WO2022005255A2 - Pna 프로브를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 sars-cov-2 및 살베코바이러스의 동시 진단방법 및 진단용 키트 - Google Patents

Pna 프로브를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 sars-cov-2 및 살베코바이러스의 동시 진단방법 및 진단용 키트 Download PDF

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박희경
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    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Definitions

  • the present invention provides a method for simultaneous detection of Sarbecovirus, one of the subgenus of beta-coronavirus, and a novel coronavirus (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) that causes coronavirus infection-19. It relates to an analysis method and diagnostic kit, and more particularly, to a PNA probe for detection of salvecovirus and SARS-CoV-2 using a PNA probe, and a method for determining whether infection is present using a primer and multiplex analysis.
  • Coronavirus is an enveloped, single-stranded, positive RNA virus with a genome size of 25-32 kb, which belongs to a relatively large virus among RNA viruses known so far. It has a specific structure in the shape of a flame or crown because the spike protein, which is a club-shaped protrusion, is embedded in the outer skin, and the name of the virus is derived from Corona, which means crown in Latin.
  • coronaviruses found in various birds and animals, including bats, birds, cats, dogs, cattle, pigs, and mice, have been divided into four groups (Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta- corona virus).
  • coronavirus groups mainly infect mammals, while the gamma and delta coronavirus groups can be found in birds.
  • Coronaviruses are known to cause a variety of diseases in animals, such as gastrointestinal and respiratory diseases.
  • Human coronaviruses that infect humans include HCoV-229E and HCoV-OC43 discovered in the 1960s, and HCoV-NL63 (2004) and HCoV-HKU1 (2005) discovered after the SARS pandemic, which are generally not associated with upper respiratory tract infections. It is known that it can lead to serious lung disease in immunodeficiency patients.
  • SARS-CoV Severe Acute Respiratory Syndrome
  • HCV-EMC Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus
  • Coronavirus Infectious Disease-19 is a viral respiratory disease that occurred in Wuhan, China in December 2019. It is also called 'Wuhan pneumonia', 'novel coronavirus infection', 'corona 19'. It is an epidemic disease caused by the novel coronavirus, which is transmitted through the respiratory tract, and shows strong contagious characteristics in the early stages of infection with few symptoms. After infection, symptoms such as sore throat, high fever, cough, and shortness of breath develop into pneumonia. After it spread worldwide in March 2020, the World Health Organization declared the disease a pandemic.
  • Coronavirus Infectious Disease-19 (Covid-19) is mainly transmitted through the respiratory tract. When infected, the virus invades the lungs, causing symptoms such as high fever, coughing, and shortness of breath, and after showing symptoms similar to pneumonia, in severe cases, the alveoli are damaged, leading to death from respiratory failure.
  • the incubation period is 3 to 7 days, but can last up to 14 days. On January 30, 2020, China announced that there were cases where the incubation period was extended to 23 days. It has been reported that COVID-19 is transmitted even during the incubation period when there are no symptoms.
  • SARS-CoV-2 which currently causes COVID-19, is basically diagnosed by 'conventional PCR' and sequencing.
  • the pan-coronavirus test method first tests for the presence or absence of all coronaviruses, including the novel coronavirus, and if it is negative, it means that it is not a coronavirus infection. If it is positive, it is determined whether it is another coronavirus causing a cold or a novel coronavirus through gene sequencing. Therefore, it takes 1 to 2 days for diagnosis.
  • PNA Protein Nucleic Acid
  • SARS-CoV-2 which causes Sarbecovirus, one of the subgenus of beta-coronavirus, and Coronavirus Infectious Disease-19, has a higher sensitivity and specificity than conventional DNA probes, but has several
  • the detection of target nucleic acids of SARS-CoV-2 and salvecovirus by real time-RT PCR using PNA probes was higher than that using conventional DNA probes. It was confirmed that the target gene can be detected with sensitivity and specificity, and the present invention has been completed.
  • Another object of the present invention is to provide a method for simultaneous detection of multiple genes of SARS-CoV-2, which causes Sarbecovirus, one of the subgenus of beta-coronavirus, and SARS-CoV-2, which causes coronavirus infection-19, using the probe and primer pair. is to provide
  • the present invention is one of the subgenus of beta-coronavirus comprising any one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 48 Salbecovirus (Sarbecovirus) and coronavirus infection
  • SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 48 Salbecovirus (Sarbecovirus) and coronavirus infection Provided is a PNA probe for diagnosing SARS-CoV-2 causing -19.
  • the present invention also provides a primer pair for gene amplification of novel coronavirus (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) and Sarbecovirus selected from the following (i) to (xiv) provides:
  • (x) a primer pair consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 19 and a reverse primer of SEQ ID NO: 20;
  • (xii) a primer pair consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 23 and a reverse primer of SEQ ID NO: 24;
  • (xiii) a primer pair consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 25 and a reverse primer of SEQ ID NO: 26;
  • (xiv) a primer pair consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 27 and a reverse primer of SEQ ID NO: 28.
  • the present invention also provides a composition for diagnosis of salvecovirus and SARS-CoV-2 comprising the PNA probe and primer pair.
  • the present invention also provides a method for detecting salvecovirus and SARS-CoV-2 comprising the steps of;
  • FIG 1 shows the standard nucleic acid production method and vector map of SARS-CoV-2 used in the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the analysis of multiple genes of salvecovirus and SARS-CoV-2 using a PNA probe.
  • FIG. 3 is a schematic diagram showing PCR reaction conditions for confirming whether or not infection with Salbecovirus and SARS-CoV-2.
  • A is the detection result of salvecovirus and SARS-CoV-2;
  • B shows the results of non-detection of salvecovirus and SARS-CoV-2.
  • Rnase P which is a control material (IC, internal control) used in the present invention.
  • FIG 6 shows the results of the salbecovirus and SARS-CoV-2 detection kit according to an embodiment of the present invention
  • A is the detection result of salvecovirus and SARS-CoV-2
  • B shows the results of non-detection of salvecovirus and SARS-CoV-2.
  • FIG. 8 shows the cross-reaction results for confirming the specificity of the salvecovirus and SARS-CoV-2 detection kit according to an embodiment of the present invention.
