ES2320838B1 - Metodo para la identificacion de variedades de pimiento. - Google Patents

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Abstract

Método para la identificación de variedades de pimiento.
El método comprende extraer el ADN de una muestra de pimentón, amplificar enzimáticamente regiones de ADN específicas de variedades de pimiento, separar los productos de amplificación obtenidos en cada reacción de amplificación, e identificar la variedad de pimiento comparando los tamaños de los productos de amplificación obtenidos con patrones de variedades de pimiento. El procedimiento permite identificar la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón, distinguir las diferentes variedades de pimiento eventualmente presentes en una muestra de pimentón y detectar las posibles adulteraciones de dicho pimentón con una variedad de pimiento distinta de la que caracteriza a la denominación origen.

Description

Método para la identificación de variedades de pimiento.
Campo de la invención
La presente invención se relaciona con patrones de amplificación específicos de variedades de pimiento y su empleo en un método para identificar la variedad de pimiento empleada en la fabricación de pimentón así como en la identificación de la variedad de pimentón empleada en la elaboración de productos alimentarios.
Antecedentes de la invención
Muchos derivados de productos agrícolas empleados en la industria alimentaria tienen un valor comercial reconocido basado en la especie vegetal de la que se obtiene, de forma que tal especie suele figurar en la etiqueta y estar explícitamente reconocida en las transacciones comerciales. Frecuentemente, de forma fraudulenta, productos genuinos se sustituyen total o parcialmente con otros procedentes de especies diferentes de plantas con menor coste y calidad.
El pimentón es el polvo del pimiento rojo una vez que éste se ha desecado y molido. En España, las zonas pimentoneras más importantes son Murcia y la comarca de la Vera (Cáceres), donde se produce un pimentón cuyas señas de identidad son la utilización de variedades autóctonas, cultivo artesanal y deshidratación lenta en secaderos alimentados con leña de encina. Sin embargo, la venta de mezclas de pimentón procedente del extranjero con diversas proporciones de pimentón procedente de la comarca de la Vera, sigue proporcionado elevadísimos márgenes de rentabilidad a aquellos industriales que basan su producción en la mezcla de estos, lo que evidentemente constituye un fraude al consumidor.
Los marcadores moleculares (fragmentos de ADN) presentan un gran potencial para la identificación intraespecífica. La técnica AFLP (Polimorfismo en la Longitud de Fragmentos Amplificados) ha proporcionado una nueva clase de marcadores altamente polimórficos. Su ventaja sobre otros marcadores es su alta reproducibilidad lo que unido a su carácter polimórfico les confiere una enorme capacidad para discernir entre especies e incluso entre variedades. Mediante la comparación de secuencias génicas específicas entre distintas variedades de una especie se pueden detectar un gran número de diferencias en la secuencia nucleotídica que permiten identificar y distinguir unas variedades de otras. Estas diferencias pueden ser de tipo SNP (Single Nucleotide Sequence) que pueden utilizarse como marcadores moleculares de la misma forma que los microsatélites o "short-sequence repeat tandem"
(SSRT).
La identificación de la variedad de pimiento empleada en la elaboración del pimentón es muy importante para poder garantizar el auténtico origen ("denominación de origen") de dicho pimentón y descartar aquellos pimentones que hayan sido adulterados utilizando variedades de pimiento no pertenecientes a la variedad de pimiento usada en la denominación de origen en cuestión. Actualmente, no se realiza ningún tipo de procedimiento analítico para detectar mezclas, debido a que no se han identificado metabolitos característicos de especies. Tan solo se conoce que la variedad de pimiento Papriqueen tiene niveles de azúcares reductores más elevados que las demás variedades, pero esto no es suficiente para diferenciarla. Por tanto, existe la necesidad de desarrollar un procedimiento que permita distinguir entre las diferentes variedades de pimiento eventualmente presentes en una muestra de pimentón con el fin de detectar las posibles adulteraciones de dicho pimentón con una variedad de pimiento distinta de la que caracteriza a la denominación origen.
Compendio de la invención
Ahora se ha encontrado, sorprendentemente, que mediante el empleo de unos oligonucleótidos iniciadores que amplifican unas regiones específicas del genoma de una variedad de pimiento dado, se puede elaborar un patrón de amplificación específico de dicha variedad de pimiento, que permite su identificación entre otras variedades de pimiento presentes en una muestra de pimentón.
Por tanto, en un aspecto, la invención se relaciona con un método para obtener un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento. Los patrones de amplificación específicos de dichas variedades de pimiento obtenibles mediante la puesta en práctica de dicho método constituyen un aspecto adicional de la presente invención.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para identificar la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón, o de un producto alimentario.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para cuantificar la cantidad de pimentón procedente de una determinada variedad de pimiento en una muestra de pimentón o de un producto alimentario.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un kit que comprende, al menos, dos parejas de cebadores específicos proporcionados por esta invención. El uso de dicho kit en la elaboración de un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento, o en la identificación de la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón o un producto alimentario, o en la cuantificación de la cantidad de pimentón procedente de una variedad de pimiento determinada en una muestra de pimentón o de un producto alimentario, constituyen aspectos adicionales de esta invención.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 es un electroferograma que muestra los picos obtenidos al amplificar las variedades Jaranda o Autóctono (variedades nacionales), Papriace, Paprequeen, Papriking y Cayena con la pareja de cebadores PNBT1 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2). Las flechas muestras los picos diagnóstico.
La Figura 2 es un electroferograma que muestra los picos obtenidos al amplificar las variedades Jaranda o Autóctono (variedades nacionales), Papriace, Sonora, Paprequeen, Papriking y Cayena con la pareja de cebadores PNBT2 (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4). Las flechas muestran los picos diagnóstico.
