KR102239392B1 - 소나무재선충 신속 검출용 재조합효소-중합효소 증폭 프라이머 프로브 세트 - Google Patents

소나무재선충 신속 검출용 재조합효소-중합효소 증폭 프라이머 프로브 세트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 신속 검출용 재조합효소-중합효소 증폭 프라이머 프로브 세트에 관한 것이다. 본 발명의 소나무재선충 검출용 RPA 프라이머 프로브 세트는 어리소나무재선충(B. mucronatus)을 포함한 근연관계의 부식성 선충류(B. doui, B. thailandae, B. hylobianum)로부터 소나무재선충(B. xylophilus)을 특이적으로 구별할 수 있기 때문에 소나무재선충병 감염이 의심되는 목편 시료에서 신속하고 정확하게 소나무재선충병 감염 여부를 진단할 수 있으므로, 소나무재선충 검출 및 소나무재선충병 진단 방법에 효과적이다.

Description

소나무재선충 신속 검출용 재조합효소-중합효소 증폭 프라이머 프로브 세트 {Primer-probe set for Recombinase Polymerase Amplification reaction for real time detecting Bursaphelenchus xylophilus}
본 발명은 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 신속 검출용 재조합효소-중합효소 반응 (Recombinase Polymerase Amplification; RPA) 프라이머 프로브 세트에 관한 것이다.
소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)은 선충(nematode)에 속하며, 소나무, 해송, 잣나무, 전나무에서 기생하면서, 기주 식물의 고사를 일으키는 병원균이다. 소나무재선충을 보유한 매개충인 솔수염하늘소를 따라 나무들 간에 전파되며, 솔수염하늘소가 신초를 후식할 때 소나무재선충이 나무 조직 내부로 침입하고, 수체 내 곰팡이를 먹으면서 빠르게 증식해, 뿌리로부터 올라오는 수분과 양분의 이동을 방해하며 나무를 시들어 말라 죽게 하는 것으로 알려져 있다. 소나무재선충에 의한 고사는 소나무재선충병의 원산지인 북미와 일본, 중국, 대만, 한국 등 동아시아와 유럽의 포르투갈, 스페인 등 세계적이며, 특히 서유럽과 한국을 포함한 동북아시아에서 급격히 확산되어 막대한 산림 피해를 유발하고 있다.
한국에서 소나무재선충에 의한 소나무재선충병은 1988년 부산광역시 금정산에서 최초 발생된 이후 기하급수적인 산림의 피해가 확산되고 있다. 일단 소나무재선충에 감염된 수종의 고사율이 매우 높고, 국제적으로 “검역대상 제 1호”로 분류되는 수목 병해이다. 이에, 2005년 “소나무재선충병 방제특별법”이 만들어질 정도로 소나무재선충은 중요하게 여겨지는 병해충이다.
한국에서 소나무재선충병을 유발하는 주요 병원균으로 보고된 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)과 어리소나무재선충(Bursaphelenchus mucronatus)은 소나무 및 잣나무에 기생하는 선충으로, 두 종류의 선충은 유전적으로 98% 이상 동일하여 생리·생태학적으로 거의 유사한 특징을 가진다. 또한, 국내에서 보고된 매개충 역시 솔수염하늘소(Monochamus alternatus) 및 북방수염하늘소(Monochamus saltuarius)로서 동일하다. 그러나 소나무재선충은 소나무에 대하여 약 99.8%의 병원성을 나타내는 반면, 어리소나무재선충은 약 30%의 병원성을 나타내는 것으로 병원성에 차이가 있다. 뿐만 아니라 소나무재선충과 근연관계의 기타 부식성 선충류로서 B. doui, B. thailandae, B. hylobianum 등이 알려져 있다. 이들 역시 소나무재선충과 병원성에서 차이를 보이지만, 유전적으로 매우 유사하여 소나무재선충을 특이적으로 검출하여 진단하는 데 어려움을 주고 있다. 소나무재선충병은 빠른 속도로 고사를 일으켜 조기 진단 및 방제가 중요하기 때문에, 조기진단을 위한 소나무재선충과 근연 관계의 다른 부식성 선충류를 뚜렷이 구별할 수 있는 진단 방법이 절실한 실정이다.
