DNA를 추출하는 방법에서는 소나무 재선충의 DNA를 나무 조각으로부터 소나무 재선충을 분리하지 않고 추출할 수 있다. 이후, 소나무 재선충 rDNA의 특정 부위에 특이적으로 어닐링할 수 있는 프라이머를 포함하는 LAMP 방법용 프라이머 세트를 사용하는 유전자 증폭 방법인 LAMP 방법에 의해 소나무 재선충 DNA를 증폭 및 검출함으로써 수집된 나무 조각으로부터 소나무 재선충의 검출을 실시할 수 있다.
일반적인 소나무 재선충의 확인은 베르만 방법에 의하여 소나무 조각으로부터 소나무 재선충을 분리하고, 이어서 현미경을 사용하여 형태를 관찰함으로써 실시될 수 있다. 반대로, 본 발명의 발명자는 DNA 검출을 사용한 소나무 재선충 검출을 실시하는 것을 처음으로 착안하였다.
그러나 일반적인 DNA 추출 방법을 소나무 재선충이 존재하는 나무 조각에 적용할 경우, 나무 조각으로부터 소나무 재선충 DNA를 효율적으로 추출하기 어렵고, 추출에 매우 많은 시간이 소요된다. 다른 한편으로, 소나무 재선충이 존재하는 나무 조각을 파쇄하여 DNA를 추출 및 정제할 수 있으나, 이러한 방법은 나무 조각의 파쇄용 분쇄기와 같은 특수한 장비를 필요로 한다. 따라서, 이러한 특수한 장비가 없으면 이러한 방법을 적용하기 어렵다. 즉, 상기와 같이 특수한 장비가 없는 상황에서는 DNA를 추출하기 위해 나무 조각으로부터 소나무 재선충을 분리해야만 하고, 이로써 베르만 방법에서 요구된 것과 동일한 양의 노력과 시간이 필요하다. 더욱이, 상기 방법이 적용될 경우, 추출 용액은 나무 조각으로부터 유도된 과량의 성분, 예를 들어 리그닌(lignin)을 포함한다. 그러므로, 검출을 위해 DNA 증폭을 사용하기 위해서는 추출된 DNA는 충분히 정제되어야 한다.
따라서, 본 발명자는 소나무 재선충의 체표면(body surface)의 주성분 중 하나인 케라틴에 초점을 맞추었다. 열성적인 연구의 결과로서, 본 발명자는 케라틴을 분해하는 효소가 소나무 재선충이 포함된 나무 조각에 작용하도록 하고 소나무 재선충의 체표면을 용해하면 생성된 용액 내에 소나무 재선충 DNA가 추출됨을 발견하고, 본 발명을 완성하였다. 보다 상세하게는, 본 발명에 따르면 수집된 나무 조각의 파쇄와 같은 공정을 생략 또는 간소화하더라도 소나무 재선충 DNA를 단시간에 추출할 수 있다. 더욱이, 나무 조각으로부터 유도된 소량의 성분들이 DNA 추출 완충액으로 나오기 때문에 DNA 정제 단계가 생략 또는 간소화될 수 있다.