La Figura 3 es un electroferograma que muestra los picos obtenidos al amplificar las variedades nacionales Jaranda o Autóctono y las variedades extranjeras Bola, Papriace, Sonora, Papriqueen y Papriking, con la pareja de cebadores PNBT3 (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6). Las flechas muestran los picos diagnóstico.
Descripción detallada de la invención
En un aspecto, la presente invención se relaciona con un método para obtener un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento, de aquí en adelante, método de obtención de patrones de la invención, que comprende:
a)
extraer el ADN de una muestra de dicha variedad de pimiento,
b)
someter el ADN extraído en la etapa a) a, al menos, una reacción de amplificación, en donde cada reacción de amplificación comprende el empleo de una pareja de cebadores diferente, en donde dicha pareja de cebadores amplifica una región de ADN específica de dicha variedad de pimiento, y
c)
separar e identificar el tamaño de los fragmentos amplificados en cada reacción de amplificación y elaborar el "patrón" específico de dicha variedad de pimiento, relacionando el producto amplificado con la pareja de cebadores utilizada.
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Tal como se utiliza en esta descripción, el término "variedad" se refiere a un conjunto de plantas dentro de un taxón botánico único del rango más bajo conocido, que pueden ser (a) definidas por la expresión de las características que resultan de un genotipo dado o combinación de genotipo, (b) distinguidas de cualquier otro grupo de plantas por expresión de, al menos, una de dichas características, y (c) consideradas como una unidad con respecto a su disponibilidad para ser propagadas de forma inalterada. Ejemplos ilustrativos, no limitativos de variedades de pimientos incluyen la variedad Jaranda y Autóctono (variedades nacionales), Papriace, Sonora, Papriqueen, Papriking, Cayena, Dulce/Bola (variedades extranjeras) etc.
El término "patrón de amplificación", tal como aquí se utiliza, se refiere a un conjunto de bandas o picos obtenidos tras separar mediante electroforesis los productos de una reacción de amplificación utilizando unos cebadores determinados. En la presente invención, puesto que la reacción/es de amplificación se lleva/n a cabo con unas parejas de cebadores que amplifican unas regiones específicas del genoma de unas variedades determinadas de pimiento, el patrón de amplificación obtenido será específico de una variedad de pimiento concreta y permitirá identificar a dicha variedad de pimiento.
Asimismo, en el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "región de ADN específica de una variedad de pimiento" se refiere a una región del ADN del genoma del pimiento que es característica de una variedad de pimiento concreta y que, por tanto, su amplificación permite identificar de forma inequívoca la variedad de pimiento en
cuestión.
En una realización particular del método de obtención de patrones de la invención, la región de ADN específica de la variedad de pimiento está caracterizada por contener marcadores microsatélite específicos de dicha variedad de pimiento. Como es conocido por los expertos en la materia, los marcadores microsatélites son segmentos cortos de ADN de 1 a 6 pares de bases (pb), que se repiten en tandem y de forma aleatoria en el genoma de los seres vivos. Las ventajas de estos marcadores versus otros (minisatélites, RFLP, RAPD, etc.) radican en que son muy polimórficos, presentan herencia mendeliana simple, son codominates (pudiéndose diferenciar los individuos homocigotos de los heterocigotos), son fáciles de medir y analizar, y son cien por cien fiables, repetitivos y automatizables. Estas características permiten que se puedan identificar entre las diferentes variedades de pimiento.
El método de obtención de patrones de la invención comprende extraer el ADN de una muestra de la variedad de pimiento en cuestión [etapa a)]. La extracción del ADN puede realizarse por cualquier técnica convencional conocida por los expertos en la materia utilizando, si se desea, kits y reactivos comerciales. En la parte descriptiva de los materiales y métodos, previa a los Ejemplo, se describe un protocolo de extracción de ADN.
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El ADN extraído de la muestra es sometido a, al menos, una reacción de amplificación [etapa b)], en donde cada reacción de amplificación comprende el empleo de una pareja de cebadores diferente, en donde dicha pareja de cebadores amplifica una región de ADN específica de dicha variedad de pimiento, ya que el método de obtención de patrones de la invención permite obtener un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento mediante, al menos, una reacción de amplificación. En ocasiones, una única reacción de amplificación puede ser suficiente para obtener un patrón específico de una variedad de pimiento, como por ejemplo, para obtener el patrón de amplificación específico de las variedades de pimiento Bola, Sonora o Papriace (Figuras 2 y 3); sin embargo, en otras ocasiones, es necesario llevar a cabo dos o más reacciones de amplificación diferentes empleando cebadores distintos para obtener un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento, como es el caso del patrón de amplificación de las variedades Papriking y Papriqueen (ver Figuras 1, 2 y 3), en donde se realizan tres reacciones de amplificación distintas con diferentes pares de cebadores.
Por tanto, en una realización particular del método de obtención de patrones de la invención, la etapa b) comprende la realización de una única reacción de amplificación utilizando una pareja de cebadores determinada. En otra realización particular, el método de obtención de patrones de la invención, comprende la realización de dos reacciones de amplificación distintas empleando dos parejas de cebadores diferentes. Asimismo, en otra realización particular, el método de obtención de patrones de la invención comprende la realización de tres reacciones de amplificación distintas empleando tres parejas de cebadores diferentes.
