KR101680706B1 - 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스에 특이적인 프라이머 세트 및/또는 프로브, 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및/또는 아이노 바이러스의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 및/또는 프로브, 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스에 특이적인 프라이머 세트 및/또는 프로브, 및 그의 용도{Primer set and/or probe specific for Schmallenberg virus, Akabane virus and Aino virus, and use thereof}
슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및/또는 아이노 바이러스의 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 및/또는 프로브, 및 그의 용도에 관한 것이다.
슈말렌베르크 바이러스(Schmallenberg virus)는 2011년 독일에서 최초 발생보고가 있은 후, 현재 유럽 전역뿐만 아니라, 아시아, 호주, 아프리카, 중동 등 전세계적으로 발생 보고가 있는 신종 전염성 질병이다. 한국의 경우 슈말렌베르크 바이러스의 발생보고는 현재까지 없다.
슈말렌베르크 바이러스는 주로 등에모기 및 모기 등에 의해 전파되고, 주로 반추류(소, 염소, 양 등)가 감염된다는 보고가 있다. 반추류가 이 바이러스에 감염시 유량이 감소하고, 임신한 개체에서는 유ㆍ사산을 일으키는 것으로 보고 되어있다.
슈말렌베르크 바이러스와 같은 버냐비리데 과(Bunyaviridae family), 오르토버냐바이러스 속(Orthobunyavirus genus)에 속하는 아까바네 바이러스(Akabane virus)와 아이노 바이러스(Aino virus)는 국내 모기, 소 뿐만 아니라 말, 돼지 등에서 발생보고가 있다. 이들 바이러스는 슈말렌베르크 바이러스와 동일하게 등에모기에 의해 전파되며, 반추류에 감염시 임신한 개체에서 유ㆍ사산을 일으킨다.
슈말렌베르크바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스가 반추류에 감염시 유사한 임상증상을 나타내기 때문에 유사한 임상증상을 나타내는 개체에서 한번의 반응으로 3종의 바이러스를 신속하게 동시 감별 진단이 가능한 방법이 요구된다.
구체적으로, 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스 중 하나 이상을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트 및/또는 프로브가 요구되고 있다. 또한, 상기 프라이머 세트 및/또는 프로브를 포함하는 조성물 및/또는 키트가 요구되고 있다.
일 양태는 시료 중의 슈말렌베르크 바이러스(Schmallenberg virus), 아까바네 바이러스(Akabane virus), 및 아이노 바이러스(Aino virus) 중 하나 이상을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
다른 양태는 시료 중의 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스 중 하나 이상을 동시에 검출하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양태는 시료 중의 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스 중 하나 이상을 동시에 검출하기 위한 키트를 제공하는 것이다.
다른 양태는 시료 중의 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스 중 하나 이상을 동시에 검출하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
일 양태는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트를 포함하는, 시료 중의 슈말렌베르크 바이러스(Schmallenberg virus), 아까바네 바이러스(Akabane virus), 및 아이노 바이러스(Aino virus) 중 하나 이상을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
상기 프라이머 세트는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것 일 수 있다.
상기 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 10 내지 21, 12 내지 21, 14 내지 21, 16 내지 21, 18 내지 21, 20 내지 21, 10 내지 18, 10 내지 16, 10 내지 14, 12 내지 18, 14 내지 16, 14 내지 18, 또는 16 내지 18개의 연속 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
상기 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 2 또는 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 10 내지 18, 12 내지 18, 14 내지 18, 16 내지 18, 12 내지 16, 14 내지 16, 10 내지 16, 또는 10 내지 14개의 연속 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
상기 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 10 내지16, 12 내지 16, 14 내지 16, 12 내지 14, 또는 10 내지 12개의 연속 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
상기 프라이머 세트에 있어서, 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 10 내지 14, 12 내지 14, 또는 10 내지 12개의 연속 뉴클레오티드 서열일 수 있다.
일 양태는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트를 포함하는, 시료중의 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스 중 하나 이상을 동시에 검출하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드에 대하여는 상기 프라이머 세트에서 설명한 바와 같다.
