KR102367980B1 - PNA 프로브를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2 및 살베코바이러스의 동시 진단방법 및 진단용 키트 - Google Patents

PNA 프로브를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2 및 살베코바이러스의 동시 진단방법 및 진단용 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcription Real-time polymerase chain reaction)을 이용한 베타코로나바이러스의 하속(subgenus)중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)를 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게 살베코바이러스 및 신종 코로나바이러스의 동시 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 종래 코로나바이러스감염증-19 진단에 사용되는 DNA 프로브를 이용한 PCR과 RT-PCR 방법에 비해 민감도와 특이도가 높으며 신종 코로나바이러스의 ORF1ab 유전자, S 유전자, N 유전자 및 살베코바이러스의 E 유전자를 동시 증폭 및 판별할 수 있어, 고민감도와 높은 정확성을 가지고 신종 코로나바이러스 및 살베코바이러스의 감염 여부분석 가능하다.

Description

PNA 프로브를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2 및 살베코바이러스의 동시 진단방법 및 진단용 키트{Simultaneous Diagnositic methods and diagnostic kits for SARS-CoV-2 causing COVID-19 and Sarbecovirus using PNA probe}
본 발명은 베타코로나바이러스의 하속(subgenus)중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)의 동시 검출을 위한 분석방법과 진단용 키트에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 PNA 프로브를 이용한 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2의 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 다중분석을 이용한 감염 여부 판별방법에 관한 것이다.
코로나바이러스는 외피가 있는 단일가닥의 양성 RNA 바이러스이며 게놈 크기는 25-32kb로 지금까지 알려진 RNA 바이러스 중에서는 비교적 큰 바이러스에 속한다. 외피에 곤봉모양의 돌기인 스파이크(spike) 단백질이 박혀 있어 화염 또는 왕관 모양의 특이적 구조를 가지고 있으며, 라틴어로 왕관이라는 뜻인 Corona로부터 바이러스 이름이 유래되었다. 1937년 닭에서 처음으로 발견된 후 박쥐, 새, 고양이, 개, 소, 돼지, 쥐 등 다양한 조류와 동물에서 발견된 코로나바이러스는 4개의 그룹(Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta- corona virus)으로 나누어진다. 알파와 베타코로나바이러스 그룹은 포유류에 주로 감염되고 감마와 델타코로나바이러스 그룹은 조류에서 찾을 수 있다. 코로나바이러스는 동물들에서 위장병 및 호흡기질환과 같은 다양한 질환을 일으킬 수 있다고 알려져 있다. 사람에게 감염되는 사람 코로나바이러스는 1960대 발견된 HCoV-229E와 HCoV-OC43, 사스 대유행 이후 발견된 HCoV-NL63(2004년)과 HCoV-HKU1(2005년)로 이들은 일반적으로 상기도 감염증과 관계가 있다고 알려져 있으나 면역결핍환자들에게는 심각한 폐질환을 유도하기도 한다. 주로 겨울이나 이른 봄에 코로나바이러스에 대한 감염률이 증가된다고 보고되고 있고, 성인 감기환자 중 코로나바이러스가 원인 병원체인 비율이 상당히 높다고 알려져 있다. 2003년 중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS)을 일으키는 사스 코로나바이러스(SARS-CoV)가 처음 발견되었으며 세계보건기구(WHO) 보고에 따르면 2002년에서 2003년 동안 전 세계적으로 8,273명의 환자와 775명의 사망자(치사율 약 10%)가 발생하였고, 2004년까지 추가적인 환자 발생과 사망자가 보고되었다(Saif LJ., Rev. Sci. Tech., 23:643, 2004).
2012년 9월 사스와 유사한 고열, 기침, 호흡곤란 등의 호흡기 증상을 나타내는 중중 호흡기질환 환자가 발생하였고, 이 원인 병원체는 기존의 알려진 바이러스와는 다른 신종 코로나바이러스(HCoV-EMC)로 밝혀졌다. 이 바이러스는 중동호흡기 증후군 코로나바이러스 또는 메르스 코로나바이러스(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus; MERS-CoV)로 불리며, 사람에게 감염되었을 때에 중증의 호흡기 질환을 유발하여 사망에 이르게 하며(Zaki AM et al., N Engl J Med, 367:1814, 2012), 2015년 5월 우리나라에서 발생하여 38명의 사망자를 낸 바 있다.
코로나바이러스감염증-19는 2019년 12월 중국 우한시에서 발생한 바이러스성 호흡기 질환이다. '우한 폐렴', '신종코로나바이러스감염증', '코로나19'라고도 한다. 신종 코로나바이러스에 의한 유행성 질환으로 호흡기를 통해 감염되며, 증상이 거의 없는 감염 초기에 전염성이 강한 특징을 보인다. 감염 후에는 인후통, 고열, 기침, 호흡곤란 등의 증상을 거쳐 폐렴으로 발전한다. 2020년 3월 전세계로 확산되자, 세계보건기구는 이 질환에 대해 팬데믹을 선언했다.