Como entienden los expertos en la materia, una reacción de amplificación consiste, básicamente, en la multiplicación exponencial de una molécula de ADN diana (o de una región diana de una molécula de ADN) mediante el empleo de oligonucleótidos que hibridan con las regiones que flanquean la molécula diana que se quiere amplificar. Las diferentes técnicas o procedimientos de llevar a cabo reacciones de amplificación están ampliamente descritos en el estado de la técnica, por ejemplo, en Sambrook et al., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3^{rd} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3. Ejemplos de reacciones de amplificación son, sin limitarse a, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y variaciones de la misma, tales como la amplificación regional de la reacción en cadena de la polimerasa (RA-PCR, del inglés Regional Amplification PCR) y la reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real (RT-PCR del inglés Real Time PCR).
Así, en una realización particular del método de obtención de patrones de la invención, la reacción de amplificación es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El protocolo seguido para llevar a cabo una PCR es ampliamente conocido en el estado de la técnica y actualmente, existen kits comerciales que contienen los materiales necesarios para llevar a cabo dicha amplificación. Asimismo, las condiciones de temperatura, tiempo, concentraciones de reactivos y número de ciclos de la PCR dependerán de la ADN polimerasa utilizada en la reacción de amplificación, de la especificidad de los cebadores, etc. Si se emplea un kit comercial, las condiciones de la reacción serán las especificadas por el fabricante del kit. En el Ejemplo 1 que acompaña a la presente descripción, apartado material y métodos, se muestran los reactivos y las condiciones empleadas en la puesta en práctica del método de obtención de patrones de amplificación de la invención. Las parejas de oligonucleótidos empleados como cebadores en las reacciones de amplificación se muestran en las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (pareja de cebadores identificada como PNBTI), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (pareja de cebadores identificada como PNBT2) y SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (pareja de cebadores identificada como PNBT3).
Por tanto, en una realización particular del método de obtención de patrones de la invención, las parejas de cebadores diferentes se seleccionan entre las siguientes parejas de oligonucleótidos:
PNBTIFW-FAM (SEQ ID NO: 1) y PNBTIRV (SEQ ID NO: 2);
PNBT2FW-FAM (SEQ ID NO: 3) y PNBT2RV (SEQ ID NO: 4); y
PNBT3FW-FAM (SEQ ID NO: 5) y PNBT3RV (SEQ ID NO: 6).
Una vez llevada a cabo la reacción de amplificación es necesario separar los productos de amplificación o amplicones. Nuevamente, las técnicas para separar e identificar los productos de amplificación están ampliamente descritos en el estado de la técnica, como por ejemplo, en Sambrook et al., 2001 (citado at supra). Técnicas para separar los productos de amplificación son, por ejemplo, electroforesis sumergida con geles de methafor, electroforesis en geles de poliacrilamida, electroforesis capilar, etc.
Tras la separación de los fragmentos de amplificación, se procede a identificar el tamaño de los fragmentos separados, para lo cuál puede emplearse cualquiera de los procedimientos de identificación de fragmentos de amplificación conocidos del estado de la técnica, tales como hibridación con sondas marcadas (por ejemplo con un fluoróforo), tinción, por ejemplo, con bromuro de etidio, tinción de plata, etc. Tal como entiende el experto en la materia, si todo este proceso es integrado en un sistema informático, se puede generar una gráfica denominada electroferograma (ver Figuras 1, 2 y 3) donde pueden identificarse el tamaño de los fragmentos amplificados. En los Ejemplos que acompañan a la presente descripción (Ejemplos 1 y 2) se ilustra la puesta en práctica de la invención y cómo se obtiene dicho electroferograma.
Así, en otra realización particular del método de obtención de patrones de la invención, la separación e identificación del tamaño de los fragmentos resultado de la reacción de amplificación se lleva a cabo mediante una electroforesis, preferentemente, una electroforesis capilar, seguido de un electroferograma.
Tal como se ha explicado al inicio de la presente descripción, la puesta en práctica del método de obtención de patrones de la invención permite obtener un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento.
Por tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento, de aquí en adelante, patrón de amplificación de la invención, obtenible mediante la puesta en práctica del método de obtención de patrones de la invención.
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Así, en una realización particular, el patrón de amplificación de la invención es específico de la variedad de pimiento Papriking y comprende
(i)
un pico de 269 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT1,
(ii)
un pico de 150 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT2, y
(iii)
un pico de 351 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT3.
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En otra realización particular, el patrón de amplificación de la invención es específico de la variedad de pimiento Papriqueen y comprende
(i)
un pico de 285 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT1,
(ii)
un pico de 150 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT2, y
(iii)
un pico de 351 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT3.
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En otra realización particular, el patrón de amplificación de la invención es específico de la variedad de pimiento Cayena y comprende un pico de 280 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT1.
En otra realización todavía más particular, el patrón de amplificación específico de la variedad de pimiento Cayena comprende, además, dos picos de 144 y 148 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT2.
En otra realización particular, el patrón de amplificación de la invención es específico de la variedad de pimiento Sonora o Papriace y comprende una banda de 150 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT2.
En otra realización particular, el patrón de amplificación de la invención es específico de la variedad Bola y comprende un pico de 333 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT3.
Y por último, en otra realización particular, el patrón de amplificación de la invención es específico de la variedad Jaranda o Autóctono (variedades nacionales) y comprende un pico de 151 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT2.
En la presente descripción se entiende por "pico" a la representación gráfica en un eletroferograma del tamaño del fragmento de ADN amplificado mediante una pareja de cebadores. El experto en la materia entiende que, dependiendo de la técnica empleada en la separación de los productos de amplificación, dichos "picos" puede transformarse en "bandas" si la técnica empleada en la separación de los productos de amplificación es una electroforesis y la posterior visualización de los fragmentos separados mediante una sonda marcada. Puesto que en una realización particular del método de obtención de patrones de la invención la técnica empleada para separar e identificar el tamaño de los fragmentos amplificados es un electroferograma, se ha empleado el término "pico" en la descripción de los patrones de amplificación específicos de una variedad de pimiento concreta. Por tanto, dicho término no pretende limitar o restringir los patrones de amplificación descritos en la presente invención.