상기 조성물은, 상기 프라이머 세트를 사용한 증폭 반응에서 증폭된 산물에 특이적으로 결합하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은, 예를 들면 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 4 의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 프라이머 세트를 프라이머로 사용한 증폭 반응 산물, 예를 들면 PCR 반응 산물에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 프로브일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 검출가능한 표지로 표지된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 전기적 표지, 광학적 표지, 기질을 검출가능한 신호를 발생시키는 산물로 전환시키는 효소, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 광학적 표지는 형광, 인광, 방사선, 또는 그 조합을 발광하는 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 실시간 PCR에 의하여 검출가능한 신호가 실시간으로 방출되도록 하는 방식으로 표지된 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 FRET(Fluorescence resonance energy transfer) 쌍일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 FAM, HEX, Cy5 또는 그 조합일 수 있다.
상기 조성물은 액상, 또는 고상일 수 있다. 상기 조성물은 버퍼, 물과 같은 용매를 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 증폭 반응에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다. 증폭 반응에 필요한 시약은 (d)NTP, RNA 또는 DNA 폴리머라제, 역전사 효소, 보조 효소, 염, 버퍼, 또는 그 조합을 포함할 수 있다.
다른 양태는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트를 포함하는, 시료중의 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스 중 하나 이상을 동시에 검출하기 위한 키트를 제공한다.
상기 키트에서, 상기 프라이머 세트에 대하여는 상기한 바와 같다.
상기 키트는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 4 의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드에 대하여는, 상기 조성물에 대하여 설명한 바와 같다.
다른 양태는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트를 시료 중의 표적 핵산과 혼성화시키고 표적 핵산에 혼성화된 프라이머를 연장시키는 단계를 포함하는 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및 증폭 산물로부터 표적 핵산의 존재를 확인하는 단계;를 포함하는, 시료 중의 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스 중 하나 이상을 동시에 검출하기 위한 방법을 제공한다.
상기 핵산을 증폭하는 단계는 프라이머 세트를 시료 중의 표적 핵산과 혼성화시키고 표적 핵산에 혼성화된 프라이머를 연장시키는 단계를 포함하는 것이면 어느 것이나 포함된다. 상기 증폭은 PCR(polymerase chain reactin)에 의하여 수행되는 것을 포함한다.
PCR은 RT-PCR (reverse transcription-PCR), 예를 들면 표적 핵산을 역전사하는 동시에 PCR에 의하여 증폭하는 단일-단계(one-step) RT-PCR일 수 있거나, 멀티플렉스 PCR(multiplex PCR), 실시간 PCR (realtime PCR) 또는 이들의 조합을 포함한다.
상기 확인하는 단계는 알려진 방법에 의하여 수행될 수 있다. 또한, 상기 확인하는 단계는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브의 존재하에서 이루어지는 것일 수 있다. 예를 들면, 검출가능한 물질로 표지된 상기 폴리뉴클레오티드 프로브를 증폭 산물과 혼성화시키고 혼성화 산물을 검출함으로써 이루어질 수 있다. 상기 검출은 상기 혼성화에 의하여 상기 표지로부터 유래된 증가된 검출신호를 측정하는 것 또는 상기 증폭 산물에 혼성화된 상기 프로브 중의 상기 표지를 제거함으로써 특이적으로 발생하는 신호를 측정하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 프로브의 존재하에서 실시간 RT-PCR(realtime quantitative reverse transcription polymerase chain reaction)을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법에 있어서, 상기 핵산을 증폭하는 단계, 및 확인하는 단계는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 단일-단계 멀티플렉스 실시간 RT-PCR(one-step multiplex real time quantitative RT-PCR: one-step mRT-PCR)에 의하여 수행될 수 있다.
상기 시료는 포유동물 유래의 것일 수 있다. 상기 포유동물은 반추류 동물일 수 있다. 포유 동물은 소, 염소, 말, 돼지, 양 또는 그 조합일 수 있다. 또한 상기 시료는 상기 3종의 바이러스 중 하나 이상이 존재할 수 있는 반추류의 야외가검물일 수 있다. 예를 들면, 소 전혈, 염소 전혈, 모기, 소 뇌조직 또는 이들의 조합일 수 있다. 또한 상기 시료는 상기 야외가검물로부터 분리된 RNA, 또는 상기 RNA의 역전사 산물일 수 있다. 또한 상기 시료는 표적 핵산을 포함하는 양성 대조군 시료, 또는 표적 핵산을 포함하지 않은 음성 대조군을 포함할 수 있다. 상기 반추류는 예를 들면, 소, 염소, 양 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 단일-단계 멀티플렉스 실시간 RT-PCR은 한번의 반응으로 상기 3종의 바이러스 중 하나 이상을 동시에 감별하여 검출할 수 있으면서도 기존의 각 바이러스를 검출하는 진단법과 비교하여 민감도 및 특이도가 동일하다.