  • Sarbecovirus one of the subgenus of beta-coronavirus, and SARS-CoV-2, which causes coronavirus infection-19, have higher sensitivity and specificity than RT-PCR using DNA probes, As a diagnostic method, it is possible to specifically amplify the E gene of Sarbecovirus, the ORF1ab gene of SARS-CoV-2 that causes coronavirus infection-19, the N gene, the S gene, and the internal control gene human Rnase P gene. A primer that can be used was designed.
  • the ORF1ab, S, N, E, Rnase P genes amplified by the primers are hybridized using a PNA (Peptide Nucleic Acid) probe using PNA, which has superior recognition and binding ability for target DNA than DNA. It can be characterized in that the amplification product is identified.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • the PNA probe according to the present invention is one of the subgenus of beta-coronavirus comprising any one sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 33 to SEQ ID NO: 48 Sarbecovirus and coronavirus infection It can be characterized as a PNA probe for diagnosing SARS-CoV-2 that causes -19.
  • the PNA probe is not limited, but may be characterized in that a reporter or a quencher is bound.
  • the probe of the present invention may bind to both ends of a reporter and a fluorescent material of a quencher capable of quenching reporter fluorescence, and may include an intercalating fluorescent material.
  • the reporter may be one or more selected from the group consisting of FAM (6-carboxyfluorescein), HEX, Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3, Alexa680, and the quencher is TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, It is preferred, but not limited to, BHQ2 or Dabcyl.
  • the intercalating fluorescent material is acridine homodimer and its derivatives, acridine orange and its derivatives, 7-aminoactinomycin D (7-AAD) and Derivatives thereof, Actinomycin D and derivatives thereof, ACMA (9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) and derivatives thereof, DAPI and derivatives thereof, dihydroethidium (Dihydroethidium) and its derivatives, ethidium bromide and its derivatives, ethidium homodimer-1 (EthD-1) and its derivatives, ethidium homodimer-2 (EthD-2) and its derivatives, ethidium Ethidium monoazide and its derivatives, Hexidium iodide and its derivatives, bisbenzimide (Hoechst 33258) and its derivatives, Hoechst 33342 and its derivatives, ho Hoechst 34580 and its derivatives, hydroxystilbamidine and its derivatives,
  • the present invention provides a primer pair for gene amplification of novel coronavirus (Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) and salbecovirus selected from the following (i) to (xiv) from another viewpoint. It is about (primer pair):
  • (x) a primer pair consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 19 and a reverse primer of SEQ ID NO: 20;
  • (xii) a primer pair consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 23 and a reverse primer of SEQ ID NO: 24;
  • (xiii) a primer pair consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 25 and a reverse primer of SEQ ID NO: 26;
  • (xiv) a primer pair consisting of a forward primer of SEQ ID NO: 27 and a reverse primer of SEQ ID NO: 28.
  • the present invention relates to a composition for detecting beta corona and SARS-CoV-2 comprising the PNA probe and the primer pair.
  • the composition comprises a control material; a primer pair of a forward primer of SEQ ID NO: 29 and a reverse primer of SEQ ID NO: 30, a primer pair of a forward primer of SEQ ID NO: 31 and a reverse primer of SEQ ID NO: 32 for detecting this; And it may be characterized in that it further comprises a PNA probe of SEQ ID NOs: 49-53, but is not limited thereto.
  • the internal control material can be used without limitation as long as it is a gene that can confirm the success of the reverse transcription polymerase chain reaction in a clinical sample regardless of the presence or absence of salvecovirus and SARS-CoV-2, but preferably It can be characterized as an RNA region of the homosapiens species Rnase P gene.
  • the primer set is a primer for analysis using a real-time polymerase chain reaction method, preferably, it may be characterized in that it is for analysis using a reverse transcription polymerase chain reaction.
  • the present invention relates to a kit for detecting salvecovirus and SARS-CoV-2 comprising the composition.
  • the kit may add RNA, DNA synthetase, dNTPs, buffers, and the like, and may further include a user manual describing optimal reaction conditions.
  • Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 SARS-CoV-2
  • Sarbecovirus infection through fluorescence detection measurement is about
  • the specimen sample is a DNA or RNA molecule, and the molecule may be in a double-stranded or single-stranded form.
  • the nucleic acid as an initial material is single-stranded RNA
  • cDNA complementary DNA
  • the nucleic acid as a starting material is double-stranded, it is preferable to make the two strands into a single-stranded or partially single-stranded form.
  • Methods known to separate strands include, but are not limited to, heat, alkali, formamide, urea and glycoxal treatment, enzymatic methods (eg, helicase action) and binding proteins.
  • strand separation can be achieved by heat treatment at a temperature of 80°C to 105°C.
  • the gene is not limited, but may be the ORF1ab gene of SARS-CoV-2, the S gene or the N gene, or the E gene of salvecovirus.
  • the specimen is not limited, but in the present invention, the "specimen sample” includes various samples, and preferably, a biosample is analyzed using the method of the present invention. More preferably, it may be a sample mixed with the virus species described in the present invention or a sample from an individual (eg, human, etc.) infected with the virus, and is an organism of plant, animal, human, fungus, bacterial and viral origin. A sample may be analyzed. When analyzing a sample of mammalian or human origin, the sample may be derived from a specific tissue or organ.
  • organs include bronchus, lung, nasal cavity, eye, brain, liver, spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph, blood, bone, cartilage, pancreas, kidney, gallbladder, stomach, small intestine, testis, ovary, uterus, Rectal, nervous system, glandular and internal blood vessels are included.
  • a biological sample to be analyzed includes any cell, tissue, fluid from a biological source, or any other medium that can be well analyzed by the present invention, which includes human, animal, human or animal consumption.
  • samples obtained from food prepared for In addition, biological samples to be analyzed include bodily fluid samples, which include saliva, sputum, runny nose, droplet, blood, serum, plasma, lymph, breast milk, urine, feces, eye fluid, saliva, semen, brain extract (eg, brain grinding). water), spinal fluid, appendix, spleen and tonsil tissue extracts.