Tal como se ilustra en los Ejemplos, mediante la puesta en práctica del método de obtención de patrones de la invención se pueden obtener patrones de amplificación específicos de una variedad de pimiento. La obtención de este patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento puede tener múltiples aplicaciones, como identificar la variedad de pimiento empleada en la elaboración del pimentón o en la elaboración de productos alimentarios, preferentemente, productos alimentarios que contienen pimentón, tales como embutidos, encurtidos, comidas precocinadas, etc. El pimentón, puede presentarse comercialmente en forma de polvo, es decir, molido, o formando parte de productos alimentarios.
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Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se relaciona con un método para identificar la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón, o un producto alimentario, de aquí en adelante, método para identificar la variedad de pimiento de la invención, que comprende las etapas de
a)
extraer el ADN de una muestra de dicho pimentón o dicho producto alimentario,
b)
someter el ADN extraído en la etapa a) a, al menos, una reacción de amplificación, en donde cada reacción de amplificación comprende el empleo de una pareja de cebadores diferente, en donde cada pareja de cebadores amplifica una región de ADN específica de cada variedad de pimiento,
c)
separar e identificar el tamaño de los fragmentos amplificados en cada reacción de amplificación, y
d)
identificar la variedad de pimiento mediante la comparación de los tamaños de los fragmentos amplificados en cada reacción de amplificación con un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento.
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Los términos "variedad", "patrón de amplificación" y "una región de ADN específica de una variedad de pimiento" ya han sido explicados anteriormente.
El método para identificar la variedad de pimiento de la invención comprende extraer el ADN de una muestra de pimentón, o de producto alimentario, en cuestión [etapa a)]. La extracción del ADN puede realizarse por cualquier técnica convencional conocida por los expertos en la materia utilizando, si se desea, kits y reactivos comerciales. En la parte descriptiva de los materiales y métodos, previa a los Ejemplo, se describe un protocolo de extracción de ADN.
El ADN extraído de la muestra es sometido a, al menos, una reacción de amplificación [etapa b)], en donde cada reacción de amplificación comprende el empleo de una pareja de cebadores diferente, en donde dicha pareja de cebadores amplifica una región de ADN específica de dicha variedad de pimiento. En ocasiones, una única reacción de amplificación puede ser suficiente para identificar la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón, o de un producto alimentario; sin embargo, en otras ocasiones, es necesario llevar a cabo dos o más reacciones de amplificación diferentes empleando cebadores distintos.
Por tanto, en una realización particular, el método para identificar la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón o de un producto alimentario comprende la realización de una única reacción de amplificación utilizando una pareja de cebadores determinada. En otra realización particular, dicho método para identificar la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón o de un producto alimentario comprende la realización de dos reacciones de amplificación distintas empleando dos parejas de cebadores diferentes. Asimismo, en otra realización particular, el método para identificar la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón o de un producto alimentario comprende la realización de tres reacciones de amplificación distintas empleando tres parejas de cebadores diferentes.
En una realización particular, el método para identificar la variedad de pimiento utilizado en la elaboración de pimentón o de un producto alimentario, proporcionado por esta invención, comprende el empleo de unas parejas de cebadores seleccionadas entre las siguientes parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; y SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
Como se ha mencionado previamente, una reacción de amplificación consiste, básicamente, en la multiplicación exponencial de una molécula de ADN diana (o de una región diana de una molécula de ADN) mediante el empleo de oligonucleótidos que hibridan con las regiones que flanquean la molécula diana que se quiere amplificar. Las diferentes técnicas o procedimientos de llevar a cabo reacciones de amplificación están ampliamente descritos en el estado de la técnica, por ejemplo, en Sambrook et al., 2001. "Molecular cloning: a Laboratory Manual", 3^{rd} ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., Vol. 1-3. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de reacciones de amplificación incluyen la PCR y variaciones de la misma, tales como RA-PCR y RT-PCR.
En una realización particular, la reacción de amplificación utilizada en la puesta en práctica del método para identificar la variedad de pimiento utilizado en la elaboración de pimentón o de un producto alimentario, proporcionado por esta invención, comprende el método de obtención de patrones de la invención, es la PCR. El protocolo seguido para llevar a cabo una PCR es ampliamente conocido en el estado de la técnica y actualmente, existen kits comerciales que contienen los materiales necesarios para llevar a cabo dicha amplificación. Asimismo, las condiciones de temperatura, tiempo, concentraciones de reactivos y número de ciclos de la PCR dependerán de la ADN polimerasa utilizada en la reacción de amplificación, de la especificidad de los cebadores, etc. Si se emplea un kit comercial, las condiciones de la reacción serán las especificadas por el fabricante del kit. En el Ejemplo 1 que acompaña a la presente descripción, apartado material y métodos, se muestran los reactivos y las condiciones empleadas en la puesta en práctica del método de obtención de patrones de amplificación de la invención. Las parejas de oligonucleótidos empleados como cebadores en las reacciones de amplificación se muestran en las secuencias SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 (pareja de cebadores identificada como PNBT1), SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 (pareja de cebadores identificada como PNBT2) y SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 (pareja de cebadores identificada como PNBT3).
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En otra realización particular del método para identificar la variedad de pimiento de la invención, la región de ADN específica de la variedad de pimiento está caracterizada por contener marcadores microsatélite específicos de dicha variedad de pimiento.
En otra realización particular del método para identificar la variedad de pimiento de la invención, la separación e identificación del tamaño de los fragmentos resultado de la reacción de amplificación se lleva a cabo mediante una electroforesis.