이를 위하여, 종래에는 ITS-RFLP, 종-특이적 프라이머를 이용한 PCR 및 실시간 PCR 방법 등이 연구되었으나 이러한 PCR 기반의 종래 검출 방법은 DNA의 변형이 온도에 민감하기 때문에 프라이머의 개발이 매우 중요하며, 증폭 단계에서 온도를 변화시키기 위해 시간이 소요된다는 단점을 가진다. 또한, 증폭된 반응 산물을 전기영동으로 확인하고 최종적으로 염기서열 분석을 해야 하는 일련의 과정을 통해 추가로 분석 시간이 요구되며, 중합효소연쇄반응기와 같은 전문적인 장비가 요구되어 고비용이라는 단점 또한 강조되고 있다.
이러한 단점을 극복하기 위해 개발된 재조합효소-중합효소 증폭법(Recombinase Polymerase Amplification; RPA)은 기존의 PCR 방법과 유사하나, 일정한 온도에서 온도변화 없이 특정 유전자의 증폭이 가능하기 때문에 반응 시간을 단축할 수 있고, 특수한 장비가 필요치 않아서 검사 단가가 저렴하고, 운반성이 뛰어나 현장검사가 가능할 수 있다는 장점을 가진다. 재조합효소-중합효소 증폭법(Recombinase Polymerase Amplification; RPA)은 박테리오파지 T4 재조합효소를 이용하여 DNA 이중가닥의 해리를 일으키고 동시에 DNA 중합효소와 특정 primer들을 사용하여 특정DNA를 증폭해내는 방법이다. 이는 PCR의 경우와 같이 표적 기질(target template)과 한 쌍의 primer (oligonucleotide)를 사용하여 특정 염기서열의 DNA를 증폭시킬 수 있으나, PCR의 경우와 달리 일정 온도(37℃ - 42℃)의 범위에서 등온조건으로 증폭반응을 일으킬 수 있는 장점이 있다. 현재 RPA는 매우 빠르게 증폭산물을 만들 수 있도록 발전되었으며, 이는 등온조건의 장점과 함께 널리 인식되어 특이유전자증폭을 통한 특정병원체의 검출법에 다양하게 RPA가 응용되고 있다.
재조합효소-중합효소 증폭법 반응을 이용한 진단 및 검출 방법에 있어서, 배 바이러스를 검출하기 위한 재조합-중합효소 증폭 반응용 프라이머 조성물 및 이의 이용 (대한민국 출원특허 제 10-2018-0063644호), 뎅기바이러스의 4가지 혈청형을 모두 검출 할 수 있는 재조합효소-중합효소 반응을 이용하는 방법 (Abd El Wahed A, et al., 2015)에 대한 개시가 있으나, 한국에서 채취한 소나무재선충병 감염 의심목으로부터 소나무재선충을 특이적으로 검출하기 위한 재조합효소-중합효소 증폭법에 대해서는 아직까지 보고된 바가 없다.
이에, 본 발명자들은 국내 소나무의 목편 시료에서 소나무재선충 및 기타부식성 선충류를 구분하여 소나무재선충을 특이적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하기 위해 노력한 결과, 소나무재선충에 특이적인 재조합효소-중합효소 증폭법 프라이머 프로브 세트를 제작하였으며, 소나무재선충 진단에 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 소나무재선충 검출용 재조합효소-중합효소 증폭 (Recombinase Polymerase Amplification; RPA) 프라이머 프로브 세트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 소나무재선충 실시간 검출용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 소나무재선충병 신속 진단 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결하기 위한 것으로, 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 증폭산물을 확인하는 프로브를 포함하는, 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 신속 검출용 재조합효소-중합효소 반응 (Recombinase Polymerase Amplification; RPA) 프라이머 프로브 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 프로브 세트를 포함하는 소나무재선충 검출용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 소나무 시료로부터 DNA를 분리하는 단계, (b) 상기 (a) 단계에서 분리한 DNA를 주형으로 하고 상기 서술한 프라이머 프로브 세트를 이용하여 재조합효소-중합효소 증폭 반응을 수행하는 단계 및 (c) 상기 (b) 단계의 반응 산물을 분석하는 단계를 포함하는 소나무재선충병 진단 방법을 제공한다.