또한, 새로운 유전자 증폭 방법으로 에이켄 케미컬사(Eiken Chemical Co., Ltd.)(도치기현)에 의해 개발된 LAMP(루프 매개 등온성 증폭, Loop-Mediated Isothermal Amplification) 방법이 알려져 있다. 상기 LAMP 방법은 높은 특이성 및 증폭 효율성을 가지고 있으며, 반응계에 형광성 색소를 첨가함으로써 증폭의 시각적인 검출이 가능하다. 결과적으로, LAMP 방법은 유전자 증폭 및 검출이 단시간에 가능하다. 또한, LAMP 방법은 등온성 핵산 증폭 방법이기 때문에 특수 온도 조절 장비가 불필요하다. 더욱이, LAMP 방법에 사용된 가닥 교체 DNA 폴리머라아제(strand displacement DNA polymerase)는 PCR 방법에서와는 다르게 내열성(heat resistance)일 필요가 없다. 결과적으로, PCR 방법과 비교하여 반응이 보다 저렴하게 실시될 수 있다. 그러므로, LAMP 방법이 소나무 재선충의 유전자에 기초한 검출을 실시하기 위하여 사용될 경우, 소나무 재선충 유전자 증폭 및 검출이 보다 용이하게 저렴한 비용으로 실시될 수 있다. 꾸준한 연구의 결과로서, 본 발명자는 나무 재선충 rDNA의 특정 부위에 특이적으로 어닐링할 수 있고 서열 목록에서 서열 ID 번호 1 내지 4로 나타내는 LAMP 방법의 프라이머(LAMP 프라이머) 세트를 발견하였고, 이로써 LAMP 방법을 사용하는 소나무 재선충의 유전자에 기초한 검출이 가능하다. 또한, 서열 목록에 서열 ID 번호 5로 나타내는 루프(Loop)-F 프라이머를 사용하면 증폭 및 검출을 보다 단시간에 실시할 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 보다 상세히 설명한다.
먼저, 소나무 재선충이 존재하는 나무 조각(소나무 검체)으로부터 소나무 재선충 DNA를 추출하여 수득된 소나무 재선충 DNA 추출 용액의 제조를 상세히 설명한다. 본 발명의 실시예에서는 수집된 소나무 검체를 케라틴을 분해하는 효소(이하, "케라틴 분해(keratinolytic) 효소")를 포함하는 용액(완충액, DNA 추출 완충액)에 넣고 배양한다. 이로 인해, 상기 소나무 검체에 존재하던 소나무 재선충의 DNA가 추출된다. 추출된 DNA를 포함하는 용액을 DNA 추출액으로 사용된다. 완충액으로는 DNA 추출에 사용될 수 있는 임의의 완충액이 케라틴 분해 효소 활성을 가지면 사용 가능하다. 예를 들어, NaCl, 트리스(tris)-HCl 및 EDTA를 포함하는 완충액 등이 있다. 이러한 경우, NaCl은 100 내지 150 mM, 트리스-HCl은 10 내지 50 mM 및 EDTA은 0.1 내지 1 mM일 수 있다.
본 발명의 실시예에 따른 케라틴 분해 효소는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 프로테이나아제(proteinase) K가 사용될 수 있다(E.C.3.4.21.64). 상기 케라틴 분해 효소는 세포를 용해시키고 소나무 검체에서 소나무 재선충의 체표면의 주성분 중 하나인 케라틴을 분해하여 세포핵 내의 DNA를 DNA 추출 완충액으로 용리시킨다. 결과적으로, 상기 소나무 재선충 DNA는 나무 조각으로부터 소나무 재선충의 분리 없이 소나무 검체로부터 직접 추출될 수 있다. DNA 추출 완충액 내의 케라틴 분해 효소 함량은 특별히 한정되지 않지만, 그 함량은 예를 들어, 약 7.5 U/㎕의 케라틴 분해 효소가 추출 완충액에 포함된다. DNA 추출 용액을 제조할 경우, 케라틴 분해 효소를 포함하는 DNA 추출 키트가 또한 DNA 추출 완충액에 이를 첨가함으로써 이용될 수 있다. 사용 가능한 DNA 추출 키트의 예로는 "이소헤어(ISOHAIR)"(니폰젠사, Nippon Gene Co., Ltd.)가 있다.