Finalmente, en otra realización todavía más particular del método para identificar la variedad de pimiento de la invención, el patrón de amplificación específico de la variedad de pimiento es cualquiera de los patrones de amplificación de la invención descritos anteriormente.
Por otro lado, los patrones de amplificación de la invención pueden emplearse para cuantificar la cantidad de pimentón presente en una muestra procedente de una variedad de pimiento concreta, de aquí en adelante, llamada genéricamente variedad "A".
Por tanto, en otro aspecto la invención se relaciona con un método para cuantificar la cantidad de pimentón procedente de una variedad "A" de pimiento en una muestra de pimentón, de aquí en adelante, método para cuantificar la cantidad de pimentón de la invención, que comprende:
a)
identificar la presencia de dicha variedad "A" de pimiento mediante el método para identificar la variedad de pimiento de la invención,
b)
a partir de las cantidades relativas de los fragmentos separados, generar un electroferograma que contiene los picos representativos de dicha variedad "A" de pimiento para una pareja de cebadores determinada,
c)
calcular la razón existente entre (i) la altura de un pico representativo de dicha variedad "A" de pimiento y (ii) la altura de un pico representativo de una variedad de pimiento de referencia recogidas en el electroferograma obtenido al amplificar dichas variedades de pimiento con la misma pareja de cebadores, y
d)
extrapolar dicha razón a una recta de calibrado realizada con una mezcla de pimentón procedente de la variedad "A" de pimiento y la variedad de referencia en distintas cantidades.
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La denominada variedad "A" de pimiento puede ser cualquier variedad de pimiento conocido por el experto en la materia. En una realización particular, la variedad de pimiento "A" identificada pertenece a la variedad Papriace, Sonora, Papriqueen, Papriking, Cayena o Bola y, en otra realización particular, la variedad nacional de referencia es Jaranda o Autóctono.
En una realización particular del método para cuantificar la cantidad de pimentón de la invención, la pareja de cebadores se selecciona entre las parejas identificadas como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; y SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
Un ejemplo ilustrativo de cómo poner en práctica el método para cuantificar la cantidad de pimentón de la invención, se muestra en el Ejemplo 2 que acompaña a la presente descripción.
Las parejas de oligonucleótidos cebadores descritos en la presente invención, y que permiten la elaboración de un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento, pueden estar formando parte de un kit que, además de dichas parejas de oligonucleótidos, comprende todos los componentes/reactivos necesarios para llevar a cabo cualquiera de los métodos descritos en la presente invención, tales como, soluciones tampón, material fungible, reactivos, etc.
Por tanto, en otro aspecto, la presente invención se relación con un kit, de aquí en adelante, kit de la invención, que comprende, al menos, dos parejas de cebadores seleccionadas entre SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; y SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
Los diferentes usos del kit de la invención constituyen aspectos adicionales.
Así, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del kit de la invención en la elaboración de un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento, en la identificación de la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón o un producto alimentario y/o en la cuantificación de la cantidad de pimentón procedente de una variedad "A" de pimiento en una muestra de pimentón o de un producto alimentario.
Los siguientes ejemplos ilustran la invención y no pretenden ser limitativos de la misma.
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Ejemplos
En los Ejemplos ilustrativos de la invención descritos más adelante se utilizaron los materiales y métodos que se indican a continuación.
Material y métodos Equipo y Material
Tubos eppendorf de 1,5 ml
Cucharilla-espátula pequeña
Solución de extracción A: La solución de extracción A contiene TrisClH 200 mM (pH 8,0), NaCl 200 mM, EDTA 25 mM (pH 8,0) y 0,5% SDS
Solución de extracción B: La solución de extracción B contiene bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), TrisClH 100 mM (pH 8,0), EDTA 20 mM (pH 8,0), NaCl 1,4 M, 1% de polivinilpirrolidona (PVP) (Mr 40.000)
Proteinasa K 10 mg/ml (Sigma, cat. no.P2308)
FastDNA Kit (OmniLabo 6050073, Bio 101 catalog# 6540-400)
Centrífuga de sobremesa
Taq DNA polymerase (Roche, cat. no.1146165)
BSA 0,5% (Sigma cat. no.A4503)
Termociclador (Gene AMP PCR system 2700, Applied Biosystems)
Secuenciador automático (ABI3130, Applied Biosystems)
\vskip1.000000\baselineskip
Extracción de ADN
La extracción de ADN de las muestras de pimentón molido se lleva a cabo mediante el siguiente protocolo:
1.
Llenar los tubos eppendorf con la cucharilla hasta la línea de 250 \mul con el pimentón molido;
2.
Añadir 400 \mul de solución de extracción A y 5 \mul de proteinasa K (10 mg/ml). Remover el pimentón hasta que todo el polvo se moje;
3.
Incubar durante 1 hora a 37ºC;
4.
Añadir 400 \mul de solución de extracción B, remover de nuevo y voltear varias veces para homogenizar todo lo posible, e incubar 5 minutos a temperatura ambiente;
5.
Centrifugar 10 minutos a máxima velocidad;
6.
Transferir 400 \mul del sobrenadante a un eppendorf nuevo;
7.
Purificar el ADN mediante el uso del Kit FastDNA (Bio 101), para ello:
\quad
Añadir 600 \mul de "binding matriz", mezclar cuidadosamente e incubar durante 5 minutos, centrifugar a la máxima velocidad en una centrífuga de sobremesa durante 1 minuto y eliminar el sobrenadante. Resuspender cuidadosamente el precipitado en 500 \mul de solución de lavado sal/etanol (SEWS-M), centrifugar a la máxima velocidad en una centrífuga de sobremesa durante 1 minuto y eliminar el sobrenadante, centrifugar otros diez segundos y eliminar los restos de sobrenadante. Eluir el ADN de la "binding matriz" resuspendiendo la misma en 100 \mul de agua ultrapura y dejando incubar durante 2-3 minutos. Centrifugar a la máxima velocidad en una centrifuga de sobremesa durante 1 minuto y transferir el sobrenadante a un nuevo tubo.