코로나바이러스감염증-19(Covid-19)는 주로 호흡기로 전염된다. 감염되었을 경우 바이러스는 폐를 침범하며, 고열과 기침, 호흡곤란 등의 증상이 발생하고 폐렴과 유사한 증상을 보인 끝에 심한 경우 폐포가 손상되어 호흡 부전으로 사망에 이르기도 한다. 잠복기는 3~7일이지만 최장 14일까지 이어지기도 한다. 2020년 1월 30일 중국에서는 잠복기가 23일까지 늘어난 사례가 있다고 발표했다. 코로나바이러스감염증-19는 증상이 나타나지 않는 잠복기 중에도 전염되는 사례가 있다고 보고되었다.
코로나바이러스감염증-19의 잠복기 무증상 시에도 전염되는 특성과 강한 전염성으로 인해 인접한 지역으로 신속하게 확산되기 때문에 조기 검출에 의한 환자의 격리 및 관리가 매우 중요하다.
현재 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2는 기본적으로 '판코로나바이러스 검사법(Conventional PCR)'과 염기서열 분석으로 진단한다. 판코로나바이러스 검사법은 신종코로나바이러스를 포함한 모든 코로나바이러스의 존재 유무를 우선 검사하는 것으로, 음성으로 판정되면 코로나바이러스 감염이 아님을 의미한다. 만일 양성인 경우에는 감기를 일으키는 다른 코로나바이러스인지, 신종코로나바이러스인지 유무를 유전자염기서열 분석을 통해 판단한다. 이에 따라 진단에 1~2일 정도 소요된다.
한국의 질병관리본부는 2020년 1월 31일부터는 검사속도와 편의성이 향상된 '실시간 유전자 증폭검사(Real Time RT-PCR)'를 통해 진단하고 있는데 이 검사방법으로는 6시간 이내에 결과 확인이 가능하다.
현재 민감도 및 특이도가 보다 향상된 효과적인 검출이 가능한 검출 방법이 필요한 실정이다.
PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브는 DNA보다 타겟 DNA에 대한 인식능력 및 결합 능력이 뛰어나 DNA 프로브보다 빠르고 강하게 타겟 DNA와 결합할 수 있는 특징을 사용하여 민감도와 특이도를 개선할 수 있는 장점이 있다.
이에, 본 발명자들은 베타코로나바이러스의 하속(subgenus)중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 기존의 DNA 프로브보다 높은 민감도와 특이도를 가지면서도 여러 개의 타겟 검출방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, PNA 프로브를 사용하여, Real time-RT PCR법으로 SARS-CoV-2 및 살베코바이러스의 표적 핵산을 검출하는 경우, 기존의 DNA 프로브를 이용한 방법보다 높은 민감도와 특이도로 표적 유전자를 검출할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 베타코로나바이러스의 하속(subgenus)중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 검출할 수 있는 프로브 및 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로브 및 프라이머 쌍을 이용한 베타코로나바이러스의 하속(subgenus)중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2의 다중 유전자 동시 검출 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 33 내지 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 베타코로나바이러스의 하속(subgenus)중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2 진단을 위한 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 (i)~(xiv)에서 선택되는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus)의 유전자 증폭용 프라이머 쌍 (primer pair)을 제공한다:
(i) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(ii) 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iii) 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iv) 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(v) 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(vi) 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(vii) 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(viii) 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(ix) 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(x) 서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(xi) 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(xii) 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(xiii) 서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 및
(xiv) 서열번호 27의 정방향 프라이머 및 서열번호 28의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍.
본 발명은 또한, 상기 PNA 프로브 및 프라이머 쌍을 포함하는 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2를 검출하는 방법을 제공한다;
(a) 검체 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 쌍을 이용하여 신종 코로나바이러스의 ORF1ab, S, N 유전자 및 살베코바이러스의 E 유전자를 증폭시켜 증폭산물을 수득하는 단계;
(c) 상기 증폭산물을 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있는 상기 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계 및
(d) 형광검출 측정을 통해 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 또는 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 감염을 판정하는 단계.
본 발명에 따르면, 종래 코로나바이러스감염증-19 진단에 사용되는 DNA 프로브를 사용하는 기존 방법에 비해 PNA 프로브를 사용함으로써 SARS-CoV-2의 ORF1ab, N, S 유전자, Sarbecovirus의 E 유전자 및 내부대조유전자인 Human Rnase P의 유전자의 동시 다중 분석이 가능하여 고민감도와 높은 정확성의 SARS-CoV-2 및 살베코바이러스의 감염 여부를 진단할 수 있다.
도 1은 본 발명에서 사용한 SARS-CoV-2의 표준핵산 제작방법 및 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 2는 PNA 프로브를 사용하여 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2의 다중 유전자를 분석하는 것을 나타낸 모식도이다.
도 3은 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 감염여부를 확인하기 위한 PCR 반응조건을 나타내는 모식도이다.
도 4는 서열번호1-28 프라이머 및 서열번호 33-49 프로브 조합에 의한 표적물질 검출 결과이다. A는 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 검출 결과; B는 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 미검출 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에서 사용한 대조물질(IC, Internal control)인 Rnase P의 표준핵산 제작 및 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 6는 본 발명의 실시예에 따른 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 검출 키트의 결과를 나타낸 것으로, A는 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 검출 결과; B는 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 미검출 결과를 나타낸 것이다.