본 발명의 소나무재선충 신속 검출용 RPA 프라이머 프로브 세트는 어리소나무재선충(B. mucronatus)을 포함한 근연 관계의 부식성 선충류(B. doui, B. thailandae, B. hylobianum)로부터 소나무재선충(B. xylophilus)을 특이적으로 구별할 수 있기 때문에 소나무재선충병 감염이 의심되는 목편 시료에서 신속하고 정확하게 소나무재선충병 감염 여부를 진단할 수 있으므로, 소나무재선충 검출 및 소나무재선충병 진단 방법에 효과적이다.
도 1은 본 발명의 제작된 소나무재선충 검출용 프라이머 및 프로브의 염기서열이다.
도 2는 본 발명의 IST2 유전자의 표적 염기서열 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 소나무재선충 검출 프라이머 및 프로브 세트의 민감도 반응 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 PRA 진단 키트의 소나무재선충 특이적 반응 결과를 나타낸 것이다(Bx; Bursaphelenchus xylophilus, Bh; Bursaphelenchus hylobianum, Bd; Bursaphelenchus doui, BmA; Bursaphelenchus mucronatus Asia type, BmE; Bursaphelenchus mucronatus European type, Bt; Bursaphelenchus thailandae).
도 5는 소나무 재선충에 감염된 소나무의 RPA 반응을 나타낸 것이다.
도 6은 소나무 재선충에 감염되지 않은 소나무의 RPA 반응을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 국내에서 감염된 소나무재선충병 의심목을 대상으로 소나무재선충 및 근연 관계의 기타 부식성 선충류를 효과적으로 구분할 수 있는 RPA 프라이머 프로브 세트 및 이를 이용한 진단방법에 대해 보고된 바가 없다.
본 발명의 프라이머 프로브 세트는 소나무재선충에 민감하고 특이적이기 때문에, 어리소나무재선충(B. mucronatus) 또는 다른 근연 관계의 부식성 선충류(B. doui, B. thailandae, B. hylobianum)에 반응하지 않아, 유사한 선충류들로부터 소나무재선충(B. xylophilus)을 효과적으로 구분할 수 있어, 소나무재선충병의 신속한 진단에 효과적이다.
본 발명은 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 증폭산물을 확인하는 프로브를 포함하는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 신속 검출용 재조합효소-중합효소 반응 (Recombinase Polymerase Amplification; RPA) 프라이머 프로브 세트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 프로브 세트를 포함하는 소나무재선충 검출용 키트를 제공한다.
상기 키트는 RPA 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있고, 상기 각각의 프라이머 프로브 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPCwater) 및 멸균수 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 국내에서 분리된 소나무재선충(Bx), 어리소나무재선충(BM), B. doui(Bd), B. thailandae(Bt) 및 B. hylobianum(Bh)를 배양하고, Bx에 특이적인 RPA 프라이머 세트를 제작하였다. 다음으로, 상기 Bx, BM, Bd, Bt 및 Bh의 DNA 시료를 주형으로 하고 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 RPA 반응을 수행한 결과, Bx 이외의 다른 선충에서는 RPA 반응이 되지 않음을 확인함으로써 본 발명의 프라이머 세트가 Bx에 특이적이라는 것을 확인하였다(도 4).