8.
Usar 5 \mul de la extracción en un volumen final de 50 \mul para cuantificar el ADN extraído mediante expectrofotometría; y
9.
Hacer una dilución de 20 ng/\mul para usarla en la reacción en cadena de la polimerasa.
Reacción en cadena de la polimerasa
Los cebadores empleados en la reacción en cadena de la polimerasa fueron:
1
La reacción en cadena de la polimerasa se llevó a cabo siguiendo el siguiente procedimiento:
1.
Por cada muestra a analizar, más un control negativo (agua), mezclar en un tubo: 2,5 \mul de tampón 10x, 2,5 \mul de dNTPs, 1 pi de taq polimerasa, 1 \mul de BSA, 1 \mul de cebadores a 10 \muM, 16 \mul de agua mQ;
2.
Añadir a cada tubo 1 \mul de la dilución de 20 ng/\mul de ADN;
3.
Dar un pulso a los tubos y poner en el termociclador, ciclo: UPP50 para los cebadores PNBT1 y PNBT2 y UPP55 para los cebadores PNBT3.
\quad
UPP50:
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\quad
UPP55:
3
4.
Inyectar en el secuenciador 1 \mul de cada producto de la PCR:
\quad
8,5 \mul de formamida
\quad
0,5 \mul de Rox 500 (Applied Biosystems)
\quad
1 \mul del producto de la PCR
5.
Poner 10 \mul de formamida en los pocillos que queden libres hasta completar la carrera.
Los productos de la amplificación se separan por electroforesis capilar mediante el uso de un secuenciador ABI3130 utilizando el modulo estándar para la separación de fragmentos inferiores a 500 pb (Frag36cmPOP7_F). Los resultados se analizaron utilizando el programa de análisis de datos GeneMapper Versión 4.0.
Para la obtención de las rectas de calibrado se represento la razón entre la altura del pico diagnóstico y la altura del pico control frente a la concentración de pimentón de la variedad extranjera para, mediante el análisis de regresión de dichos datos, obtener la recta de calibrado correspondiente (un ejemplo práctico de la obtención de una recta de calibrado se muestra en el Ejemplo 2).
Ejemplo 1 Identificación de los patrones de amplificación específicos de las variedades de pimiento
Con el objetivo de identificar el patrón de amplificación de una variedad de pimiento determinada, a partir del cual se puede detectar la variedad de pimiento empleada en la elaboración del pimentón, se procedió a extraer el ADN de una muestra de pimentón pura, es decir, una muestra de pimentón que ha sido elaborado con una única variedad de pimiento. El procedimiento empleado en la extracción del ADN es el mencionado en el apartado de Materiales y Métodos. Las muestras de pimentón puras procedían de las variedades Jaranda, Autóctono (variedades nacionales), Papriace, Sonora, Papriqueen, Papriking, Cayena y Bola/Dulce (variedades extranjeras).
Tras la extracción del ADN, éste se sometió a tres reacciones de amplificación (PCR) según se especifica en el apartado de Materiales y Métodos, empleando en cada PCR una de las parejas de cebadores PNBT1, PNBT2 y PNBT3 previamente mencionadas (SEQ ID NO: 1-6).
A continuación, los productos de amplificación de las tres reacciones de amplificación se sometieron a un proceso de separación mediante electroforesis y posteriormente se obtuvo un electroferograma (Figuras 1, 2 y 3) que muestra los "picos" diagnóstico (señalados mediante una flecha en dichas Figuras) para cada muestra de pimentón procedente de una única variedad de pimiento en función de la pareja de cebadores empleada (PNBT1, PNBT2 y PNBT3).
Las Figuras 1, 2 y 3 muestran los patrones de amplificación de cada variedad de pimentón pura analizada obtenidos con las parejas de cebadores PNBT1, PNBT2 y PNBT3 respectivamente.
Resultados 1.1 Identificación de pimentón procedente de la variedad de pimiento Papriqueen
La presencia de pimentón de la variedad Papriqueen es detectada por la aparición de un pico de 285 pb en el patrón de amplificación obtenido con la pareja de cebadores PNBT1, otros picos adicionales de 269 pb y 276 pb pueden ser también informativos.
1.2 Identificación de pimentón procedente de la variedad de pimiento Papriking
La presencia de pimentón de la variedad Papriking es detectada por la aparición de un pico de 351 pb en el patrón de amplificación obtenido con la pareja de cebadores PNBT3. Así mismo la aparición de un pico de 269 pb unido a la no aparición de un pico de 285 pb en el patrón de amplificación obtenido con la pareja de cebadores PNBT1 es indicativa de la presencia de pimentón procedente de la variedad Papriking.
1.3 Identificación de pimentón procedente de la variedad de pimiento Cayena
La presencia de pimentón de la variedad Cayena es detectada por la aparición de un pico de 280 pb en el patrón de amplificación obtenido con la pareja de cebadores PNBT1. Otros picos adicionales de 144 pb y 148 pb en el patrón de amplificación obtenido con la pareja de cebadores PNBT2 pueden ser también informativos.
1.4 Identificación de pimentón procedente de la variedad de pimiento Bola (Dulce)
La presencia de pimentón de la variedad Bola es detectada por la aparición de un pico de 333 pb en el patrón de amplificación obtenido con la pareja de cebadores PNBT3.