도 7는 본 발명의 실시예에 따른 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 검출 키트의 최소검출한계(Limit of Detection, LOD)를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 검출 키트의 특이도를 확인하기 위한 교차반응 결과를 나타낸 것이다.
도 9. 본 발명의 실시예에 따른 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 검출 키트의성능을 확인하기 위해 임상검체 1 내지 3에서 확인한 결과이다.
베타코로나바이러스의 하속(subgenus) 중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 DNA 프로브를 이용한 RT-PCR 보다 높은 민감도와 특이도를 가지고 다중 유전자를 동시에 진단하는 방법으로, 살베코바이러스(Sarbecovirus)의 E 유전자, 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자, N 유전자, S 유전자, 내부대조유전자 human Rnase P 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 디자인하였다. 아울러 상기 프라이머에 의해 증폭된 ORF1ab, S, N, E, Rnase P 유전자는 DNA보다 타겟 DNA에 대한 인식능력 및 결합 능력이 뛰어난 PNA를 사용한 PNA(Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하여 혼성화하여 증폭산물을 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 PNA 프로브는 서열번호 33 내지 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 베타코로나바이러스의 하속(subgenus)중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2 진단을 위한 PNA 프로브인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 PNA 프로브는 제한되지는 않으나 리포터 또는 소광자가 결합되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 프로브는 양 말단에 리포터와 리포터 형광을 소광할 수 있는 소광자의 형광 물질이 결합할 수 있으며, 인터컬레이팅(intercalating) 형광 물질을 포함할 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX, Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3, Alexa680 로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 또는 Dabcyl을 사용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인터컬레이팅 형광 물질은 아크리딘 호모다이머(Acridine homodimer) 및 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 및 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 및 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 및 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 및 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 및 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 및 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 및 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 및 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 및 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 및 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 및 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 및 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 및 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 및 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI)와 이의 유도체 및 사이다이스(Cy-dyes) 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 다음 (i)~(xiv)에서 선택되는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus)의 유전자 증폭용 프라이머 쌍 (primer pair)에 관한 것이다:
(i) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(ii) 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iii) 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iv) 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(v) 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(vi) 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(vii) 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(viii) 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(ix) 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(x) 서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(xi) 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(xii) 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(xiii) 서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 및
(xiv) 서열번호 27의 정방향 프라이머 및 서열번호 28의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 PNA 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하고 있는 베타 코로나 및 SARS-CoV-2의 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 대조물질; 이를 검출하기 위한 서열번호 29의 정방향 프라이머와 서열번호 30의 역방향 프라이머의 프라이머 쌍, 서열번호 31의 정방향 프라이머와 서열번호 32의 역방향 프라이머의 프라이머 쌍; 및 서열번호 49~53의 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 내부대조물질은 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2의 존재 유무와 상관없이 임상 검체의 역전사 중합효소 연쇄반응의 성공 여부를 확인할 수 있는 유전자이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 homosapiens 종 Rnase P 유전자의 RNA 부위인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 분석 방법은 제한상기 프라이머 세트는 실시간 중합효소 연쇄반응 방법을 이용한 분석용 프라이머이며, 바람직하게는 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용한 분석용인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2의 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 RNA, DNA 합성 효소, dNTPs 및 버퍼 등을 추가할 수 있으며 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
(a) 검체 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 쌍을 이용하여 신종 코로나바이러스의 ORF1ab, S, N 유전자 및 살베코바이러스의 E 유전자를 증폭시켜 증폭산물을 수득하는 단계;
(c) 상기 증폭산물을 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있는 상기 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계 및
(d) 형광검출 측정을 통해 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 또는 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 감염을 판정하는 단계를 포함하는 살베코바이러스 및 신종 코로나바이러스의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 검체 시료는 DNA 또는 RNA 분자이며, 상기 분자는 이중가닥 또는 단일가닥 형체일 수 있다. 초기물질로써 핵산이 RNA 단일가닥인 경우, RNA 가닥을 complementary DNA(cDNA) 가닥으로 합성하는 역전사 반응단계를 거치는 것이 바람직하다. 이는 역전사효소(reverse trascriptase)를 사용하여 달성 될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 초기물질로서 핵산이 이중가닥인 경우, 두 가닥을 단일 가닥으로, 또는 부분적인 단일-가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥들을 분리하는 것으로 알려진 방법들은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80℃ 내지 105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다.
본 발명에서 상기 유전자는 제한되지는 않으나 SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자, S 유전자 또는 N 유전자, 또는살베코바이러스의 E 유전자 일 수 있다.
본 발명에서 상기 검체시료는 제한되지는 않으나 본 발명에서 "검체 시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 사람 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 기관의 대표적인 예로는, 기관지, 폐, 비강, 눈, 뇌, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭,위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질 (medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 타액, 가래, 콧물, 비말, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 분석 방법은 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcription Real time PCR) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계는 대조물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 내부대조물질은 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)의 존재 유무와 상관없이 임상 검체의 역전사 중합효소 연쇄반응의 성공 여부를 확인할 수 있는 유전자이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 homosapiens 종 Rnase P 유전자의 RNA 부위인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 '표적 핵산', '합성 DNA' 또는 '인공합성 올리고'는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여 도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 이를 분석을 통하여 표적 핵산의 유무를 검출할 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 표적 핵산 준비
살베코바이러스 및 신종코로나바이러스의 감염 진단을 위하여 신종 코로나바이러스의 ORF1ab 유전자, N 유전자, S 유전자 및 살베코바이러스의 E 유전자(표적물질 1-4)를 합성하였고((주)코스모진텍, 한국), 각 표적물질의 염기서열은 아래 표 1에 나타내었고, 벡터맵은 도 1에 개시하였다.