  • bodily fluid samples include saliva, sputum, runny nose, droplet, blood, serum, plasma, lymph, breast milk, urine, feces, eye fluid, saliva, semen, brain extract (eg, brain grinding). water), spinal fluid, appendix, spleen and tonsil tissue extracts.
  • the analysis method is not limited, but may be characterized in that it is performed by a reverse transcription polymerase chain reaction (Reverse transcription real time PCR) method.
  • Reverse transcription real time PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • step b) may be characterized in that it further comprises a control material.
  • the internal control material is a gene that can confirm the success of the reverse transcription polymerase chain reaction of a clinical sample regardless of the presence or absence of salbecovirus and novel coronavirus (SARS-CoV-2) Although it can be used without limitation, it may preferably be characterized as an RNA region of a homosapiens sp. Rnase P gene.
  • the 'target nucleic acid', 'synthetic DNA' or 'artificial oligo' of the present invention means a nucleic acid sequence to be detected, and the nucleic acid sequence of a 'target gene' encoding a protein having physiological and biochemical functions. It contains a specific site and is annealed or hybridized with a primer or probe under hybridization, annealing or amplification conditions.
  • Hybridization' in the present invention means that complementary single-stranded nucleic acids form double-stranded nucleic acids. Hybridization may occur when complementarity between two nucleic acid strands is perfect (perfect match) or even when some mismatched bases are present. The degree of complementarity required for hybridization may vary depending on hybridization conditions, and in particular may be controlled by temperature.
  • the PNA probe containing the reporter and quencher of the present invention generates a fluorescent signal after hybridization with the target nucleic acid, and the presence or absence of the target nucleic acid can be detected through analysis.
  • ORF1ab gene, N gene, S gene and E gene (target material 1-4) of salvecovirus of novel coronavirus were synthesized (Cosmo Jintech Co., Ltd., Korea). ), the nucleotide sequence of each target material is shown in Table 1 below, and the vector map is shown in FIG.
  • Example 2 Preparation of primers for amplification of SARS-CoV-2, Sarbecovirus and control material
  • primers of SEQ ID NOs: 1 to 32 were prepared as shown in Table 2 below.
  • PNA probes of SEQ ID NOs: 33 to 48 were prepared, and fluorescence and quenchers were respectively coupled to both ends of the probe sequence for multiple amplification (Table 3).
  • CFX96TM Fluorescence was measured by performing a real-time reverse transcriptase reaction using a Real-Time system (BIO-RAD, USA).
  • PCR For PCR, asymmetric PCR was used to generate a single-stranded target nucleic acid, and the PCR reaction solution was 2X reaction buffer (One-step RT qPCR kit, Engenomics, Korea), 0.05 ⁇ M forward primer and 0.5 ⁇ M reverse primer. 0.5 ⁇ l of fluorescent PNA was added thereto, 10 ⁇ l of target material DNA was added, and then, fluorescence detection analysis was performed during the real-time reverse transcriptase reaction. The schematic of the experimental process is shown in FIG. 2 and the conditions for the reverse transcriptase reaction are shown in FIG. 3 .
  • Primers of SEQ ID NOs: 29-32 and probes of SEQ ID NOs: 49-51 were used for the detection of control substances, and primers of SEQ ID NOs: 1-28 and probes of SEQ ID NOs: 33-48 for detecting SARS-CoV-2 and Sarbecovirus
  • a real-time reverse transcriptase reaction was performed using The PCR reaction solution was prepared by adding 0.5 ⁇ l fluorescent PNA to 2X reaction buffer (One-step RT qPCR kit, Engenomics, Korea), 0.05 ⁇ M forward primer and 0.5 ⁇ M reverse primer, and 10 ⁇ l target DNA, followed by real-time In the middle of the reverse transcriptase reaction, fluorescence detection analysis was performed. As a result, as shown in FIG. 6 , it was confirmed that fluorescence was detected when SARS-CoV-2 or salvecovirus was present, and fluorescence was detected only in IC, a control material, when absent.
  • target substances 1-5 including ORF1ab gene, N gene, S gene and E gene of salvecovirus, and internal control material Rnase P of novel coronavirus PCR was performed on the CFX96TM Real-Time system (BIO-RAD, USA) using primers (Table 2) and PNA probes (Table 3) for .
  • Each target material was diluted from a concentration of 1X10 7 copies to a concentration of 1X10 2 copies, and the PCR reaction solution was used so that the total volume was 30 ⁇ l 2X reaction buffer (One-step RT qPCR kit, Engnomics, Korea), 0.05 ⁇ M forward primer And 0.5 ⁇ l fluorescent PNA was added to 0.5 ⁇ M reverse primer, 10 ⁇ l target DNA was added, and then fluorescence detection analysis was performed in the middle of real-time reverse transcriptase reaction. Each experiment was repeated three times.
  • PCR reaction was performed in 2X reaction buffer (One-step RT qPCR kit, Engenomics, Korea), 0.05 ⁇ M forward primer (Table 2) and 0.5 ⁇ M reverse primer (Table 2) in 0.5 ⁇ l fluorescent PNA (Table 2) to a total volume of 30 ⁇ l. 3) was added, 10 ⁇ l of target material DNA was added, and fluorescence detection analysis was performed in the middle of real-time reverse transcriptase reaction.
  • 2X reaction buffer One-step RT qPCR kit, Engenomics, Korea
  • 0.05 ⁇ M forward primer Table 2
  • 0.5 ⁇ M reverse primer Table 2
  • fluorescent PNA Table 2 PCR reaction was added
  • 10 ⁇ l of target material DNA was added
  • fluorescence detection analysis was performed in the middle of real-time reverse transcriptase reaction.
  • FIG. 2 A schematic of the experimental process is shown in FIG. 2 , and analysis was performed under the conditions of FIG. 3 . Each experiment was repeated three times.
  • Example 7 Verification of a PNA-based SARS-CoV-2 diagnostic kit using clinical samples
  • RNA from clinical tissue suspected of being infected with novel coronavirus After extracting RNA from clinical tissue suspected of being infected with novel coronavirus, the primers prepared in Examples 2 and 3 and PCR was performed on a CFX96TM Real-Time system (BIO-RAD, USA) using a PNA probe.