1.5 Identificación de pimentón procedente de las variedades de pimiento Papriace y Sonora
La presencia de pimentón de las variedades Papriace y Sonora es detectada por la aparición de un pico de 150 pb en el patrón de amplificación obtenido con la pareja de cebadores PNBT2 en ausencia de otros picos que identifiquen al resto de pimentones de la variedad genérica "Extranjero".
1.6 Identificación de pimentón procedente de las variedades nacionales Jaranda y Autóctono
La presencia de pimentón de las variedades Jaranda y Autóctono es detectada por la aparición de un pico de 151 pb en el patrón de amplificación obtenido con la pareja de cebadores PNBT2.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2 Cuantificación del pimentón procedente de una variedad de pimiento concreta en una muestra de pimentón
Este Ejemplo ilustra la cuantificación del pimentón procedente de una variedad de pimiento determinada presente en una muestra de pimentón "mezcla", es decir, pimentón elaborado a partir de distintas variedades de pimiento en proporciones conocidas con el fin de poder establecer una curva de calibrado.
Brevemente, se extrajo el ADN de dicha muestra de pimentón mezcla mediante el procedimiento indicado en el apartado Materiales y Métodos y se obtuvieron unas alícuotas. Cada alícuota fue sometida a tres PCR utilizando, en cada una de ellas, una pareja de cebadores distinta (PNBT1, PNBT2 o PNBT3).
Mediante dichas reacciones PCR, se obtienen los patrones de amplificación específicos de las distintas muestras de pimentón mezcla analizadas, con el fin de generar una curva de calibrado que permita identificar y cuantificar la variedad de pimiento presente en una muestra de pimentón problema (es decir, de composición desconocida).
Así, a partir de los patrones patrón de amplificación identificados, específicos de variedades de pimiento determinadas, se calcula la razón existente entre (i) la altura de un pico específico o representativo de la variedad de pimiento identificada y (ii) la altura de un pico representativo de una variedad de pimiento de referencia recogidas en el eletroferograma obtenido al amplificar dichas variedades de pimiento con la misma pareja de cebadores que la empleada en la identificación de la variedad de pimiento concreta. Finalmente, se extrapola la razón anteriormente calculada a una curva de calibrado elaborada tal como se ha explicado anteriormente, para obtener un porcentaje de la cantidad pimentón presente en la muestra analizada procedente de una variedad concreta de pimiento frente al resto de pimentón presente en la muestra.
En este ejemplo concreto, se construyó una recta de calibrado para la cuantificación de Papriqueen (Figura 4). Para ello se extrajo el ADN de mezclas de pimentón conteniendo un 10%, un 20%, un 30% y un 40% de pimentón elaborado a partir de pimientos de la variedad Papriqueen en un fondo de pimentón elaborado a partir de pimientos de la variedad Autóctono. Tras amplificar con la pareja de oligonucleótidos NBT1, los productos de amplificación se resolvieron como se indica en el apartado de Materiales y Métodos y se analizaron con el programa Gene Mapper que permite medir la altura de cada uno de los picos obtenidos. Para la cuantificación se obtuvo la razón entre la altura de los picos de 273 y 285 bp, representándose la misma frente a las concentraciones de Papriqueen presentes en las mezclas. Mediante un análisis de regresión de dichos datos se obtuvo una recta de calibrado (Y=0,032X+0,0003), a partir de la cuál se obtiene la ecuación X=(Y-0,003)/0,032 donde Y es la razón entre los picos de 273 bp y 285 bp. Dada una muestra de pimentón cualesquiera en la cual exista presencia de pimentón procedente de la variedad Papriqueen, la razón entre los picos de 273 y 285 será superior a 0, y por tanto podrá estimarse la proporción del mismo en la mezcla substituyendo dicha razón por Y en la ecuación anterior.
Resultados 2.1 Estimación de la proporción de pimentón molido procedente de la variedad Papriqueen en mezclas de pimentón molido
Para ello se calcula la razón entre la altura de los picos de 273 pb (control) y 285 pb (diagnóstico) obtenidos con la pareja de cebadores PNBT1. Dicha razón se extrapola a una recta de calibrado realizada con mezclas de pimentón nacional y Papriqueen en proporción de 5%, 10%, 20% y 30%.
2.2 Estimación de la proporción de pimentón molido procedente de la variedad Papriking en mezclas de pimentón molido
Para ello se calcula la razón entre la altura de los picos de 345 pb (diagnóstico) y 351 pb (control) obtenidos con la pareja de cebadores PNBT3. Dicha razón se extrapola a una recta de calibrado realizada con mezclas de pimentón nacional y Papriking en proporción de 5%, 10%, 20% y 30%.
2.3 Estimación de la proporción de pimentón molido procedente de la variedad Cayena en mezclas de pimentón molido
Para ello se calcula la razón entre la altura de los picos de 273 pb (control) y 280 pb (diagnóstico) obtenidos con la pareja de cebadores PNBT1. Dicha razón se extrapola a una recta de calibrado realizada con mezclas de pimentón nacional y Cayena en proporción de 5%, 10%, 20% y 30%.
<110> Newbiotechnic, S.A.
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Asociación para el Desarrollo Integral de la Comarca de la Vera
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Método para la identificación de variedades de pimiento
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P2435ES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo PNBT1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
8 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso PNBT1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
9 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo PNBT2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
10 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso PNBT2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
11 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo PNBT3
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<400> 5
12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
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<211> 22
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<212> ADN
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<213> Artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso PNBT3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
13

Claims (31)

1. Un método para obtener un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento que comprende:
a)
extraer el ADN de una muestra de dicha variedad de pimiento,
b)
someter el ADN extraído en la etapa a) a, al menos, una reacción de amplificación, en donde cada reacción de amplificación comprende el empleo de una pareja de cebadores diferente, en donde dicha pareja de cebadores amplifica una región de ADN específica de dicha variedad de pimiento, y
c)
separar e identificar el tamaño de los fragmentos amplificados en cada reacción de amplificación y elaborar el "patrón" específico de dicha variedad de pimiento, relacionando el producto amplificado con la pareja de cebadores utilizada.
