CN104673926A

CN104673926A - 松材线虫pcr检测试剂盒及其检测方法

Info

Publication number: CN104673926A
Application number: CN201510125372.1A
Authority: CN
Inventors: 苗保刚; 彭年才; 李明; 李红东; 倪晓龙; 李政
Original assignee: SUZHOU TIANLONG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: SUZHOU TIANLONG BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2015-03-21
Filing date: 2015-03-21
Publication date: 2015-06-03
Anticipated expiration: 2035-03-21
Also published as: CN104673926B

Abstract

本发明揭示了一种松材线虫PCR检测试剂盒，包括含有引物A和荧光探针A的PCR反应液，引物A分为上游引物A和下游引物A，上游引物A的核苷酸序列为：5’-CCGTTTGGTGATGTTGTTTCA-3’；下游引物A的核苷酸序列为：5’-GCAAGGCTTCACGACGAA-3’；荧光探针A的核苷酸序列为：5’-FAM-CTCAACAAACCGCAGCCAGGACTC-BHQ-3’。本发明还揭示了一种松材线虫PCR检测方法。本发明具有DNA提取效果好，操作简单、耗时短、结果客观可靠、灵敏度高和特异性高等优点。

Description

松材线虫PCR检测试剂盒及其检测方法

技术领域

本发明涉及微生物检测技术领域，尤其是涉及一种松材线虫PCR检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

松材线虫(North American pinewood nematode；Bursaphelenchusxylophilus)，该线虫属蠕形动物门、线虫纲、垫刃目、滑刃总科、伞刃属。线虫成虫虫体长约1毫米，雌虫尾部近圆锥形，末端圆；雄虫尾部似鸟爪，向腹面弯曲。松材线虫病又称松枯萎病，是一种毁灭性虫害。它是通过松墨天牛(Monochamusalternatus)等媒介昆虫传播于松树体内，从而引发松树病害。被松材线虫感染后的松树，针叶黄褐色或红褐色，萎蔫下垂，树脂分泌停止，树干可观察到天牛侵入孔或产卵痕迹，病树整株干枯死亡，最终腐烂。

目前在松材线虫的分子检测方面，主要包含三大类。第一类是普通PCR检测方法，如专利申请号为200310106109.5的“松材线虫检测试剂盒及其检测方法”等，这些检测方法费时长、检测过程复杂，不便于生产上应用，且未应用于实际生产中；第二类是实时荧光PCR检测方法，如专利申请号为200310109374.9的“一种检测松材线虫的方法及其专用引物和探针”等，这些检测方法或多或少地存在检测特异性不强问题，且检测精度还有待提高，因而也没有在生产实践中应用；第三类是恒温扩增检测技术，如专利号为201210303532.3的“一种定性检测松材线虫的试剂盒及其检测方法”，该项检测技术还有待生产上的验证。

综上，上述松材线虫分子检测方法，都难以满足各森林植物检疫检查站的快速检疫需求。从快速检疫的角度而言，上述松材线虫检测技术与方法距离快速检疫还有一定的差距，为满足检疫实践的快速鉴定要求，有必要开发更为简便、快速、高效的检测鉴定技术与方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种松材线虫PCR检测试剂盒及其检测方法，采用聚合酶链式反应(PCR)及Taqman荧光探针技术对松材线虫基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，以实现对松材线虫的存在进行判断，进而实现对松材线虫感染的辅助诊断。

为实现上述目的，本发明提出如下技术方案：一种松材线虫PCR检测试剂盒，包括待测的DNA靶基因和PCR反应液，所述PCR反应液中包括所述引物A和荧光探针A，所述引物A分为上游引物A和下游引物A，

所述DNA靶基因的核苷酸序列为：

CCGTTTGGTGATGTTGTTTCAACGGCGCGGCCGTCAGGGACGTTCGGATGAGAATGTTTGGAGTCCTGGCTGCGGTTTGTTGAGCTTCGTCGTGAAGCCTTGC；

所述上游引物A的核苷酸序列为：5’-CCGTTTGGTGATGTTGTTTCA-3’；

所述下游引物A的核苷酸序列为：5’-GCAAGGCTTCACGACGAA-3’；

所述荧光探针A的核苷酸序列为：5’-FAM-CTCAACAAACCGCAGCCAGGACTC-BHQ-3’。

优选地，还包括：

DNA提取液，按十二烷基硫酸钠1％、乙基苯基聚乙二醇0.5％、曲拉通x-1000.2％浓度配制成所述DNA提取液，充分混匀后按1mL/管分装；

tap酶：浓度5u/ul，包括10×PCR Buffer、25mmol/L MgCl₂；

UNG酶：浓度＞1u/μl；

dNTPs：在室温下，按体积分别为100ul∶100ul∶100ul∶100ul∶550ul加入dATP、dCTP、dGTP、dUTP和超纯水，搅拌混匀；

阳性对照：106copies/mL～107copies/mL含目的片段质粒，0.5mL/管分装；以及

阴性对照：组成为1×TE溶液。

优选地，所述1×TE溶液的配制：称取0.12114g的Tris，0.292g EDTA加入已含60mL蒸馏水的100mL烧杯中，振摇使之充分溶解，移入100mL的容量瓶中，用10mL蒸馏水洗涤烧杯3次并移入容量瓶中，用HCl调pH值为8.0，最后用蒸馏水定容到100ml，翻转容量瓶使之充分混匀。