  • the PCR reaction solution is 2X reaction buffer (One-step RT qPCR kit, Engenomics, Korea), 0.05 ⁇ M forward primer (Table 2), and 0.5 ⁇ M 0.5 ul of fluorescent PNA (Table 3) was added to the reverse primer (Table 2), 10 ⁇ l of target material DNA was added, and then fluorescence detection analysis was performed during the real-time reverse transcriptase reaction.
  • ORF1ab, N, S genes of SARS-CoV-2, E genes and internal control genes of SARS-CoV-2, and internal control genes by using a PNA probe compared to the conventional method using a DNA probe used for diagnosis of coronavirus infection-19 Simultaneous multiplex analysis of human Rnase P genes is possible, enabling high sensitivity and high accuracy diagnosis of SARS-CoV-2 and Salvecovirus infection.

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Abstract

본 발명은 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcription Real-time polymerase chain reaction)을 이용한 베타코로나바이러스의 하속(subgenus)중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)를 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게 살베코바이러스 및 신종 코로나바이러스의 동시 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 이를 이용한 감염여부 판별방법에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 종래 코로나바이러스감염증-19 진단에 사용되는 DNA 프로브를 이용한 PCR과 RT-PCR 방법에 비해 민감도와 특이도가 높으며 신종 코로나바이러스의 ORF1ab 유전자, S 유전자, N 유전자 및 살베코바이러스의 E 유전자를 동시 증폭 및 판별할 수 있어, 고민감도와 높은 정확성을 가지고 신종 코로나바이러스 및 살베코바이러스의 감염 여부분석 가능하다.

Description

PNA 프로브를 이용한 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-COV-2 및 살베코바이러스의 동시 진단방법 및 진단용 키트
본 발명은 베타코로나바이러스의 하속(subgenus)중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)의 동시 검출을 위한 분석방법과 진단용 키트에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 PNA 프로브를 이용한 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2의 검출용 PNA 프로브와 프라이머 및 다중분석을 이용한 감염 여부 판별방법에 관한 것이다.
코로나바이러스는 외피가 있는 단일가닥의 양성 RNA 바이러스이며 게놈 크기는 25-32kb로 지금까지 알려진 RNA 바이러스 중에서는 비교적 큰 바이러스에 속한다. 외피에 곤봉모양의 돌기인 스파이크(spike) 단백질이 박혀 있어 화염 또는 왕관 모양의 특이적 구조를 가지고 있으며, 라틴어로 왕관이라는 뜻인 Corona로부터 바이러스 이름이 유래되었다. 1937년 닭에서 처음으로 발견된 후 박쥐, 새, 고양이, 개, 소, 돼지, 쥐 등 다양한 조류와 동물에서 발견된 코로나바이러스는 4개의 그룹(Alpha-, Beta-, Gamma-, Delta- corona virus)으로 나누어진다. 알파와 베타코로나바이러스 그룹은 포유류에 주로 감염되고 감마와 델타코로나바이러스 그룹은 조류에서 찾을 수 있다. 코로나바이러스는 동물들에서 위장병 및 호흡기질환과 같은 다양한 질환을 일으킬 수 있다고 알려져 있다. 사람에게 감염되는 사람 코로나바이러스는 1960대 발견된 HCoV-229E와 HCoV-OC43, 사스 대유행 이후 발견된 HCoV-NL63(2004년)과 HCoV-HKU1(2005년)로 이들은 일반적으로 상기도 감염증과 관계가 있다고 알려져 있으나 면역결핍환자들에게는 심각한 폐질환을 유도하기도 한다. 주로 겨울이나 이른 봄에 코로나바이러스에 대한 감염률이 증가된다고 보고되고 있고, 성인 감기환자 중 코로나바이러스가 원인 병원체인 비율이 상당히 높다고 알려져 있다. 2003년 중증급성호흡기증후군(Severe Acute Respiratory Syndrome, SARS)을 일으키는 사스 코로나바이러스(SARS-CoV)가 처음 발견되었으며 세계보건기구(WHO) 보고에 따르면 2002년에서 2003년 동안 전 세계적으로 8,273명의 환자와 775명의 사망자(치사율 약 10%)가 발생하였고, 2004년까지 추가적인 환자 발생과 사망자가 보고되었다(Saif LJ., Rev. Sci. Tech., 23:643, 2004).
2012년 9월 사스와 유사한 고열, 기침, 호흡곤란 등의 호흡기 증상을 나타내는 중중 호흡기질환 환자가 발생하였고, 이 원인 병원체는 기존의 알려진 바이러스와는 다른 신종 코로나바이러스(HCoV-EMC)로 밝혀졌다. 이 바이러스는 중동호흡기 증후군 코로나바이러스 또는 메르스 코로나바이러스(Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus; MERS-CoV)로 불리며, 사람에게 감염되었을 때에 중증의 호흡기 질환을 유발하여 사망에 이르게 하며(Zaki AM et al., N Engl J Med, 367:1814, 2012), 2015년 5월 우리나라에서 발생하여 38명의 사망자를 낸 바 있다.
코로나바이러스감염증-19는 2019년 12월 중국 우한시에서 발생한 바이러스성 호흡기 질환이다. '우한 폐렴', '신종코로나바이러스감염증', '코로나19'라고도 한다. 신종 코로나바이러스에 의한 유행성 질환으로 호흡기를 통해 감염되며, 증상이 거의 없는 감염 초기에 전염성이 강한 특징을 보인다. 감염 후에는 인후통, 고열, 기침, 호흡곤란 등의 증상을 거쳐 폐렴으로 발전한다. 2020년 3월 전세계로 확산되자, 세계보건기구는 이 질환에 대해 팬데믹을 선언했다.
코로나바이러스감염증-19(Covid-19)는 주로 호흡기로 전염된다. 감염되었을 경우 바이러스는 폐를 침범하며, 고열과 기침, 호흡곤란 등의 증상이 발생하고 폐렴과 유사한 증상을 보인 끝에 심한 경우 폐포가 손상되어 호흡 부전으로 사망에 이르기도 한다. 잠복기는 3~7일이지만 최장 14일까지 이어지기도 한다. 2020년 1월 30일 중국에서는 잠복기가 23일까지 늘어난 사례가 있다고 발표했다. 코로나바이러스감염증-19는 증상이 나타나지 않는 잠복기 중에도 전염되는 사례가 있다고 보고되었다.