표적핵산 서열 정보
표적
핵산 		서열
번호 		서열 정보
ORF1ab 52 ACTGCTTCAGACACTTATGCCTGTTGGCATCATTCTATTGGATTTGATTACGTCTATAATCCGTTTATGATTGATGTTCAACAATGGGGTTTTACAGGTAACCTACAAAGCAACCATGATCTGTATTGTCAAGTCCATGGTAATGCACATGTAGCTAGTTGTGATGCAATCATGACTAGGTGTCTAGCTGTCCACGAGTGCTTTGTTAAGCGTGTTGACTGGACTATTGAATATCCTATAATTGGTGATGAACTGAAGATTAATGCGGCTTGTAGAAAGGTTCAACACATGGTTGTTAAA
N 53 CAAGCCTCTTCTCGTTCCTCATCACGTAGTCGCAACAGTTCAAGAAATTCAACTCCAGGCAGCAGTAGGGGAACTTCTCCTGCTAGAATGGCTGGCAATGGCGGTGATGCTGCTCTTGCTTTGCTGCTGCTTGACAGATTGAACCAGCTTGAGAGCAAAATGTCTGGTAAAGGCCAACAACAACAAGGCCAAACTGTCACTAAGAAATCTGCTGCTGAGGCTTCTAAGAAGCCTCGGCAAAAACGTACTGCCACTAAAGCATACAATGTAACACAAGCTTTCGGCAGACGTGGTCCAGAA
S 54 TCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTG
E 55 GACGACGACTACTAGCGTGCCTTTGTAAGCACAAGCTGATGAGTACGAACTTATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTCTAAACGAACTAAATATTATATTA
실시예 2: SARS-CoV-2, Sarbecovirus 및 대조물질 증폭을 위한 프라이머 제작
살베코바이러스 및 신종 코로나바이러스의 표적물질에 대한 시간 역전사중합효소 반응을 위해, 하기 표 2와 같이 서열번호 1 ~ 32의 프라이머를 제작하였다.
서열번호 서열(5'-3') 상세내용 타겟
서열번호1 CCGTTTATGATTGATGTTCAACAATGGG SARS-CoV-2 정방향 프라이머 ORF1ab
서열번호2 GCTAGACACCTAGTCATGATTGCATCAC SARS-CoV-2 역방향 프라이머
서열번호3 GTTCAACAATGGGGTTTTACAGGTAACC SARS-CoV-2 정방향 프라이머
서열번호4 CTCGTGGACAGCTAGACACCTAGTC SARS-CoV-2 역방향 프라이머
서열번호5 CAGGTAACCTACAAAGCAACCATGATCTG SARS-CoV-2 정방향 프라이머
서열번호6 GTCCAGTCAACACGCTTAACAAAGCAC SARS-CoV-2 역방향 프라이머
서열번호7 CAGTCTGTACCGTCTGCGGTATG SARS-CoV-2 정방향 프라이머
서열번호8 GCTGCACTTACACCGCAAACC SARS-CoV-2 역방향 프라이머
서열번호9 CACAGTCTGTACCGTCTGC SARS-CoV-2 정방향 프라이머
서열번호10 GCTGCACTTACACCGCAAACC SARS-CoV-2 역방향 프라이머
서열번호11 CCTGCTAGAATGGCTGGCAATGG SARS-CoV-2 정방향 프라이머 N
서열번호12 GTGACAGTTTGGCCTTGTTGTTGTTGG SARS-CoV-2 역방향 프라이머
서열번호13 GACCAGGAACTAATCAGACAAGGAACTG SARS-CoV-2 정방향 프라이머
서열번호14 CCTGTGTAGGTCAACCACGTTCC SARS-CoV-2 역방향 프라이머
서열번호15 CAAGGAACTGATTACAAACATTGGCCGC SARS-CoV-2 정방향 프라이머
서열번호16 CGAAGGTGTGACTTCCATGCCAATG SARS-CoV-2 역방향 프라이머
서열번호17 GGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTG SARS-CoV-2 정방향 프라이머 S
서열번호18 GAATCTCAAGTGTCTGTGGATCACG SARS-CoV-2 역방향 프라이머
서열번호19 CTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTG SARS-CoV-2 정방향 프라이머
서열번호20 CATGGTGTAATGTCAAGAATCTCAAGTG SARS-CoV-2 역방향 프라이머
서열번호21 CAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTC SARS-CoV-2 정방향 프라이머
서열번호22 GGTGTTATAACACTGACACCACC SARS-CoV-2 역방향 프라이머
서열번호23 GTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACG Sarbecovirus 정방향 프라이머 E
서열번호24 CACGTTAACAATATTGCAGCAGTACGC Sarbecovirus 역방향 프라이머
서열번호25 CTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACG Sarbecovirus 정방향 프라이머
서열번호26 ACTCACGTTAACAATATTGCAGCAGTACGCA Sarbecovirus 역방향 프라이머
서열번호27 GCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGG Sarbecovirus 정방향 프라이머
서열번호28 GGTTTTACAAGACTCACGTTAACAATATTGCAGC Sarbecovirus 역방향 프라이머
서열번호29 GAGACCGACACACGGGAG Human Rnase P 정방향 프라이머 IC
서열번호30 GGGGATAAGTGGAGGAGTGT Human Rnase P 역방향 프라이머
서열번호31 TGAGCTGGAGCCAGAGACC Human Rnase P 정방향 프라이머
서열번호32 AGGTCCAGTACTCAGCATG Human Rnase P 역방향 프라이머
SARS-CoV-2 및 Sarbecovirus 진단을 위한 프라이머 서열
실시예 3: 형광 PNA 프로브 제작
살베코바이러스 및 신종 코로나바이러스의 특이적 증폭분석을 위하여 서열번호 33 내지 서열번호 48의 PNA 프로브를 제작하였으며, 다중 증폭을 위해 프로브 서열 양 끝에 각각 형광과 소광자를 결합시켰다(표 3).