优选地，还包括一GAPDH内参照基因，所述内参照基因包括引物B和荧光探针B，所述引物B分为上游引物B和下游引物B，

所述上游引物B的核苷酸序列为：5’-TATGACAACAGCCTCAAGAT-3’；

所述下游引物B的核苷酸序列为：5’-AGTCCTTCCACGATACCA-3’；

所述荧光探针B的核苷酸序列为：5’-HEX-CAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGC-BHQ-3’。

优选地，所述荧光探针A的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团；所述荧光探针B的5’端标记HEX荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。

本发明还揭示了一种松材线虫PCR检测方法，包括以下步骤：

S1，取一定量的所述PCR反应液、Taq UNG酶加入一个离心管中振荡混匀，瞬时离心后，分装到复数管PCR反应液管中，盖上管盖备用；

S2，制备待测DNA样本、阴性对照样本和阳性对照样本，并将制备好的所述待测样本、阳性对照样本和阴性对照样本瞬时离心后、干浴、离心，上清液用于PCR扩增；

S3，向准备好的所述PCR反应液管中分别加入所述上清液待测样品、阴性对照样品、阳性对照样品，盖紧管盖后瞬时离心后，将其放置于PCR仪上，编辑样本信息按照相应的循环参数进行扩增反应；

S4，根据相应的质控标准分析检测结果。

优选地，所述待测DNA样本、阴性对照样本和阳性对照样本的制备：

阴性对照样本：取出所述阴性对照，8000r/min离心，吸取100μl至1.5ml灭菌离心管中，加入20μl所述内参照；

阳性对照样本：取出所述阳性对照，8000r/min离心，吸取100μl至1.5ml灭菌离心管中，加入20μl所述内参照；

待测DNA样本：用生理盐水充分洗涤带有创面拭子的棉签，并挤干棉签，将盛有棉签洗涤液的离心管，13000r/min离心5min，弃上清，沉淀中加入所述DNA提取液，备用。

优选地，所述步骤S1：确定需要进行的反应管数n，将n×44.3μl松材线虫PCR反应液，n×0.5μl热启动Taq酶和n×0.2μl UNG酶加入一个离心管中并振荡混匀，瞬时离心后，向每一个PCR反应液管中分装45μl，盖上管盖后转移到加样区，避光放于4℃冰箱备用。

优选地，所述循环参数包括：

第一阶段50℃，扩增2min；

94℃，扩增5min；

第二阶段94℃，扩增15s；

62℃，扩增30s；

72℃，扩增20s；

循环40次。

优选地，所述质控标准为同时满足阳性质控和质控时，实验有效，否则无效，

所述阴性质控为：FAM通道Ct值＝40或“No Ct”或“undet.”，内参照HEX通道Ct值＜40；

所述阳性质控：FAM通道Ct值≤35，且有相应的对数增长曲线，内参照HEX通道Ct值≤40。

本发明的有益效果是：

1、本发明试剂盒具有DNA提取效果好，操作简单、耗时短(1～2小时)，结果客观可靠，仪器自动收集和分析数据，最低检出限为102copies/mL，具有灵敏度高和特异性高等优点。

2、本发明试剂盒使用了大肠杆菌磷酸脱氢酶基因(GAPDH基因)作为内参照基因，它在松材线虫基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。

附图说明

图1是本发明松材线虫PCR检测方法的流程示意图；

图2是本发明松材线虫基因灵敏度检测结果示意图；

图3是本发明松材线虫基因精密度结果示意图；

图4是本发明松材线虫基因特异性结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整的描述。

本发明揭示了一种松材线虫PCR检测试剂盒和检测方法，采用PCR反应及Taqman荧光探针技术对松材线虫基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断松材线虫的存在与否，指导战地医生对松材线虫感染的病人用药，帮助愈后判断。