코로나바이러스감염증-19의 잠복기 무증상 시에도 전염되는 특성과 강한 전염성으로 인해 인접한 지역으로 신속하게 확산되기 때문에 조기 검출에 의한 환자의 격리 및 관리가 매우 중요하다.
현재 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2는 기본적으로 '판코로나바이러스 검사법(Conventional PCR)'과 염기서열 분석으로 진단한다. 판코로나바이러스 검사법은 신종코로나바이러스를 포함한 모든 코로나바이러스의 존재 유무를 우선 검사하는 것으로, 음성으로 판정되면 코로나바이러스 감염이 아님을 의미한다. 만일 양성인 경우에는 감기를 일으키는 다른 코로나바이러스인지, 신종코로나바이러스인지 유무를 유전자염기서열 분석을 통해 판단한다. 이에 따라 진단에 1~2일 정도 소요된다.
한국의 질병관리본부는 2020년 1월 31일부터는 검사속도와 편의성이 향상된 '실시간 유전자 증폭검사(Real Time RT-PCR)'를 통해 진단하고 있는데 이 검사방법으로는 6시간 이내에 결과 확인이 가능하다.
현재 민감도 및 특이도가 보다 향상된 효과적인 검출이 가능한 검출 방법이 필요한 실정이다.
PNA (Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브는 DNA보다 타겟 DNA에 대한 인식능력 및 결합 능력이 뛰어나 DNA 프로브보다 빠르고 강하게 타겟 DNA와 결합할 수 있는 특징을 사용하여 민감도와 특이도를 개선할 수 있는 장점이 있다.
이에, 본 발명자들은 베타코로나바이러스의 하속(subgenus)중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 기존의 DNA 프로브보다 높은 민감도와 특이도를 가지면서도 여러 개의 타겟 검출방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, PNA 프로브를 사용하여, Real time-RT PCR법으로 SARS-CoV-2 및 살베코바이러스의 표적 핵산을 검출하는 경우, 기존의 DNA 프로브를 이용한 방법보다 높은 민감도와 특이도로 표적 유전자를 검출할 수 있는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
발명의 요약
본 발명의 목적은 베타코로나바이러스의 하속(subgenus)중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 검출할 수 있는 프로브 및 프라이머 쌍을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로브 및 프라이머 쌍을 이용한 베타코로나바이러스의 하속(subgenus)중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2의 다중 유전자 동시 검출 방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 33 내지 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 베타코로나바이러스의 하속(subgenus)중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2 진단을 위한 PNA 프로브를 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 (i)~(xiv)에서 선택되는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus)의 유전자 증폭용 프라이머 쌍 (primer pair)을 제공한다:
(i) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(ii) 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iii) 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iv) 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(v) 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(vi) 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(vii) 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(viii) 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(ix) 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(x) 서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(xi) 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(xii) 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(xiii) 서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 및
(xiv) 서열번호 27의 정방향 프라이머 및 서열번호 28의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍.
본 발명은 또한, 상기 PNA 프로브 및 프라이머 쌍을 포함하는 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2의 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, 다음 단계를 포함하는 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2를 검출하는 방법을 제공한다;
(a) 검체 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 쌍을 이용하여 신종 코로나바이러스의 ORF1ab, S, N 유전자 및 살베코바이러스의 E 유전자를 증폭시켜 증폭산물을 수득하는 단계;
(c) 상기 증폭산물을 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있는 상기 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계 및
(d) 형광검출 측정을 통해 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 또는 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 감염을 판정하는 단계.
도 1은 본 발명에서 사용한 SARS-CoV-2의 표준핵산 제작방법 및 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 2는 PNA 프로브를 사용하여 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2의 다중 유전자를 분석하는 것을 나타낸 모식도이다.
도 3은 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 감염여부를 확인하기 위한 PCR 반응조건을 나타내는 모식도이다.
도 4는 서열번호1-28 프라이머 및 서열번호 33-49 프로브 조합에 의한 표적물질 검출 결과이다. A는 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 검출 결과; B는 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 미검출 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에서 사용한 대조물질(IC, Internal control)인 Rnase P의 표준핵산 제작 및 벡터맵을 나타낸 것이다.
도 6는 본 발명의 실시예에 따른 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 검출 키트의 결과를 나타낸 것으로, A는 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 검출 결과; B는 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 미검출 결과를 나타낸 것이다.
도 7는 본 발명의 실시예에 따른 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 검출 키트의 최소검출한계(Limit of Detection, LOD)를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 검출 키트의 특이도를 확인하기 위한 교차반응 결과를 나타낸 것이다.
도 9. 본 발명의 실시예에 따른 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2 검출 키트의성능을 확인하기 위해 임상검체 1 내지 3에서 확인한 결과이다.
발명의 상세한 설명 및 바람직한 구현예
베타코로나바이러스의 하속(subgenus) 중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2를 DNA 프로브를 이용한 RT-PCR 보다 높은 민감도와 특이도를 가지고 다중 유전자를 동시에 진단하는 방법으로, 살베코바이러스(Sarbecovirus)의 E 유전자, 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자, N 유전자, S 유전자, 내부대조유전자 human Rnase P 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머를 디자인하였다. 아울러 상기 프라이머에 의해 증폭된 ORF1ab, S, N, E, Rnase P 유전자는 DNA보다 타겟 DNA에 대한 인식능력 및 결합 능력이 뛰어난 PNA를 사용한 PNA(Peptide Nucleic Acid, 펩티드핵산) 프로브를 이용하여 혼성화하여 증폭산물을 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.