서열번호 서열(5'-3') 상세내용 타겟
서열번호33 Dabcyl-CAAGTCCATGGTAATGC-O-K FAM ORF1ab
서열번호34 Dabcyl-GCACATGTAGCTAGTTG-O-K FAM
서열번호35 Dabcyl-CGCGAACCCATGCTT-O-K FAM
서열번호36 Dabcyl-CCATGCTTCAGTCAG-O-K FAM
서열번호37 Dabcyl-TGCTGCTTGACAGATTG-O-K HEX N
서열번호38 Dabcyl-GCTGCTGCTTGACAG-O-K HEX
서열번호39 Dabcyl-GCTTTGCTGCTGCTT-O-K HEX
서열번호40 Dabcyl-GATGCTGCTCTTGCTTTG-O-K HEX
서열번호41 BHQ3-TGCCTTTCCAACAATTTG-O-K Alexa680 S
서열번호42 BHQ3-GTTTCTGCCTTTCCAACA-O-K Alexa680
서열번호43 BHQ3-GACACTACTGATGCTG-O-K Alexa680
서열번호44 BHQ3-GCAGAGACATTGCT-O-K Alexa680
서열번호45 BHQ3-TAGCCATCCTTACTGC-O-K Cy5 E
서열번호46 BHQ3-CGTGGTATTCTTGCTAG-O-K Cy5
서열번호47 BHQ3-CACTAGCCATCCTTACTG-O-K Cy5
서열번호48 BHQ3-TCCTTACTGCGCTTCG-O-K Cy5
서열번호49 Dabcyl-CAACTCAGCCATCCA-O-K Texas Red IC
서열번호50 Dabcyl-CGA GTC TTC AGG GTC AC-O-K Texas Red
서열번호51 Dabcyl-GTC TTC AGG GTC ACA CC-O-K Texas Red
SSARS-CoV-2 및 Sarbecovirus 진단을 위한 프로브 염기서열
* 표 2에서 O-는 링커 및 K는 라이신(lysine)을 의미한다.
실시예 4: 표적물질을 이용한 SARS-CoV-2 검출 키트의 검증
실시예 1에서 합성된 살베코바이러스와 신종코로나바이러스의 표적물질 1-4을 실시예 2와 실시예 3에서 합성된 서열번호 1-28 프라이머 및 서열번호 33-48 PNA 프로브와 혼합한 후 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)를 이용하여 실시간 역전사중합효소 반응을 수행하여 형광을 측정하였다.
PCR은 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR(asymetric PCR)을 이용하였으며, PCR 반응액은 2X 반응 버퍼(One-step RT qPCR kit, 엔지노믹스, 한국), 0.05 μM 정방향 프라이머 및 0.5 μM 역방향 프라이머에 0.5 μl 형광 PNA를 첨가하고, 10 μl 표적물질 DNA를 첨가한 다음, 실시간 역전사중합효소 반응을 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였다. 실험 과정의 도식은 도 2에 나타내었으며 역전사중합효소 반응 조건은 도 3에 나타내었다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 표적물질이 있을 경우에만 형광이 검출되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 대조물질을 포함한 SARS-CoV-2 및 Sarbecovirus 진단 키트의 검증
살베코바이러스 및 신종코로나바이러스의 진단 키트 내 대조물질(IC, Internal Control) 도입을 위하여 Homosapiens의 Rnase P 유전자의 RNA 150bp 부위를 표적핵산으로 사용하여 SARS-CoV-2 및 Sarbecovirus 검출과는 독립적으로 PCR 반응의 정상여부를 확인하였다. 각 산물의 합성된 서열은 아래 표 4과 같으며 벡터맵은 도 5에 개시하였다.