상기 소나무 재선충 DNA의 추출에 사용되는 나무 조각의 크기 및 수집 방법은 한정되지 않고, 임의로 조절될 수 있다. 또한, 나무 조각이 수집되는 나무의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 소나무 속(genus Pinus)의 나무, 예를 들면 곰솔(Japanese black pine), 적송(Japanese red pine), 류큐 아일랜드 소나무(Ryukyu island pine), 잣나무(Korean pine), 섬잣나무(Japanese white pine), 유럽 적송(Scots pine), 유럽 흑송(European black pine), 해안송(maritime pine), 뮤고 소나무(mugo pine), 라디아타소나무(Monterey pine), 폰테로사 파인(ponderosa pine), 웨스턴 화이트 파인(western white pine), 타이완 흑송(Taiwan black pine), 중국 흑송(Chinese black pine), 히말라야 백송(Himalayan white pine), 슬래시 파인(slash pine), 리기다 소나무(pitch pine), 로지우드 파인(lodgepole pine), 스트로브 잣나무(eastern white pine), 테다 소나무(loblolly pine), 대왕송(longleaf pine), 방크스 소나무(jack pine), 푼겐스 소나무(Table Mountain pine), 백송(lacebark pine) 및 타이완 적송(Taiwan red pine)이 있다. 또한, 상기 DNA 추출 용액은 공지된 DNA 정제 과정 및 이어서 LAMP 방법에 의해 증폭될 수 있다. 그에 더하여, 케라틴 분해 효소를 사용한 DNA 추출 방법은 나무 조각에 존재하는 소나무 재선충에만 한정되지 않는다. 상기 DNA는 또한 효소를 소나무 재선충 자체에 작용하도록 함으로써 추출될 수 있음이 명백하다.
이하, 본 발명에 따른 LAMP 프라이머의 구조를 구체적으로 설명한다. 본 발명의 일 실시예에서 소나무 재선충에 특정한 LAMP 방법 프라이머는 소나무 재선충의 염기 rDNA의 ITS(internal transcribed spacer) 부위의 결정된 염기 서열에 기초한 프라이머 디자인 서포트 소프트웨어를 사용하여 고안되었다. 보다 상세하게는, 먼저 소나무 재선충 및 유사 재선충(Bursaphelenchus mucronatus)의 rDNA ITS 부위를 PCR 방법으로 증폭하고, 이러한 부위의 염기 서열을 ABI 3100 DNA 시퀀서(sequencer)(어플라이드 바이오시스템즈)를 이용하여 결정하였다. 두 종에서의 염기 서열 정보를 LAMP 프라이머 디자인 서포트 소프트웨어(프라이머 익스플로러 V4)(에이켄 케미컬사의 웹사이트에서 제공)를 이용하여 분석하였다. 상기 LAMP 프라이머는 소나무 재선충 DNA만을 증폭시키도록 고안되었다.
본 발명의 일 실시예에 따른 LAMP 프라이머는 하기와 같이 고안되었다. rDNA ITS 부위에서의 표적 유전자의 3' 말단으로부터 세 가지 부위, F3c, F2c 및 F1c가 나타났다. 또한, 표적 유전자의 5' 말단에 대하여 B1, B2 및 B3 부위가 나타났다. 네 가지 종류의 프라이머 F3, B3, FIP 및 BIP는 이러한 여섯 부위를 위해 고안되었다. 여기서, 각각 F3c, F2c 및 F1c 부위의 상보적인 부위는 각각 F3, F2 및 F1이고, 각각 B1, B2 및 B3 부위의 상보적인 부위는 각각 B1c, B2c 및 B3c이다.
특히, 서열 ID 번호 1로 나타내는 F3 프라이머는 F3c 부위에 상보적인 서열인 F3 부위를 갖도록 고안된다.
또한, 서열 ID 번호 2로 나타내는 B3 프라이머는 B3c 부위에 상보적인 서열인 B3 부위를 갖도록 고안된다.
또한, 서열 ID 번호 3으로 나타내는 FIP 프라이머는 3'말단에서 rDNA ITS 부위에 확인된 F2c 부위에 상보적인 서열인 F2 부위를 갖고, 5' 말단에는 F1c 부위와 동일한 서열을 갖도록 고안된다.
또한, 서열 ID 번호 4로 나타내는 BIP 프라이머는 3' 말단에 B2c 부위에 상보적인 서열인 B2 부위와 5' 말단에 B1c 부위와 동일한 서열을 갖도록 고안된다.