바람직하게는 본 발명에 따른 PNA 프로브는 서열번호 33 내지 서열번호 48로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 서열을 포함하는 베타코로나바이러스의 하속(subgenus)중 하나인 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 코로나바이러스감염증-19을 일으키는 SARS-CoV-2 진단을 위한 PNA 프로브인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 PNA 프로브는 제한되지는 않으나 리포터 또는 소광자가 결합되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 프로브는 양 말단에 리포터와 리포터 형광을 소광할 수 있는 소광자의 형광 물질이 결합할 수 있으며, 인터컬레이팅(intercalating) 형광 물질을 포함할 수 있다. 상기 리포터는 FAM(6-carboxyfluorescein), HEX, Texas red, JOE, TAMRA, CY5, CY3, Alexa680 로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 상기 소광자는 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 또는 Dabcyl을 사용하는 것이 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인터컬레이팅 형광 물질은 아크리딘 호모다이머(Acridine homodimer) 및 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 및 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 및 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 및 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 및 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 및 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 및 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 및 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 및 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 및 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 및 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 및 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 및 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 및 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 및 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI)와 이의 유도체 및 사이다이스(Cy-dyes) 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 다음 (i)~(xiv)에서 선택되는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus)의 유전자 증폭용 프라이머 쌍 (primer pair)에 관한 것이다:
(i) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(ii) 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iii) 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(iv) 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(v) 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(vi) 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(vii) 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(viii) 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(ix) 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(x) 서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(xi) 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(xii) 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
(xiii) 서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 및
(xiv) 서열번호 27의 정방향 프라이머 및 서열번호 28의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 PNA 프로브 및 상기 프라이머 쌍을 포함하고 있는 베타 코로나 및 SARS-CoV-2의 검출용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 조성물은 대조물질; 이를 검출하기 위한 서열번호 29의 정방향 프라이머와 서열번호 30의 역방향 프라이머의 프라이머 쌍, 서열번호 31의 정방향 프라이머와 서열번호 32의 역방향 프라이머의 프라이머 쌍; 및 서열번호 49~53의 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 내부대조물질은 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2의 존재 유무와 상관없이 임상 검체의 역전사 중합효소 연쇄반응의 성공 여부를 확인할 수 있는 유전자이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 homosapiens 종 Rnase P 유전자의 RNA 부위인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 분석 방법은 제한상기 프라이머 세트는 실시간 중합효소 연쇄반응 방법을 이용한 분석용 프라이머이며, 바람직하게는 역전사 중합효소 연쇄반응을 이용한 분석용인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 조성물을 포함하는 살베코바이러스 및 SARS-CoV-2의 검출용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 RNA, DNA 합성 효소, dNTPs 및 버퍼 등을 추가할 수 있으며 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서,
(a) 검체 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
(b) 상기 프라이머 쌍을 이용하여 신종 코로나바이러스의 ORF1ab, S, N 유전자 및 살베코바이러스의 E 유전자를 증폭시켜 증폭산물을 수득하는 단계;
(c) 상기 증폭산물을 리포터 (reporter) 및 소광자 (quencher)가 결합되어 있는 상기 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계 및
(d) 형광검출 측정을 통해 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 또는 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 감염을 판정하는 단계를 포함하는 살베코바이러스 및 신종 코로나바이러스의 검출방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 검체 시료는 DNA 또는 RNA 분자이며, 상기 분자는 이중가닥 또는 단일가닥 형체일 수 있다. 초기물질로써 핵산이 RNA 단일가닥인 경우, RNA 가닥을 complementary DNA(cDNA) 가닥으로 합성하는 역전사 반응단계를 거치는 것이 바람직하다. 이는 역전사효소(reverse trascriptase)를 사용하여 달성 될 수 있으며 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 초기물질로서 핵산이 이중가닥인 경우, 두 가닥을 단일 가닥으로, 또는 부분적인 단일-가닥 형태로 만드는 것이 바람직하다. 가닥들을 분리하는 것으로 알려진 방법들은, 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 가닥 분리는 80℃ 내지 105℃의 온도로 열처리하여 달성될 수 있다.
본 발명에서 상기 유전자는 제한되지는 않으나 SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자, S 유전자 또는 N 유전자, 또는살베코바이러스의 E 유전자 일 수 있다.
본 발명에서 상기 검체시료는 제한되지는 않으나 본 발명에서 "검체 시료"는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 보다 바람직하게는, 본 발명에 기재된 바이러스 종(species)과 혼합된 시료이거나 상기 바이러스에 감염된 개체(예컨대, 사람 등)의 시료일 수 있으며, 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 기관의 대표적인 예로는, 기관지, 폐, 비강, 눈, 뇌, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭,위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질 (medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 타액, 가래, 콧물, 비말, 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 분석 방법은 제한되지는 않으나, 역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse transcription Real time PCR) 방법으로 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 b) 단계는 대조물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 내부대조물질은 살베코바이러스(Sarbecovirus) 및 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2)의 존재 유무와 상관없이 임상 검체의 역전사 중합효소 연쇄반응의 성공 여부를 확인할 수 있는 유전자이면 제한없이 이용가능하나, 바람직하게는 homosapiens 종 Rnase P 유전자의 RNA 부위인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 '표적 핵산', '합성 DNA' 또는 '인공합성 올리고'는 검출 여부를 판별하고자 하는 핵산 서열을 의미하며, 생리ㆍ생화학적 기능을 가지는 단백질을 코딩하는 '표적 유전자'의 핵산 서열의 특정 부위를 포함하고, 혼성화, 어닐링 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명의 '혼성화'는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개의 핵산 가닥 간의 상보성이 완전할 경우(perfect match) 일어나거나 또는 일부 부정합(mismatch) 염기가 존재하여 도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 정도는 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있으며, 특히 온도에 의하여 조절될 수 있다.
본 발명의 리포터 및 소광자가 포함된 PNA 프로브는 표적 핵산과 혼성화된 후 형광 신호가 발생하며, 이를 분석을 통하여 표적 핵산의 유무를 검출할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 표적 핵산 준비
살베코바이러스 및 신종코로나바이러스의 감염 진단을 위하여 신종 코로나바이러스의 ORF1ab 유전자, N 유전자, S 유전자 및 살베코바이러스의 E 유전자(표적물질 1-4)를 합성하였고((주)코스모진텍, 한국), 각 표적물질의 염기서열은 아래 표 1에 나타내었고, 벡터맵은 도 1에 개시하였다.