내부대조물질 표적핵산 서열 정보
표적
핵산 		서열
번호 		서열정보
내부대조
물질
(표적 물질 5)		 56 CGGGGTCAGAACGCGTGCTCTGAGATCTACATTCACGGCTTGGGCCTGGCCATCAACCGCGCCATCAACATCGCGCTGCAGCTGCAGGCGGGCAGCTTCGGGTCCTTGCAGGTGGCTGCCAATACCTCCACCGTGGAGCTTGTTGATGAGCTGGAGCCAGAGACCGACACACGGGAGCCACTGACTCGGATCCGCAACAACTCAGCCATCCACATCCGAGTCTTCAGGGTCACACCCAAGTAATTGAAAAGACACTCCTCCACTTATCCCCTCCGTGATATGGCTCTTCGCATGCTGAGTACTGGACCTCGGACCAGAGCCATGTAAGAAAAGGCCTGTTCCCTGGAAGCCCAAAGGACTCTGCATTGAGGGTGGGGGTAATTGTCTCTTGGTGGGCCCA
대조물질의 검출을 위하여 서열번호 29~32의 프라이머 및 서열번호 49-51의 프로브를 사용하였고, SARS-CoV-2 및 Sarbecovirus 검출을 위한 서열번호 1-28의 프라이머 및 서열번호 33-48의 프로브를 사용하여 실시간 역전사중합효소 반응을 진행하였고, 반응조건은 다음과 같다; PCR 반응액은 2X 반응 버퍼(One-step RT qPCR kit, 엔지노믹스, 한국), 0.05 μM 정방향 프라이머 및 0.5 μM 역방향 프라이머에 0.5 μl 형광 PNA를 첨가하고, 10 μl 표적물질 DNA를 첨가한 다음, 실시간 역전사중합효소 반응을 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였다. 그 결과 도 6에 개시된 바와 같이 SARS-CoV-2 또는 살베코바이러스가 존재하는 경우 형광이 검출되며, 존재하지 않을 경우 대조물질인 IC에서만 형광이 검출되는 것을 확인하였다.
실시예 6: SARS-CoV-2 의 최소검출한계 확인
살베코바이러스 및 신종코로나바이러스의 진단 키트의 검출한계를 확인하기 위하여 신종코로나바이러스의 ORF1ab 유전자, N 유전자, S 유전자 및 살베코바이러스의 E 유전자, 그리고 내부대조물질 Rnase P를 포함한 표적물질 1-5를 대상으로 프라이머(표 2) 및 PNA 프로브(표 3)를 사용하여 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)에서 PCR을 수행하였다.
각 표적물질은 1X107 copies 농도부터 1X102 copies 농도로 희석하여 사용하였으며, PCR 반응액은 총 볼륨 30㎕가 되게 2X 반응 버퍼(One-step RT qPCR kit, 엔지노믹스, 한국), 0.05 μM 정방향 프라이머 및 0.5 μM 역방향 프라이머에 0.5 μl 형광 PNA를 첨가하고, 10 μl 표적물질 DNA를 첨가한 다음, 실시간 역전사중합효소 반응을 실시하는 중간에 형광검출 분석을 수행하였다. 실험은 각각 3회 반복 확인하였다.
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 검출방법을 사용할 경우, 표적물질의 10 copies까지 검출이 가능한 것을 확인하였다.
실시예 6: 교차반응확인을 통한 SARS-CoV-2 진단 키트의 특이도 확인
살베코바이러스 및 신종코로나바이러스의 진단 키트의 특이도 확인을 위하여 표 4에서 제시된 바와 같이 반응물질인 SARS-CoV-2 표적물질 1- 3과, 살베코바이러스 표적물질 4, 내부대조물질인 RnaseP 표적물질 5와 24개의 비특이물질을 대상으로 실시예 2와 실시예 3에서 제작된 프라이머와 PNA 프로브를 사용하여 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)에서 PCR을 수행하였다.
PCR 반응은 총 볼륨 30㎕가 되게 2X 반응 버퍼(One-step RT qPCR kit, 엔지노믹스, 한국), 0.05 uM 정방향 프라이머(표 2) 및 0.5 μM 역방향 프라이머(표 2)에 0.5 μl 형광 PNA(표 3)를 첨가하고 10 μl 표적물질 DNA를 첨가한 다음, 실시간 역전사중합효소 반응을 실시하는 중간에 형광검출 분석을 수행하였다. 실험 과정의 도식은 도 2에 나타내었으며, 도 3의 조건으로 분석을 진행하였다. 실험은 각각 3회 반복 확인하였다.
그 결과 도 8와 같이 신종 코로나바이러스 및 살베코바이러스는 검출이 확인된 반면, 24개의 비반응물질에서는 표적핵산의 증폭이 일어나지 않는 것을 확인하였다.