일 양태에 따른 시료 중의 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스 중 하나 이상을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트, 조성물 및 키트에 의하면, 기존의 상기 3종의 바이러스를 개별적으로 검출하는 프라이머 세트, 조성물 및 키트와 비교하여 검사시간, 비용을 감소시키면서도, 동일한 민감도와 특이도로 상기 3종의 바이러스를 검출하는데 사용될 수 있다.
다른 양태에 따른 시료 중의 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스중 하나 이상을 동시에 검출하기 위한 방법에 의하면, 기존의 상기 3종의 바이러스를 개별적으로 검출하는 검출 방법과 비교하여 검사시간, 비용을 감소시키면서도, 동일한 민감도와 특이도로 상기 3종의 바이러스를 검출할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1 : 프라이머 및 프로브 선정
슈말렌베르크 바이러스(Aceession No: HE649914), 아까바네 바이러스(Aceession No: AF034942), 및 아이노 바이러스의 S segment를 Clone Manager v 9.0 software(Scientific and Educational Software, Cary, NC, U.S.A)로 비교 분석하여 상기 3종의 바이러스의 유사부위 및 감별부위 선정에 활용하였다. 이 후 상기 3종의 바이러스의 S segment에서 서로 유사한 염기서열을 보이는 부위를 공통의 프라이머로 선정하고, 염기서열로 각 바이러스의 감별이 가능한 부위를 프로브로 선정하였다.
본 실시예에서 상기 3종의 바이러스 중 하나를 검출하거나 둘 이상을 동시에 검출하기 위하여 단일-단계 멀티플렉스 실시간 RT-PCR에 사용된 프라이머 및 프로브의 뉴클레오티드 서열은 다음과 같다.
표적 서열번호 프라이머 또는 프로브 이름 서열
공통 1 포워드 프라이머 AKIS-qRT_mF TGACT GCAGA AGART GGATG A
2 리버스 프라이머 AKIS-qRT_mR GAATC CAGAT TTGGC CCA
슈말렌베르크 바이러스 3 프로브 FAM-SBV FAM-ACAGA AATAA AAGCT GCT
아까바네 바이러스 4 프로브 HEX-AKA HEX-ATCTA AGTTG GACGC A
아이노 바이러스 5 프로브 Cy5-Aino Cy5-ATGCT GTCCG TGCA
리포터 형광물질로 FAM, HEX 및 Cy5를 사용하여 멀티플렉스를 구현하였다. 상기 3종의 바이러스의 S segment 부위를 T-vector에 클로닝(cloning)하고 RNA로 전사하여 RNA standard contol로 이용하였다.
실시예2 : 단일-단계 멀티플렉스 실시간 RT - PCR 반응
단일-단계 멀티플렉스 실시간 RT-PCR 반응 혼합물의 제조 방법과 반응 조건은 다음과 같다.
단일-단계 멀티플렉스 실시간 RT-PCR 반응 혼합물의 조성
Primer-probe mix 5 ㎕
2x buffer 12.5 ㎕
25x enzyme 1 ㎕
template 5 ㎕
DW 또는 TE buffer 1.5 ㎕
Total 25 ㎕
단일-단계 멀티플렉스 실시간 RT-PCR은 AgPath-ID One-Step RT-PCR Kit (Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였다. 구체적으로, 반응 혼합물은 주형(template) 5㎕(1㎍/㎕), Primer-probe mix (각 프라이머의 최종 농도는 3.2μM 및 각 프로브의 최종 농도는 200nM) 5㎕, 25x one-step RT enzyme 1 ㎕, 2x buffer 12.5 ㎕ 및 잔량은 멸균증류수 1.5 ㎕를 혼합하여 총 부피를 25 ㎕가 되도록 제조하였다.
주형은 상기 3종의 바이러스의 S segment 부위를 TA-vector kit(Promega)의 프로토콜에 따라 PCR 증폭하고 클로닝(cloning)한 후, MEGAscript®Kit (Ambion, USA)를 이용하여 RNA를 전사한 RNA standard control, 바이러스 배양액, 및 가검물에서 추출된 RNA(실시예 3)이다. 상기 바이러스 배양액은 37℃, 및 5% CO2 배양기에서 Vero 세포를 α-MEM (Gibco) 배지 중에 배양하여 얻어진 Vero 세포 단일층에 각 바이러스를 접종한 후, 동일한 조건에서 5일 동안 배양하여 세포병변효과(cytopathic effect)가 나타나는 때에 세포를 수확하여 동결-융해(freezing-thawing)를 반복하여 세포를 파쇄(lysis)하고, 원심 분리하여 얻어진 상층의 바이러스 용액을 나타낸다. 상기 가검물에 대하여는, 실시예 3에 나타낸 바와 같다.