또한, 본 발명의 일 실시예는 서열 ID 번호 5로 나타내는 루프-F 프라이머를 포함한다. 이는 증폭 조작 동안 DNA 합성 유래의 수를 증가시킬 수 있고, 증폭 반응을 가속화시켜, 소나무 재선충 DNA의 증폭 및 검출을 단기간에 실시할 수 있다. 상기 서열 ID 번호 5로 나타내는 루프-F 프라이머는 F1 부위 및 F2 부위 사이의 부위에 상보적인 서열을 갖도록 고안된다.
이하, 추출된 DNA에 작용하는 상기 프라이머 세트를 사용한 LAMP 방법에 의해 실시된 증폭 조작을 설명한다.
상기 LAMP 방법에 의해 실시된 증폭 조작은 하기의 예와 같이 실시될 수 있다. 먼저, 시약(예를 들어, Bst DNA 폴리머라아제, 반응 완충액(반응 혼합물), 프라이머 세트 및 증류수)을 혼합하여 증폭 반응 용액을 제조한다. 이때, 형광성 검출 시약이 증폭 반응 용액에 더 혼합될 수 있다.
예를 들어, 루프앰프(Loopamp)(등록된 상표; 이하, 동일) DNA 증폭 시약 키트(에이켄 케미컬사)를 프라이머 세트를 제외한 반응 시약으로 사용할 수 있다. 상기 루프앰프 DNA 증폭 시약 키트는 하기 성분들을 포함한다. 2×반응 완충액(2×반응 혼합물): 40mM 트리스-HCl(pH 8.8), 20mM KCl, 16 mM MgSO4, 20mM (NH4)2SO4, 0.2% 트윈(Tween) 20, dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP 내 각각의 2.8mM 최종 농도의 1.6M 베타인; Bst DNA 폴리머라아제 8유닛/μL. 또한, 예를 들어 에이켄 케미컬사에서 판매하는 루프앰프 형광성 검출 시약이 형광성 검출 시약으로 사용될 수 있다.
이어서, 상기 소나무 재선충 DNA 추출 용액을 증폭 반응 용액에 첨가하고 생성된 혼합물을 예를 들어, 63℃에서 배양한다.
상기 LAMP 방법 반응은 하기와 같은 단계에 기초하여 실시한다. (1) 서열 ID 번호 3의 FIP 프라이머를 템플릿 DNA로 어닐링한다. (2) 상기 템플릿 DNA에 상보적인 DNA 가닥을 Bst DNA 폴리머라아제의 활성에 의해 FIP 프라이머의 F2 부위의 3' 말단에서 시작하여 합성한다. (3) 상기 서열 ID 번호 1의 F3 프라이머를 FIP 프라이머의 외부로 어닐링하고, DNA 가닥이 Bst DNA 폴리머라아제의 활성에 의해 사전-합성된 FIP 프라이머로부터 방출되는 동안 3' 말단에서 시작하여 DNA 합성을 연장한다. (4) 상기 F3 프라이머로부터 DNA 가닥이 합성되고 템플릿 DNA는 이중 가닥을 형성한다. (5) 한편, 상기 F3 프라이머로부터 DNA 가닥이 방출되는 것에서 FIP 프라이머로부터의 DNA 가닥은 단일 가닥 DNA를 형성한다. 이러한 DNA 가닥은 서로 상보적인 부위 F1c 및 F1을 5' 말단에 갖고, 이로써 자기 어닐링(self-anneals)하여 루프(loop)를 형성한다. (6) 상기 서열 ID 번호 4의 BIP 프라이머는 상기 (5) 단계에서 루프로 형성된 DNA 가닥에 어닐링한다. 이러한 BIP 프라이머의 3' 말단에서 시작하여 상보적인 DNA를 합성한다. 상기 단계 (5)에서 형성된 루프가 방출되고 연장된다. 또한, 상기 서열 ID 번호 2의 B3 프라이머는 BIP 프라이머의 외부에 어닐링한다. Bst DNA 폴리머라아제의 활성에 의해 DNA 가닥이 사전-합성된 BIP 프라이머로부터 방출되는 동안 B3 프라이머의 3' 말단에서 시작하여 DNA 합성이 확장된다. (7) 이중 가닥 DNA는 상기 단계 (6)에 의해 형성된다. (8) 한편, 상기 단계 (6)에서 방출된 BIP 프라이머로부터 합성된 DNA 가닥이 두 말단에서 상보적인 서열을 가지고, 이는 루프(loop)로 자기 어닐링하고 아령(dumbbell) 모양의 구조를 형성한다. (9) 상기 단계 (8)에서 형성된 아령 모양의 구조를 갖는 DNA 가닥으로부터 시작하여 FIP 프라이머 및 이어진 BIP 프라이머는 어닐링하고, DNA 증폭 순환을 진행한다.