특이도 (교차반응) 시험에 사용된 물질 분류표
특이물질 비 특이물질
SARS-CoV-2; ORF1ab
(표적물질 1)
SARS-CoV-2; N
(표적물질 2)
SARS-CoV-2; S
(표적물질 3)
Sarcovirus; E
(표적물질 4)
Rnase P
(표적물질 5)		 Adenovirus 1 KBPV-VR-1 DNA,
Adenovirus 3 KBPV-VR-2 DNA,
Adenovirus 8 KBPV-VR-3 DNA,
Coxsackievirus B1 KBPV-VR-13 RNA,
Coxsackievirus B2 KBPV-VR-14 RNA,
Coxsackievirus B3 KBPV-VR-15 RNA,
Influenza A virus H3N2 KBPV-VR-32 RNA,
Influenza A virus H1N1 KBPV-VR-33 RNA,
Parainfluenza virus KBPV-VR-44 RNA,
Parainfluenza virus KBPV-VR-45 RNA
Veillonella dispar
Streptococcus mitis
Staphylococcus aureus
H. influenzae
L. monocytogenes
N. meningitidis
S. agalactiae
S. pneumoniae
CMV
HSV-1
HSV-2
HHV-6
human coronavirus OC43 RNA
HeLa gDNAEBV plsma DNA(Acrometirx)
실시예 7: 임상샘플을 사용한 PNA 기반 SARS-CoV-2 진단 키트의 검증
신종코로나바이러스의 감염이 의심되는 임상조직에서 RNA를 추출한 후 기존 DNA 프로브를 이용한 real-time PCR 방식으로 확인된 임상샘플 1-3의 RNA를 대상으로 실시예 2 및 실시예 3에서 제작된 프라이머와 PNA 프로브를 사용하여 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)에서 PCR을 수행하였다.
PCR 반응은 총 볼륨 30㎕가 되게 PCR 반응은 총 볼륨 30㎕가 되게 PCR 반응액은 2X 반응 버퍼(One-step RT qPCR kit, 엔지노믹스, 한국), 0.05 μM 정방향 프라이머(표 2) 및 0.5 μM 역방향 프라이머(표 2)에 0.5 ul 형광 PNA(표 3)를 첨가하고 10 μl 표적물질 DNA를 첨가한 다음, 실시간 역전사중합효소 반응을 실시하는 중간에 형광검출 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 기존 방법으로 SARS-CoV-2 양성 또는 음성으로 확인된 샘플에서, 본 발명의 검출 진단 방법을 사용하여서도 SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자, S 유전자, N 유전자 및 살베코바이러스의 E 유전자 그리고 IC(Human Rnase P)의 형광이 검출되는 것을 확인하였으며, 음성 샘플에서는 IC(Human Rnase P)의 형광만 검출되는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
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<212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gctgcactta caccgcaaac c 21 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cacagtctgt accgtctgc 19 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gctgcactta caccgcaaac c 21 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 cctgctagaa tggctggcaa tgg 23 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gtgacagttt ggccttgttg ttgttgg 27 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 gaccaggaac taatcagaca aggaactg 28 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cctgtgtagg tcaaccacgt tcc 23 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 caaggaactg attacaaaca ttggccgc 28 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cgaaggtgtg acttccatgc caatg 25 <210> 17 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 ggtttaacag gcacaggtgt tcttactg 28 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 gaatctcaag tgtctgtgga tcacg 25 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cttcaatggt ttaacaggca caggtg 26 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 catggtgtaa tgtcaagaat ctcaagtg 28 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 caggcacagg tgttcttact gagtc 25 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ggtgttataa cactgacacc acc 23 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 gtactcattc gtttcggaag agacaggtac g 31 <210> 24 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 cacgttaaca atattgcagc agtacgc 27 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 ctcattcgtt tcggaagaga caggtacg 28 <210> 26 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 actcacgtta acaatattgc agcagtacgc a 31 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 gcgtacttct ttttcttgct ttcgtgg 27 <210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 ggttttacaa gactcacgtt aacaatattg cagc 34 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gagaccgaca cacgggag 18 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 ggggataagt ggaggagtgt 20 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 tgagctggag ccagagacc 19 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 aggtccagta ctcagcatg 19 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 33 caagtccatg gtaatgc 17 <210> 34 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 34 gcacatgtag ctagttg 17 <210> 35 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 35 cgcgaaccca tgctt 15 <210> 36 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 36 ccatgcttca gtcag 15 <210> 37 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 37 tgctgcttga cagattg 17 <210> 38 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 38 gctgctgctt gacag 15 <210> 39 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 39 gctttgctgc tgctt 15 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 40 gatgctgctc ttgctttg 18 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 41 tgcctttcca acaatttg 18 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 42 gtttctgcct ttccaaca 18 <210> 43 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 43 gacactactg atgctg 16 <210> 44 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 44 gcagagacat tgct 14 <210> 45 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 45 tagccatcct tactgc 16 <210> 46 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 46 cgtggtattc ttgctag 17 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 47 cactagccat ccttactg 18 <210> 48 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 48 tccttactgc