2. Método según la reivindicación 1, en la que la etapa b) comprende la realización de dos reacciones de amplificación distintas empleando dos parejas de cebadores diferentes.
3. Método según la reivindicación 1, en la que la etapa b) comprende la realización de tres reacciones de amplificación distintas empleando tres parejas de cebadores diferentes.
4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las parejas de cebadores diferentes se seleccionan entre las siguientes parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; y SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicha reacción de amplificación comprende una reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la región de ADN específica de la variedad de pimiento contiene marcadores microsatélite específicos de dicha variedad de pimiento.
7. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la separación e identificación del tamaño de los fragmentos resultado de la reacción de amplificación se lleva a cabo mediante una electroforesis seguido de un electroferograma.
8. Un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento obtenible mediante la puesta en práctica de un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
9. Patrón de amplificación según la reivindicación 8, caracterizado porque es específico de la variedad de pimiento Papriking y comprende
(i)
un pico de 269 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT1,
(ii)
un pico de 150 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT2, y
(iii)
un pico de 351 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT3.
10. Patrón de amplificación según la reivindicación 8, caracterizado porque es específico de la variedad de pimiento Papriqueen y comprende
(i)
un pico de 285 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT1,
(ii)
un pico de 150 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT2, y
(iii)
un pico de 351 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT3.
11. Patrón de amplificación según la reivindicación 8, caracterizado porque es específico de la variedad de pimiento Cayena y comprende un pico de 280 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT1.
12. Patrón de amplificación según la reivindicación 11, que comprende, además, dos picos de 144 y 148 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT2.
13. Patrón de amplificación según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho patrón de amplificación es específico de la variedad de pimiento Sonora o Papriace y comprende una banda de 150 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT2.
14. Patrón de amplificación según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho patrón de amplificación es específico de la variedad Bola y comprende un pico de 333 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT3.
15. Patrón de amplificación según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho patrón de amplificación es específico de la variedad Jaranda o Autóctono y comprende un pico de 151 pb cuando la pareja de cebadores empleada es PNBT2.
16. Un método para identificar la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón, o un producto alimentario, que comprende las etapas de
a)
extraer el ADN de una muestra de dicho pimentón o dicho producto alimentario,
b)
someter el ADN extraído en la etapa a) a, al menos, una reacción de amplificación, en donde cada reacción de amplificación comprende el empleo de una pareja de cebadores diferente, en donde cada pareja de cebadores amplifica una región de ADN específica de cada variedad de pimiento,
c)
separar e identificar el tamaño de los fragmentos amplificados en cada reacción de amplificación, y
d)
identificar la variedad de pimiento mediante la comparación de los tamaños de los fragmentos amplificados en cada reacción de amplificación con un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento.
17. Método según la reivindicación 16, en la que la etapa b) comprende la realización de dos reacciones de amplificación distintas empleando dos parejas de cebadores diferentes.
18. Método según la reivindicación 16, en la que la etapa b) comprende la realización de tres reacciones de amplificación distintas empleando tres parejas de cebadores diferentes.
19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que la parejas de cebadores diferentes se selecciona entre las siguientes parejas de oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; y SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que la reacción de amplificación comprende la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que la región de ADN específica de la variedad de pimiento está caracterizada por contener marcadores microsatélite específicos de dicha variedad de pimiento.
22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en el que la separación e identificación del tamaño de los fragmentos resultado de la reacción de amplificación se lleva a cabo mediante una electroforesis.
23. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, en el que el patrón de amplificación específico de la variedad de pimiento es un patrón según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15.
24. Un método para cuantificar la cantidad de pimentón procedente de una variedad "A" de pimiento en una muestra de pimentón o de un producto alimentario que comprende:
a)
identificar la presencia de dicha variedad "A" de pimiento mediante un método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 23,
b)
a partir de las cantidades relativas de los fragmentos separados, generar un electroferograma que contiene los picos representativos (marcas) de dicha variedad "A" de pimiento para una pareja de cebadores determinada,
c)
calcular la razón existente entre (i) la altura de un pico representativo de dicha variedad "A" de pimiento y (ii) la altura de un pico representativo una variedad de pimiento de referencia recogidas en el electroferograma obtenido al amplificar dichas variedades de pimiento con la misma pareja de cebadores, y
d)
extrapolar dicha razón a una recta de calibrado realizada con una mezcla de pimentón procedente de la variedad "A" de pimiento y la variedad de referencia en distintas cantidades.
25. Método según la reivindicación 24, en el que la variedad de pimiento "A" identificada es Papriace, Sonora, Papriqueen, Papriking, Cayena o Bola.
26. Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 ó 25, en el que la variedad nacional de referencia es Jaranda o Autóctono.
27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 26, en el que la pareja de cebadores se selecciona entre SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; y SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
\newpage
28. Un kit que comprende, al menos, dos parejas de cebadores seleccionadas entre SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4; y SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.
29. Uso de un kit según la reivindicación 28, en la elaboración de un patrón de amplificación específico de una variedad de pimiento.
30. Uso de un kit según la reivindicación 28, en la identificación de la variedad de pimiento empleada en la elaboración de pimentón o un producto alimentario.
31. Uso de un kit según la reivindicación 28, en la cuantificación de la cantidad de pimentón procedente de una variedad "A" de pimiento en una muestra de pimentón o de un producto alimentario.
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