상기 증폭 조작을 위한 배양 시간은 예를 들어 60분이다. 배양 시간 동안, 상기 DNA는 LAMP 방법에서 실시한 어닐링 반응 및 DNA 가닥 합성에 의해 109 내지 1010배 증폭될 수 있다.
이어서, 본 발명의 일 실시예에서는 증폭 조작이 실시된 반응 용액에 소나무 재선충 DNA가 포함되었는지 확인한다. 보다 상세하게는, 소나무 재선충이 검출 대상인 소나무 검체에 존재하는 경우, 소나무 재선충 DNA는 증폭 조작에 의해 증폭되고 검출된다. 반면, 소나무 재선충이 검출 대상인 소나무 검체에 존재하지 않을 경우, 소나무 재선충 DNA는 증폭 조작에 의해 증폭되지 않기 때문에 검출되지 않는다.
증폭된 DNA가 반응 용액에 포함되어 있는지는 예를 들어, 형광성 검출에 의해 확인될 수 있다. 상기 형광성 검출에서는 형광성 검출 시약을 첨가하여 반응을 실시하고 반응 용액의 색을 시각적으로 확인한다. 보다 상세하게는, 반응 용액이 형광을 방출하는 경우, 양성으로 결정되고, 이는 소나무 재선충 DNA가 증폭된 것인 반면, 반응 용액이 형광을 방출하지 않을 경우, 음성으로 결정되며, 이는 소나무 재선충 DNA가 증폭되지 않은 것이다. 반응 용액 형광의 양성 및 음성의 차이는 UV 조사 장치(UV irradiation apparatus)를 사용하여 보다 명확하게 확인할 수 있다.
본 발명의 일 실시예가 기재되어 있지만, 본 발명은 이에 한정되지 않는다. 본 발명은 다른 실시예에 적용될 수 있다. 예를 들어, LAMP 방법에서 실시된 DNA 증폭 및 검출 방법은 형광성 검출에만 한정되지 않고, 임의로 변경될 수 있다. 특히, 증폭 부산물로서 생성된 마그네슘 파이로포스페이트의 작용으로 인해 증폭 반응 용액이 뿌옇기 때문에 소나무 재선충 DNA 증폭은 이 단계에서 증폭 반응 용액의 혼탁도(turbidity)를 측정하여 검출될 수 있다. 또한, 소나무 재선충 DNA 증폭은 PCR(폴리머라아제 사슬 반응, polymerase chain reaction)과 같이 유전자 증폭으로 공지된 다양한 핵산 증폭 방법을 사용하여 검출될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 LAMP 프라이머를 사용한 LAMP 방법에 의한 DNA 증폭 및 검출 방법은 소나무 재선충을 나무 조각으로부터 직접 추출한 경우에만 한정되지 않는다. 이러한 방법은 베르만 방법과 같은 방법에 의해 나무 조각으로부터 소나무 재선충이 분리한 후에 DNA를 추출한 경우에도 적용될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 하지만 이러한 실시예가 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
[실시예 1]
본 발명의 실시예에 사용된 소나무 검체는 삼림종합연구소의 주 연구 기관에 있는 10 그루의 죽은 곰솔(japanese black pine)로부터 수득하였다. 다섯 그루의 곰솔(소나무 재선충의 인공적인 접종에 의해 고사한 곰솔)은 소나무 재선충에 감염되었다. 남은 다섯 그루의 곰솔(건강한 조건에서 벌채하고 소나무 재선충 감염을 예방하기 위해 구분된 영역으로 분리한 곰솔)은 소나무 재선충에 감염되지 않았다.