gcttcg 16 <210> 49 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 49 caactcagcc atcca 15 <210> 50 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 50 cgagtcttca gggtcac 17 <210> 51 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 51 gtcttcaggg tcacacc 17 <210> 52 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ORF1ab gene of SARS-CoV-2 <400> 52 actgcttcag acacttatgc ctgttggcat cattctattg gatttgatta cgtctataat 60 ccgtttatga ttgatgttca acaatggggt tttacaggta acctacaaag caaccatgat 120 ctgtattgtc aagtccatgg taatgcacat gtagctagtt gtgatgcaat catgactagg 180 tgtctagctg tccacgagtg ctttgttaag cgtgttgact ggactattga atatcctata 240 attggtgatg aactgaagat taatgcggct tgtagaaagg ttcaacacat ggttgttaaa 300 300 <210> 53 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N gene of SARS-CoV-2 <400> 53 caagcctctt ctcgttcctc atcacgtagt cgcaacagtt caagaaattc aactccaggc 60 agcagtaggg gaacttctcc tgctagaatg gctggcaatg gcggtgatgc tgctcttgct 120 ttgctgctgc ttgacagatt gaaccagctt gagagcaaaa tgtctggtaa aggccaacaa 180 caacaaggcc aaactgtcac taagaaatct gctgctgagg cttctaagaa gcctcggcaa 240 aaacgtactg ccactaaagc atacaatgta acacaagctt tcggcagacg tggtccagaa 300 300 <210> 54 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S gene of SARS-CoV-2 <400> 54 tctacatgca ccagcaactg tttgtggacc taaaaagtct actaatttgg ttaaaaacaa 60 atgtgtcaat ttcaacttca atggtttaac aggcacaggt gttcttactg agtctaacaa 120 aaagtttctg cctttccaac aatttggcag agacattgct gacactactg atgctgtccg 180 tgatccacag acacttgaga ttcttgacat tacaccatgt tcttttggtg gtgtcagtgt 240 tataacacca ggaacaaata cttctaacca ggttgctgtt ctttatcagg atgttaactg 300 300 <210> 55 <211> 300 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E gene of Sarbecovirus <400> 55 gacgacgact actagcgtgc ctttgtaagc acaagctgat gagtacgaac ttatgtactc 60 attcgtttcg gaagagacag gtacgttaat agttaatagc gtacttcttt ttcttgcttt 120 cgtggtattc ttgctagtta cactagccat ccttactgcg cttcgattgt gtgcgtactg 180 ctgcaatatt gttaacgtga gtcttgtaaa accttctttt tacgtttact ctcgtgttaa 240 aaatctgaat tcttctagag ttcctgatct tctggtctaa acgaactaaa tattatatta 300 300 <210> 56 <211> 400 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 56 cggggtcaga acgcgtgctc tgagatctac attcacggct tgggcctggc catcaaccgc 60 gccatcaaca tcgcgctgca gctgcaggcg ggcagcttcg ggtccttgca ggtggctgcc 120 aatacctcca ccgtggagct tgttgatgag ctggagccag agaccgacac acgggagcca 180 ctgactcgga tccgcaacaa ctcagccatc cacatccgag tcttcagggt cacacccaag 240 taattgaaaa gacactcctc cacttatccc ctccgtgata tggctcttcg catgctgagt 300 actggacctc ggaccagagc catgtaagaa aaggcctgtt ccctggaagc ccaaaggact 360 ctgcattgag ggtgggggta attgtctctt ggtgggccca 400

Claims (12)

  1. 다음을 포함하는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 진단을 위한 PNA 프로브 셋트:
    신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)의 ORF1ab 유전자와 혼성화하는 서열번호 34의 서열을 포함하는 PNA 프로브;
    신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)의 N 유전자와 혼성화하는 서열번호 39의 서열을 포함하는 PNA 프로브;
    신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)의 S 유전자와 혼성화하는 서열번호 41의 서열을 포함하는 PNA 프로브; 및
    살베코바이러스 (Sarbecovirus)의 E 유전자와 혼성화하는 서열번호 47의 서열을 포함하는 PNA 프로브.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 리포터와 소광자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 검출용 PNA 프로브 셋트.
  4. 제3항에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro- 6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy5 및 Alexa 680으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 검출용 PNA 프로브 셋트
  5. 제3항에 있어서, 상기 소광자 (quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 검출용 PNA 프로브 셋트.
  6. 다음 (i)~(iv)로 구성되는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus)의 유전자 증폭용 프라이머 쌍 (primer pair)을 포함하는 프라이머 셋트:

    (i) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    (ii) 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    (iii) 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 및
    (iv) 서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍.
  7. 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 PNA 프로브 셋트 및 제 6항의 프라이머 셋트를 포함하는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 검출용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 대조물질; 및 이를 검출하기 위한 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍 중 선택되는 프라이머 쌍 및 서열번호 49 ~ 51 중 어느 하나의 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 검출용 조성물.
  9. 제8항의 조성물을 포함하는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 검출용 키트.
  10. 다음 단계를 포함하는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus)를 검출하는 방법;
    (a) 검체 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
    (b) 제6항의 프라이머 셋트를 이용하여 신종 코로나바이러스의 ORF1ab 유전자, S 유전자, N 유전자 또는 살베코바이러스의 E 유전자를 증폭시켜 증폭산물을 수득하는 단계;
    (c) 상기 증폭산물을 제1항 및 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 PNA 프로브 셋트와 혼성화시키는 단계; 및
    (d) 형광검출 측정을 통해 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 감염을 판정하는 단계.

  11. 제10항에 있어서, 상기 (b) 단계는 대조물질 증폭을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 대조물질의 증폭은 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍을 이용하여 수행하고, 서열번호 49의 PNA 프로브로 검출하는 것을 특징으로 하는 방법.
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