반응 조건은 표 3과 같이 45℃ 10분 (역전사 과정), 95℃ 10분, 그리고 95℃ 15초, 및 52.5℃ 20초를 45회 반복하였다.
반응조건
온도 시간 반복(cycle)
45℃ 10 분 1
95℃ 10 분 1
95℃ 15 초 45
52.5℃ 20 초
상기 PCR 반응의 민감도(sensitivity)를 평가하기 위하여, 주형으로 상기 RNA standard control을 이용한 경우, RNA를 10배 단계 희석한 각 RNA를 주형으로 분석하였다. 이 경우, 슈말렌베르크 바이러스는 2.4 카피수, 아까바네 바이러스는 96.2 카피수, 아이노 바이러스는 52.3 카피수까지 검출 가능하였다. 상기 PCR 반응의 민감도를 평가하기 위하여, 바이러스를 이용한 경우, 아까바네바이러스와 아이노바이러스는 한국수의유전자은행에서 분양하여 사용하였으며, 슈말렌베르크 바이러스는 독일 Friedrich Loeffler Institute(FLI)에서 분양하여 이용하였다. 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스의 역가를 확인하고, 이를 10배 단계 희석한 후 Maxwell® 16 total RNA purification kit(Promega)를 이용하여 RNA를 추출하고 추출한 각 RNA를 주형으로 분석하였다. 그 결과, 슈말렌베르크 바이러스는 100.6 TCID50/ml, 아까바네 바이러스 101.5 TCID50/ml, 아이노 바이러스는 101.2 TCID50/ml를 나타내었다. TCID50은 조직배양 감염량(tissue culture infectious dose)으로, 조직 배양의 50%에서 세포병변효과가 유발되는 바이러스의 양을 지칭한다.
상기 3종의 바이러스에 대한 본 발명의 단일-단계 멀티플렉스 실시간 RT-PCR의 민감도의 수준은 OIE(세계동물보건기구)에서 권장하는 검출 진단법의 민감도와 동일한 민감도를 나타내었다.
상기 PCR 반응의 특이도를 평가하기 위하여, 소유행열 바이러스, 츄잔 바이러스, 이바라끼 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 및 블루텅 바이러스를 사용하여 동일조건에서 검사를 수행한 결과 이들 바이러스에 대한 특이반응은 확인되지 않았다.
실시예 3: 야외가검물에 대한 적용
상기 3종의 바이러스 중 하나 이상이 존재할 수 있는 야외가검물에 대하여, Maxwell® 16 total RNA purification kit(Promega)를 이용하여 RNA를 추출하고, 실시예 2에 기재된 바와 같은 조건에서 본 발명의 단일-단계 멀티플렉스 실시간 RT-PCR을 적용하였다. 실험에 이용된 야외가검물은 증상이 없는 도축장의 소 100개체로부터 얻은 소 전혈, 증상이 없는 도축장의 염소 100개체로부터 얻은 염소 전혈, 모기 100개체, 및 증상이 있는 즉, 유ㆍ사산을 일으킨 개체의 소 100개체로부터 얻은 뇌조직 샘플이다. 상기 야외가검물에 대한 적용결과는 다음과 같다.
야외가검물에 대한 적용 결과
소 전혈(두) 염소 전혈(두) 모기(개) 소 뇌조직(두)
슈말렌베르크 바이러스 양성 0 0 0 0
음성 100 100 100 100
아까바네 바이러스 양성 1 0 0 1
음성 99 100 100 99
아이노 바이러스 양성 0 0 0 0
음성 100 100 100 100
상기 실시예1 내지 3에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 단일-단계 멀티플렉스 실시간 RT-PCR 방법에 의하여 수행되는 검출방법은 한번의 반응으로 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스 중 하나를 검출하거나 둘 이상을 한번의 반응으로 동시에 검출할 수 있어 기존의 개별 검출법에 비해 검사시간이 단축되고, 비용이 감소되며, 검사의 민감도와 특이도를 확보할 수 있다.