따라서 본 발명의 프라이머 세트는 소나무재선충을 민감하고 특이적으로검출 할 수 있기 때문에, 어리소나무재선충뿐만 아니라 소나무재선충과 근연 관계에 있는 다른 부식성 선충류로부터 소나무재선충을 효과적으로 구분할 수 있고, 소나무재선충병 감염이 의심되는 목편 시료에서 소나무재선충 감염 여부를 확인할 수 있으므로, 소나무재선충 검출에 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 소나무 시료로부터 DNA를 분리하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 분리한 DNA를 주형으로 하고 상기 서술한 프라이머 세트를 이용하여 재조합효소-중합효소 반응(RPA)을 수행하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 반응 산물을 분석하는 단계를 포함하는 소나무재선충병 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 등온증폭 반응은 30 ~ 50℃에서 10분 내지 60분 동안 수행할 수 있으며, 바람직하게는 37 ~ 42℃에서 10 ~ 20분 동안 수행하는 것이 좋으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 RPA 프라이머 프로브 세트는 소나무재선충에 민감하고 특이적이기 때문에, 어리소나무재선충과 소나무재선충을 효과적으로 구분할 수 있고, 소나무재선충병 감염이 의심되는 목편 시료에서 소나무재선충 감염 여부를 확인할 수 있으므로, 소나무재선충병 진단 방법에 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. RPA를 이용한 소나무재선충 검출 프라이머 프로브 제작
1-1. 지역별, 선충 균주 확보 및 분리, 배양
소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus, Bx) 특이적 검출 프라이머를 개발하기 위해 소나무재선충 뿐만 아니라, 어리소나무재선충(B. mucronatus, BM), B. doui(Bd), B. thailandae(Bt), B. hylobianum(Bh) 등 총 5개의 공시 선충을 국립산림과학원, 산림병해충연구과에서 제공되었다. 상기 균주들은 25±1℃ 및 40% 습도에서 잿빛곰팡이(Botrytis cinerea) 균주를 접종한 감자한천배지(PDA)에 약 2 ~ 3주간 배양하였다. PWN에 감염된 소나무 및 건강한 소나무의 시료는 드릴을 이용하여 작은 목편을 다수 채취하였다. PWN에 감염된 소나무는 소나무재선충병 증상에 기초하여 판단하였다.
1-2. 수집된 선충으로부터 유전체 DNA(genomic DNAs) 추출
상기 실시예 1-1에서 분리된 선충을 대상으로 QIAgen DNeasy 혈액 및 조직 키트를 사용하여 각 선충에 대해 약 3,000 개의 개별 선충으로부터 유전체 DNA(genomic DNAs)를 추출하였다.
1-3. 유전적 변이 부위 발굴 및 RPA용 특이적 마커 제작
RPA 분석을 위한 프라이머는 소나무 재선충으로부터 내부 전사된 스페이스 2(Internal transcribed spacer ribosomal DNA 2; ITS 2 rDNA)의 증폭을 위해 Macrogen (서울, 한국)에 의뢰하여 합성하였다. 이는 동종(conspecifics)와 구별되었다. 프라이머는 부분 ITS1-5.8S rRNA-ITS2-28S rRNA 서열 (B. xylophilus (GenBank accession number: KX856336); 및 5 개의 Bursaphelenchus 종: B. thailandae (GenBank accession number: DQ497183), B. doui (GenBank accession number: AM157743), B. hylobianum (GenBank accession number: AM400240), B. mucronatus Asia type (GenBank accession number: U93554) 및 B. mucronatus Europe type (GenBank accession number: KP644762) 을 정렬한 후 설계되었다. 프라이머 서열 Bx_202_F : 5′-CAATGTTAGGCACCATCTGTTTTACGC-3′(서열번호 1) 및 Bx_341_R : 5′-GTTGAAACAACATCACCAAACGGTTTAG-3′(서열번호 2)은 소나무 재선충의 ITS 2에서 독점적으로 129개 염기쌍 단편을 증폭하도록 설계 되었다. 상기 증폭된 산물의 소나무재선충 종 특이성의 정확도를 높이기 위해 Bx234 P : TTTGTTCCGCGACCAATATCTTCTACGCACTGTTTGTCCGTGCGGGGCGA (서열번호 3) 프로브를 설계하였다 (도 1).
실시예 2. RPA 반응의 민감도 실험
소나무재선충의 검출 방법에 있어서 적은 DNA 량으로도 유의적인 검출이 가능한 것이 요구되므로, 다양한 DNA 농도를 이용하여 실시예 1의 방법으로 RPA 반응을 수행하여 프라이머 프로브 세트의 민감도를 분석하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 검출 한계점은 최소 0.001 ng까지 검출이 가능함을 확인하였다.