Figure PCTKR2021008444-appb-img-000001
실시예 2: SARS-CoV-2, Sarbecovirus 및 대조물질 증폭을 위한 프라이머 제작
살베코바이러스 및 신종 코로나바이러스의 표적물질에 대한 시간 역전사중합효소 반응을 위해, 하기 표 2와 같이 서열번호 1 ~ 32의 프라이머를 제작하였다.
Figure PCTKR2021008444-appb-img-000002
Figure PCTKR2021008444-appb-img-000003
Figure PCTKR2021008444-appb-img-000004
실시예 3: 형광 PNA 프로브 제작
살베코바이러스 및 신종 코로나바이러스의 특이적 증폭분석을 위하여 서열번호 33 내지 서열번호 48의 PNA 프로브를 제작하였으며, 다중 증폭을 위해 프로브 서열 양 끝에 각각 형광과 소광자를 결합시켰다(표 3).
Figure PCTKR2021008444-appb-img-000005
실시예 4: 표적물질을 이용한 SARS-CoV-2 검출 키트의 검증
실시예 1에서 합성된 살베코바이러스와 신종코로나바이러스의 표적물질 1-4을 실시예 2와 실시예 3에서 합성된 서열번호 1-28 프라이머 및 서열번호 33-48 PNA 프로브와 혼합한 후 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)를 이용하여 실시간 역전사중합효소 반응을 수행하여 형광을 측정하였다.
PCR은 단일가닥 표적핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR(asymetric PCR)을 이용하였으며, PCR 반응액은 2X 반응 버퍼(One-step RT qPCR kit, 엔지노믹스, 한국), 0.05 μM 정방향 프라이머 및 0.5 μM 역방향 프라이머에 0.5 μl 형광 PNA를 첨가하고, 10 μl 표적물질 DNA를 첨가한 다음, 실시간 역전사중합효소 반응을 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였다. 실험 과정의 도식은 도 2에 나타내었으며 역전사중합효소 반응 조건은 도 3에 나타내었다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 표적물질이 있을 경우에만 형광이 검출되는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 대조물질을 포함한 SARS-CoV-2 및 Sarbecovirus 진단 키트의 검증
살베코바이러스 및 신종코로나바이러스의 진단 키트 내 대조물질(IC, Internal Control) 도입을 위하여 Homosapiens의 Rnase P 유전자의 RNA 150bp 부위를 표적핵산으로 사용하여 SARS-CoV-2 및 Sarbecovirus 검출과는 독립적으로 PCR 반응의 정상여부를 확인하였다. 각 산물의 합성된 서열은 아래 표 4과 같으며 벡터맵은 도 5에 개시하였다.
Figure PCTKR2021008444-appb-img-000006
대조물질의 검출을 위하여 서열번호 29~32의 프라이머 및 서열번호 49-51의 프로브를 사용하였고, SARS-CoV-2 및 Sarbecovirus 검출을 위한 서열번호 1-28의 프라이머 및 서열번호 33-48의 프로브를 사용하여 실시간 역전사중합효소 반응을 진행하였고, 반응조건은 다음과 같다; PCR 반응액은 2X 반응 버퍼(One-step RT qPCR kit, 엔지노믹스, 한국), 0.05 μM 정방향 프라이머 및 0.5 μM 역방향 프라이머에 0.5 μl 형광 PNA를 첨가하고, 10 μl 표적물질 DNA를 첨가한 다음, 실시간 역전사중합효소 반응을 실시하는 중간에, 형광검출 분석을 수행하였다. 그 결과 도 6에 개시된 바와 같이 SARS-CoV-2 또는 살베코바이러스가 존재하는 경우 형광이 검출되며, 존재하지 않을 경우 대조물질인 IC에서만 형광이 검출되는 것을 확인하였다.
실시예 6: SARS-CoV-2 의 최소검출한계 확인
살베코바이러스 및 신종코로나바이러스의 진단 키트의 검출한계를 확인하기 위하여 신종코로나바이러스의 ORF1ab 유전자, N 유전자, S 유전자 및 살베코바이러스의 E 유전자, 그리고 내부대조물질 Rnase P를 포함한 표적물질 1-5를 대상으로 프라이머(표 2) 및 PNA 프로브(표 3)를 사용하여 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)에서 PCR을 수행하였다.
각 표적물질은 1X107 copies 농도부터 1X102 copies 농도로 희석하여 사용하였으며, PCR 반응액은 총 볼륨 30㎕가 되게 2X 반응 버퍼(One-step RT qPCR kit, 엔지노믹스, 한국), 0.05 μM 정방향 프라이머 및 0.5 μM 역방향 프라이머에 0.5 μl 형광 PNA를 첨가하고, 10 μl 표적물질 DNA를 첨가한 다음, 실시간 역전사중합효소 반응을 실시하는 중간에 형광검출 분석을 수행하였다. 실험은 각각 3회 반복 확인하였다.
그 결과, 도 7에서 나타난 바와 같이, 본 발명의 검출방법을 사용할 경우, 표적물질의 10 copies까지 검출이 가능한 것을 확인하였다.
실시예 6: 교차반응확인을 통한 SARS-CoV-2 진단 키트의 특이도 확인
살베코바이러스 및 신종코로나바이러스의 진단 키트의 특이도 확인을 위하여 표 4에서 제시된 바와 같이 반응물질인 SARS-CoV-2 표적물질 1- 3과, 살베코바이러스 표적물질 4, 내부대조물질인 RnaseP 표적물질 5와 24개의 비특이물질을 대상으로 실시예 2와 실시예 3에서 제작된 프라이머와 PNA 프로브를 사용하여 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)에서 PCR을 수행하였다.
PCR 반응은 총 볼륨 30㎕가 되게 2X 반응 버퍼(One-step RT qPCR kit, 엔지노믹스, 한국), 0.05 uM 정방향 프라이머(표 2) 및 0.5 μM 역방향 프라이머(표 2)에 0.5 μl 형광 PNA(표 3)를 첨가하고 10 μl 표적물질 DNA를 첨가한 다음, 실시간 역전사중합효소 반응을 실시하는 중간에 형광검출 분석을 수행하였다. 실험 과정의 도식은 도 2에 나타내었으며, 도 3의 조건으로 분석을 진행하였다. 실험은 각각 3회 반복 확인하였다.