수집된 소나무 검체로부터의 소나무 재선충 DNA를 추출하고, 소나무 재선충 DNA 추출 용액을 제조하였다. 상세하게는, 1㎖의 DNA 추출 완충액(100Mm NaCl, 10mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA)를 1.5㎖의 마이크로튜브에 채웠다. 이후, 케라틴 분해 효소 프로테이나아제 K가 포함된 DNA 추출 키트(이소헤어, 니폰 젠사)의 용해 완충액 40㎕ 및 효소 용액 50㎕를 마이크로튜브 안의 DNA 추출 완충액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 골고루 교반하였다. 다음, 약 0.06g의 수집된 소나무 검체를 마이크로튜브 내의 용액에 넣고, 55℃에서 20분, 이어서 94℃에서 10분 동안 배양하였다.
이후, 본 발명에 따른 프라이머 세트 및 상기 DNA 추출 용액을 사용하여 증폭 및 검출 조작을 LAMP 방법으로 실시하였다. 구체적으로 설명하면, 우선 본 발명에 따른 프라이머 세트, 루프앰프 DNA 증폭 시약 키트(에이켄 케미컬사)의 각 시약 및 루프앰프 형광 검출 시약(에이컨 케미컬사)을 하기 양으로 0.2㎖ 마이크로튜브에 분산시켜 반응액을 제조하였다. 상기 프라이머 세트를 하기 방법에 따라 수득하였다. 소나무 재선충 및 유사 재선충의 rDNA ITS 부위를 PCR 방법으로 증폭시켰다. 이러한 부위의 염기 서열을 ABI3100 DNA 시퀸서(어플라이드 바이오시스템즈)를 이용하여 확인하였다. 이후, 두 종의 염기 서열 정보를 에이켄 케미컬 사의 웹사이트에 제공된 LAMP 프라이머 디자인 서포트 소프트웨어(프라이머 익스플로러 V4)를 사용하여 분석하였다. LAMP 프라이머는 소나무 재선충 DNA만 증폭되도록 디자인되었다.
2× 반응 혼합물: 12.5㎕
프라이머 FIP(서열 ID 번호 1): 1.0㎕ (40pmol/㎕)
프라이머 BIP(서열 ID 번호 2): 1.0㎕ (40pmol/㎕)
프라이머 F3(서열 ID 번호 3): 1.0㎕ (5pmol/㎕)
프라이머 B3(서열 ID 번호 4): 1.0㎕ (5pmol/㎕)
프라이머 루프-F(서열 ID 번호 5): 1.0㎕ (20pmol/㎕)
Bst DNA 폴리머라아제: 1.0㎕
형광 검출 시약: 1.0㎕
증류수: 3.5㎕
총 합계: 23.0㎕
다음, 2㎕의 상기 DNA 추출 용액을 증폭 반응액에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 골고루 교반한 후, 63℃에서 1시간 동안 방치하였다.
1시간 후, 증폭 반응액이 초록색 형광을 방출하는지 시각적으로 확인하였다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다. 초록색 형광을 방출하는 양성일 경우는 동그라미(○)로 표시하고, 초록색 형광을 방출하지 않는 음성의 경우 십자(×)로 표시하였다.