실시예 3. RPA 반응을 이용한 소나무재선충 특이적 검출 확인
상기 서열번호 1 및 2로 표시되는 프라이머 세트 및 서열번호 3로 표시되는 프로브가 소나무재선충(B. xylophilus, Bx)를 특이적으로 민감하게 검출할 수 있는지 확인하기 위해, 상기 실시예 1에서 분리한 선충 균주의 DNA 시료를 대상으로 RPA반응을 수행하였다. RPA 분석은 제조사의 지시에 따라 TwistAmp1 기본 키트를 사용하여 수행하였다. 소나무재선충(Bx42), 어리소나무재선충(BMA87, BME109), B. doui(Bd01), B. thailandae(Bt01), B. hylobianum(Bh01)에서 분리한 DNA 시료를 각각 20 ng/㎕ 농도로 준비하였다. PWN에 감염되거나 건강한 소나무의 소나무에서 3 μL의 용해물 용액 또는 반응 주형으로서 각 선충으로부터의 3 μL의 순수한 gDNA, 한 쌍의 프라이머 3.2 μL (각각 최종 0.16 μM), DEPC (nuclease-free water untreated with diethyl pyrrolcarbonate ) 11.8 μL 및 마그네슘 아세테이트 2.5 μL을 포함하는 50 μL 의 시약을 준비하였다. 현장에서 사용하기에 적합하기 위해, TwistAmp1 염기성 효소 펠렛 및 반응 주형 (용액)을 제외한 RPA 반응 성분은 최대 4개월 동안 실험에 사용하기에 내구성이 우수한 물질 혼합 형태 (총 부피 47 μL)로 구성되었다. 용해물 또는 gDNA와의 마스터 혼합물을 TwistAmp1 염기성 효소 펠렛 튜브에 넣고 간단히 혼합한 다음 휴대용 광학 등온 장치를 사용하여 최적 온도 (37 ℃)에서 15 분 동안 배양하였다. 그 결과, 도 4 에 나타낸 바와 같이 소나무재선충(Bx) 시료 이외의 선충 시료에 대해서는 RPA 반응이 되지 않았다. 이로부터 본 발명의 프라이머 프로브 세트가 소나무재선충을 특이적으로 검출하는 효과를 가짐을 알 수 있었다.
3-2. 혼합 시료
추가적으로 소나무재선충이 감염된 나무 목편에서도 소나무재선충을 특이적으로 선별할 수 있는지 확인하기 위하여, 상기 실시예 3에서 사용된 선충 DNA 시료로 혼합 시료를 제작한 후 이를 이용하여 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 RPA 반응을 수행하였다. 그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 소나무재선충이 포함된 시료는 PRA 반응이 되었지만, 도 6에 나타낸 바와 같이 소나무재선충이 감염되지 않은 나무에서는 RPA 반응이 되지 않았다.
<110> KOREA FOREST RESEARCH INSTITUTE <120> Primer-probe set for Recombinase Polymerase Amplification reaction for real time detecting Bursaphelenchus xylophilus <130> 1066950 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bx_202_F <400> 1 caatgttagg caccatctgt tttacgc 27 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bx_341_R <400> 2 gttgaaacaa catcaccaaa cggtttag 28 <210> 3 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bx234_P <400> 3 tttgttccgc gaccaatatc ttctacgcac tgtttgtccg tgcggggcga 50

Claims (5)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 역방향 프라이머로 이루어진 프라이머 세트; 및 서열번호 3의 염기서열로 이루어진 증폭산물을 확인하는 프로브를 포함하는, 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 신속 검출용 재조합효소-중합효소 반응 (Recombinase Polymerase Amplification; RPA) 프라이머 프로브 세트.
  2. 제1항의 프라이머 프로브 세트를 포함하는 소나무재선충 검출용 키트.
  3. (a) 소나무 시료로부터 DNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 분리한 DNA를 주형으로 하고 제 1항의 프라이머 세트를 이용하여 재조합효소-중합효소 반응(RPA)을 수행하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 반응 산물을 분석하는 단계를 포함하는
    소나무재선충병 진단 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 (b) 단계의 등온증폭 반응은 30 ~ 50℃에서 10분 내지 60분 동안 수행하는 것을 특징으로 하는, 소나무재선충병 진단 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 소나무재선충병은 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 감염으로 인해 유발된 것을 특징으로 하는 소나무재선충병 진단 방법.
KR1020200033916A 2020-03-19 2020-03-19 소나무재선충 신속 검출용 재조합효소-중합효소 증폭 프라이머 프로브 세트 KR102239392B1 (ko)

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KR20230130895A (ko) 2022-03-04 2023-09-12 충남대학교산학협력단 재선충병 감염증상 기반의 침엽수 생리 활력도 평가 방법 및 그 장치

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