그 결과 도 8와 같이 신종 코로나바이러스 및 살베코바이러스는 검출이 확인된 반면, 24개의 비반응물질에서는 표적핵산의 증폭이 일어나지 않는 것을 확인하였다.
Figure PCTKR2021008444-appb-img-000007
실시예 7: 임상샘플을 사용한 PNA 기반 SARS-CoV-2 진단 키트의 검증
신종코로나바이러스의 감염이 의심되는 임상조직에서 RNA를 추출한 후 기존 DNA 프로브를 이용한 real-time PCR 방식으로 확인된 임상샘플 1-3의 RNA를 대상으로 실시예 2 및 실시예 3에서 제작된 프라이머와 PNA 프로브를 사용하여 CFX96™ Real-Time 시스템 (BIO-RAD사, 미국)에서 PCR을 수행하였다.
PCR 반응은 총 볼륨 30㎕가 되게 PCR 반응은 총 볼륨 30㎕가 되게 PCR 반응액은 2X 반응 버퍼(One-step RT qPCR kit, 엔지노믹스, 한국), 0.05 μM 정방향 프라이머(표 2) 및 0.5 μM 역방향 프라이머(표 2)에 0.5 ul 형광 PNA(표 3)를 첨가하고 10 μl 표적물질 DNA를 첨가한 다음, 실시간 역전사중합효소 반응을 실시하는 중간에 형광검출 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 기존 방법으로 SARS-CoV-2 양성 또는 음성으로 확인된 샘플에서, 본 발명의 검출 진단 방법을 사용하여서도 SARS-CoV-2의 ORF1ab 유전자, S 유전자, N 유전자 및 살베코바이러스의 E 유전자 그리고 IC(Human Rnase P)의 형광이 검출되는 것을 확인하였으며, 음성 샘플에서는 IC(Human Rnase P)의 형광만 검출되는 것을 확인하였다.
본 발명에 따르면, 종래 코로나바이러스감염증-19 진단에 사용되는 DNA 프로브를 사용하는 기존 방법에 비해 PNA 프로브를 사용함으로써 SARS-CoV-2의 ORF1ab, N, S 유전자, Sarbecovirus의 E 유전자 및 내부대조유전자인 Human Rnase P의 유전자의 동시 다중 분석이 가능하여 고민감도와 높은 정확성의 SARS-CoV-2 및 살베코바이러스의 감염 여부를 진단할 수 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
전자파일 첨부하였음.

Claims (12)

  1. 서열번호 33 내지 48로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 포함하는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 진단을 위한 PNA 프로브.
  2. 제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 신종코로나바이러스(SARS-CoV-2)의 ORF1ab, S, N 및 살베코바이러스(Sarbecovirus)의 E 유전자로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자와 혼성화 (hybridization) 하는 것을 특징으로 하는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 검출용 PNA 프로브.
  3. 제1항에 있어서, 상기 PNA 프로브는 리포터와 소광자가 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 신종 코로나바이러스(SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 검출용 PNA 프로브.
  4. 제3항에 있어서, 상기 리포터 (reporter)는 FAM (6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX (2',4',5',7',-tetrachloro- 6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy5 및 Alexa 680으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 검출용 PNA 프로브
  5. 제3항에 있어서, 상기 소광자 (quencher)는 TAMRA (6-carboxytetramethyl-rhodamine), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl으로 구성되는 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 특징으로 하는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 검출용 PNA 프로브.
  6. 다음 (i)~(xiv)에서 선택되는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus)의 유전자 증폭용 프라이머 쌍 (primer pair):
    (i) 서열번호 1의 정방향 프라이머 및 서열번호 2의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    (ii) 서열번호 3의 정방향 프라이머 및 서열번호 4의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    (iii) 서열번호 5의 정방향 프라이머 및 서열번호 6의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    (iv) 서열번호 7의 정방향 프라이머 및 서열번호 8의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    (v) 서열번호 9의 정방향 프라이머 및 서열번호 10의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    (vi) 서열번호 11의 정방향 프라이머 및 서열번호 12의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    (vii) 서열번호 13의 정방향 프라이머 및 서열번호 14의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    (viii) 서열번호 15의 정방향 프라이머 및 서열번호 16의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    (ix) 서열번호 17의 정방향 프라이머 및 서열번호 18의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    (x) 서열번호 19의 정방향 프라이머 및 서열번호 20의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    (xi) 서열번호 21의 정방향 프라이머 및 서열번호 22의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    (xii) 서열번호 23의 정방향 프라이머 및 서열번호 24의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍;
    (xiii) 서열번호 25의 정방향 프라이머 및 서열번호 26의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍; 및
    (xiv) 서열번호 27의 정방향 프라이머 및 서열번호 28의 역방향 프라이머로 구성되는 프라이머 쌍.
  7. 제1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 PNA 프로브 및 제 6항의 프라이머 쌍을 포함하는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 검출용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 대조물질; 및 이를 검출하기 위한 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍, 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍 중 선택되는 프라이머 쌍 및 서열번호 49 ~ 51 중 어느 하나의 PNA 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 검출용 조성물.
  9. 제8항의 조성물을 포함하는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 검출용 키트.
  10. 다음 단계를 포함하는 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus)를 검출하는 방법;
    (a) 검체 시료로부터 RNA를 분리하는 단계;
    (b) 제6항의 프라이머 쌍을 이용하여 신종 코로나바이러스의 ORF1ab 유전자, S 유전자, N 유전자 또는 살베코바이러스의 E 유전자를 증폭시켜 증폭산물을 수득하는 단계;
    (c) 상기 증폭산물을 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 PNA 프로브와 혼성화시키는 단계; 및
    (d) 형광검출 측정을 통해 신종 코로나바이러스(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) 및 살베코바이러스 (Sarbecovirus) 감염을 판정하는 단계.
  11. 제10항에 있어서, 상기 (b) 단계는 대조물질 증폭을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 대조물질의 증폭은 서열번호 29 및 30의 프라이머 쌍 또는 서열번호 31 및 32의 프라이머 쌍을 이용하여 수행하고, 서열번호 49 ~ 51 중 어느 하나의 프로브로 검출하는 것을 특징으로 하는 검출방법.
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