소나무 재선충 감염에 의해 고사한 곰솔(선충 감염) 및 인공적인 벌채에 의해 고사한 곰솔(선충 비감염)로부터 수득한 검체를 사용한 LAMP 방법에 의한 소나무 재선충의 검출 결과
고사 나무의 상태 반복
1 2 3 4 5
선충 감염 ○ ○ ○ ○ ○
선충 비감염 × × × × ×
또한, 각각의 실시예들과 동일한 나무로부터 수집한 소나무 검체를 베르만 방법을 사용하여 검출하였다. 상기 표 1에 나타낸 것과 동일한 검출 결과를 얻었다. 따라서, 본 발명에 따른 일 실시예의 검출 방법의 유효성을 확인할 수 있었다.
다음, 본 발명의 실시예 2 및 3과 같이, LAMP 방법 및 PCR 방법에 기초한 DNA 증폭을 이용하는 소나무 재선충 검출의 유효성을 실험하였다.
우선, 삼림종합연구소의 연구 기관에서 자란 고사 나무로부터 검체를 수집하였다. 베르만 방법을 적용하여 소나무 재선충을 8g의 수집된 나무 조각에서 분리하였다. 이어서, 수집된 검체 안의 선충 농도(1g 당 소나무 재선충의 수)를 계산하였다.
또한, 약 0.06g의 DNA 추출을 위한 8개 시료를 남은 검체로부터 제조하고, DNA 추출에 사용하였다. 구체적으로, 1㎖의 DNA 추출 완충액(100mM NaCl, 10mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA)을 1.5㎖ 마이크로튜브에 채웠다. 이후, 케라틴 분해 효소 프로테이나아제 K가 포함된 DNA 추출 키트(이소헤어, 니폰 젠사)의 용해 완충액 40㎕ 및 효소 용액 50㎕을 마이크로튜브 안의 DNA 추출 완충액에 첨가하고, 생성된 혼합물을 골고루 교반하였다. 이후, DNA 추출을 위한 각각의 시료 약 0.06g을 마이크로튜브 안에 있는 용액에 넣고, 55℃에서 20분, 이어서 94℃에서 10분 동안 배양하였다.
상기 8개 DNA 추출 용액을 사용하여 LAMP 방법 및 PCR 방법에 의해 소나무 재선충 DNA를 증폭함으로써 검출을 실시하였다. LAMP 방법을 사용하여 실시한 검출 방법 및 조건은 상기 실시예 1에 기재된 것과 동일하기 때문에 생략하였다.
실시예 3에서의 PCR 방법을 사용하여 실시한 검출은 하기와 같이 실시하였다. 먼저, GoTaq(그린 마스터 믹스(promega KK)) 및 PCR 방법에 의한 소나무 재선충의 rDNA ITS 부위를 증폭시키기 위한 프라이머 세트를 0.2㎖ 마이크로 튜브에 분산시켜 반응액을 제조하였다. 상기 프라이머 세트를 형성하는 프라이머 서열은 서열 ID 번호 6 및 7로 나타낸다.
GoTaq 그린 마스터 믹스: 10.0㎕
Bx18S1 ) (서열 ID 번호 6): 2.5㎕ (2pmol/㎕)
Bx28S1 ) (서열 ID 번호 7): 2.5㎕ (2pmol/㎕)
증류수: 3.0㎕
총 합계: 18.0㎕
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이 반응액에 상기 DNA 추출액 2㎕을 첨가하였다. 이후, 소나무 재선충 DNA를 iCycler thermal cycler(Bio-Rad Laboratories KK)를 사용한 PCR 반응에 의해 증폭시켰다. PCR 조건은 하기와 같다. 우선, 35 순환을 94℃/1분-53℃/1분-72℃/1분에 실시하고, 72℃에서 2분 동안 마지막으로 순환을 실시하였다.
상기 8개 증폭 반응액을 아가로오스(agarose) 겔에 주입하고, 전기 영동한 후, 브롬화 에티듐(ethidium bromide)으로 염색하였다. DNA가 검출되는지는 UV 조사에 의하여 DNA 증폭의 여부를 확인하여 결정하였다.