<110> Republic of Korea <120> Primer set and/or probe specific for Schmallenberg virus, Akabane virus and Aino virus, and use thereof <130> PN0104502 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 tgactgcaga agartggatg a 21 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gaatccagat ttggccca 18 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe, FAM is conjugated to the 5' end <400> 3 acagaaataa aagctgct 18 <210> 4 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe, HEX is conjugated to the 5' end <400> 4 atctaagttg gacgca 16 <210> 5 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe, Cy5 is conjugated to the 5' end <400> 5 atgctgtccg tgca 14

Claims (19)

  1. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트를 포함하는, 시료 중의 슈말렌베르크 바이러스(Schmallenberg virus), 아까바네 바이러스(Akabane virus), 및 아이노 바이러스(Aino virus) 중 하나를 검출하거나 둘 이상을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트.
  2. 청구항 1에 있어서, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는, 시료 중의 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스 중 하나를 검출하거나 둘 이상을 동시에 검출하기 위한 프라이머 세트.
  3. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트를 포함하는, 시료중의 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스 중 하나를 검출하거나 둘 이상을 동시에 검출하기 위한 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는, 시료 중의 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스 중 하나를 검출하거나 둘 이상을 동시에 검출하기 위한 조성물.
  5. 청구항 3 또는 4에 있어서, 상기 시료는 반추류동물의 야외가검물을 포함하는 것인 조성물.
  6. 청구항 3 또는 4에 있어서, 상기 시료는 소 전혈, 염소 전혈, 모기, 소 뇌조직 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 조성물.
  7. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트를 포함하는, 시료중의 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스 중 하나를 검출하거나 둘 이상을 동시에 검출하기 위한 키트.
  8. 청구항 7에 있어서, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 4 의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함하는, 시료 중의 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스 중 하나를 검출하거나 둘 이상을 동시에 검출하기 위한 키트.
  9. 청구항 7 또는 8에 있어서, 상기 시료는 반추류동물의 야외가검물을 포함하는 것인 키트.
  10. 청구항 7 또는 8에 있어서, 상기 시료는 소 전혈, 염소 전혈, 모기, 소 뇌조직 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 키트.
  11. 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트를 시료 중의 표적 핵산과 혼성화시키고 표적 핵산에 혼성화된 프라이머를 연장시키는 단계를 포함하는 표적 핵산을 증폭하는 단계; 및
    증폭 산물로부터 표적 핵산의 존재를 확인하는 단계;를 포함하는, 시료 중의 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스 중 하나를 검출하거나 둘 이상을 동시에 검출하기 위한 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 핵산을 증폭하는 단계는 PCR에 의하여 수행되는 것인 방법.
  13. 청구항 11에 있어서, 상기 핵산을 증폭하는 단계는 멀티플렉스 RT-PCR(multiplex reverse transcription polymerase chain reaction: mRT-PCR)에 의하여 수행되는 것인 방법.
  14. 청구항 11에 있어서, 상기 핵산을 증폭하는 단계는 단일-단계(one-step) 멀티플렉스 RT-PCR에 의하여 수행되는 것인 방법.
  15. 청구항 11에 있어서, 상기 확인하는 단계는 실시간 RT-PCR(realtime reverse transcription polymerase chain reaction)에 의하여 수행되는 단계를 포함하는 것인 방법.
  16. 청구항 11에 있어서, 상기 확인하는 단계는, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 4 의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프로브의 존재하에서 실시간 RT-PCR에 의하여 수행되는 단계를 포함하는 것인 방법.
  17. 청구항 11에 있어서, 상기 핵산을 증폭하는 단계, 및 확인하는 단계는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 프라이머 세트, 및 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 프로브를 사용하여 단일-단계 멀티플렉스 실시간 RT-PCR(one-step multiplex real time quantitative RT-PCR: one-step mRT-PCR)에 의하여 수행되는 것인 방법.
  18. 청구항 11 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료는 반추류동물의 야외가검물을 포함하는 것인 방법.
  19. 청구항 11 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시료는 소 전혈, 염소 전혈, 모기, 소 뇌조직 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
KR1020140023717A 2014-02-27 2014-02-27 슈말렌베르크 바이러스, 아까바네 바이러스, 및 아이노 바이러스에 특이적인 프라이머 세트 및/또는 프로브, 및 그의 용도 KR101680706B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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GenBank: AF034939.1, 1998.09.25.
Virus Genes. 2013, vol. 47, pp. 505-514.
한국수의보건공중학회지. 2009, 제33권, 제4호, 229-234 쪽.

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