실시예 2 및 3의 적용 결과는 하기와 같다. 우선, 베르만 방법에 의한 선충 분리 결과와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따라 검출된 검체는 1g 당 살아있는 약 17개의 소나무 재선충을 갖는 것을 확인할 수 있었다.
LAMP 방법 및 PCR 방법을 사용한 검출 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
DNA 증폭 방법 시료수 검출된 성공의 수
(증폭 성공 수)		 검출된 실패의 수
(증폭 실패 수)		 검출 성공 비율(%)
(증폭 성공 비율)
LAMP 방법(실시예 2) 8 8 0 100
PCR 방법(실시예 3) 8 1 7 13
상기 표 2에 나타낸 바와 같이, 실시예 2에 사용된 8개의 모든 시료들은 소나무 재선충 DNA가 증폭되고 검출되었다. 실시예 2 및 3의 결과는 나무 조각에 케라틴 분해 효소를 작용하도록 함으로써 DNA를 추출하고, 추출한 DNA를 증폭 및 검출하는 본 발명에 따른 소나무 재선충 검출 방법에서 상기 LAMP 프라이머 세트를 사용한 LAMP 방법에 의한 소나무 재선충의 rDNA의 특정 부위의 증폭 및 검출이 바람직함을 보여준다.
또한, 실시예 2 및 3의 결과로부터, 소나무 재선충이 포함된 나무 조각에 케라틴을 분해하는 효소를 작용시켜 추출된 소나무 재선충 DNA의 증폭에 상기 LAMP 프라이머 세트가 사용될 경우, PCR 방법에 사용된 다른 프라이머에서 보다 높은 증폭 성공 비율을 나타냄이 명백하다.
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Claims (6)

1) 케라틴을 분해하는 효소를 함유하는 용액에 소나무 재선충이 포함된 나무 조각을 담그는 단계; 및
2) 상기 소나무 재선충의 DNA를 추출하는 단계;를 포함하는 나무 조각으로부터의 소나무 재선충 DNA의 추출 방법.
소나무 재선충의 rDNA 내의 특정 부위에 어닐링할 수 있으며 서열 목록에서 서열 ID 번호 1 내지 4로 나타내는 각각의 염기 서열 F3, B3, FIP 및 BIP의 프라이머를 포함하는 LAMP 프라이머 세트.
제 2항에 있어서, 서열 목록에서 서열 ID 번호 5로 나타내는 염기 서열 루프(Loop)-F의 프라이머를 더 포함하는 LAMP 프라이머 세트.
검출용 LAMP 방법에 의해 제 2항 또는 제 3항에 따른 LAMP 프라이머 세트를 사용하여 소나무 재선충의 rDNA 내에서 특정 부위를 증폭하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 소나무 재선충 DNA의 검출 방법.
1) 케라틴을 분해하는 효소를 함유하는 용액에 소나무 재선충이 포함된 나무 조각을 담그고 상기 소나무 재선충의 DNA를 추출하는 단계; 및
2) 상기 추출된 소나무 재선충 DNA를 증폭 및 검출하는 단계;를 포함하는 소나무 재선충의 검출 방법.
제 5항에 있어서, 상기 소나무 재선충 DNA를 증폭 및 검출하는 단계가 서열 목록에서 서열 ID 번호 1 내지 4로 나타내는 각각의 염기 서열 F3, B3, FIP 및 BIP의 프라이머를 포함하는 제 1의 LAMP 프라이머 세트 또는 서열 목록에서 서열 ID 번호 1 내지 5로 나타내는 각각의 염기 서열 F3, B3, FIP, BIP 및 루프(Loop)-F의 프라이머를 포함하는 제 2의 LAMP 프라이머 세트를 사용하는 LAMP 방법에 의해 소나무 재선충의 rDNA의 특정 부위를 증폭 및 검출하여 실시되는 소나무 재선충의 검출 방법.
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