内参照原理：本发明试剂盒设置了内参照，该内参照为含管家基因：磷酸脱氢酶基因(GAPDH基因)的质粒，GAPDH基因是一种管家基因，在人体细胞中能稳定表达，进行松材线虫核酸提取时，能同步有效得到，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。当内参照结果为阳时，表示PCR反应体系以及操作正常；因此当目的基因结果为阴时，内参照结果为阳就显得十分重要了；但当目的基因结果为阳时，内参照的扩增曲线较目的基因扩增曲线要推迟，或是内参照结果为阴都是正常的；然而目的基因和内参照基因结果都为阴时，该实验视为无效，需再重复。

阳性对照原理：每次试验都需同时做阳性对照。阳性对照结果为阳，表明对靶基因的检测系统是正常的；而当结果为阴时，表明该次实验无效，需重复。

阴性对照原理：为证明有否污染存在，每次试验也需同时做阴性对照。阴性对照结果为阴，表明本次试验无污染；如结果为阳，则表明该次实验无效，需重复。

实施例1

本发明试剂盒的原材料及制备：

1)Tris：分析纯，含量99.7％，红外合格，pH(5％水)10.3～10.9，水份0.3％，熔点167～171℃，吸收系统合格，杂质最高含量合格。

2)MgCl₂：分析纯，含量不少于99％，水溶液反应合格，杂质最高含量合格。

3)EDTA：分析纯，为白色结晶状粉末，溶于水，溶液呈酸性，难溶于醇，含量不少于99.5％，水溶液反应合格，络合力试验合格，杂质最高含量合格。

4)HCl：分析纯。

5)纯化水：纯净水，经纯水机处理，电阻率18.2MΩ。

6)合成的引物和探针：

松材线虫外毒素A基因保守序列，即DNA靶基因序列：

CCGTTTGGTGATGTTGTTTCAACGGCGCGGCCGTCAGGGACGTTCGGATGAGAATGTTTGGAGTCCTGGCTGCGGTTTGTTGAGCTTCGTCGTGAAGCCTTGC。

松材线虫外毒素A基因保守序列的最优引物A和荧光探针A序列：

上游引物A的核苷酸序列为：5’-CCGTTTGGTGATGTTGTTTCA-3’。

下游引物A的核苷酸序列为：5’-GCAAGGCTTCACGACGAA-3’。

荧光探针A的核苷酸序列为：5’-FAM-CTCAACAAACCGCAGCCAGGACTC-BHQ-3’。

其中，用于PCR反应的引物A，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5，于-20℃保存；荧光探针A：在寡核苷酸5’端标记FAM，3’端标记BHQ，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5，在FAM荧光素的激发波长494nm处有吸收峰，于-20℃保存。

GAPDH内参照基因的引物B、探针B序列组合如下：

上游引物B的核苷酸序列为：5’-TATGACAACAGCCTCAAGAT-3’。

下游引物B的核苷酸序列为：5’-AGTCCTTCCACGATACCA-3’。

荧光探针B的核苷酸序列为：5’-HEX-CAGCAATGCCTCCTGCACCACCAACTGC-BHQ-3’。

其中，GAPDH内参照基因的荧光探针B：在寡核苷酸5’端标记HEX，3’端标记BHQ，紫外检测结果A260nm：A280nm≥1.5，在HEX荧光素的激发波长555nm处有吸收峰，于-20℃保存。

引物和探针的稀释：

取出合成的引物和探针，在高速台式冷冻离心机上离心10000r/min，2min。取出待测引物和探针，加入计算好的超纯水稀释引物和探针到100μM，在涡旋混匀器上混合均匀，然后在手掌型离心机离心。

7)dNTPs：包括dATP、dCTP、dGTP、dUTP，HPLC纯，无DNase和RNase污染，于-20℃保存。dNTPs的配制如表1：

名称	dATP	dCTP	dGTP	dUTP	超纯水
						体积	100ul	100ul	100ul	100ul	550ul

表1

从冰柜中取出表1中所需试剂，平衡至室温。按表1中的比例加入所有试剂后用磁力搅拌器混匀，制备得到所需的dNTPs。

8)热启动Taq酶：浓度5u/ul，含10×PCR Buffer、25mmol/L MgCl2，具有DNA聚合酶活性，无3’-5’核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94℃保温1小时后仍保持50％活性，于-20℃保存。

9)UNG酶：浓度＞1u/μl，具有尿嘧啶糖基化酶活性，无核酸外切酶及核酸内切酶活性，1u UNG在50℃、2min能降解至少103copies含dUTP的模板，使其不能产生扩增产物，于-20℃保存。

10)DNA提取液：按SDS(十二烷基硫酸钠)1％、NP-40(乙基苯基聚乙二醇)0.5％、trionx-100(曲拉通x-100)0.2％浓度配制成DNA提取液，充分混匀后按1mL/管分装。

11)1×TE缓冲溶液：称取0.12114g的Tris，0.292g的EDTA加入已含60mL蒸馏水的100mL烧杯中，振摇使之充分溶解，移入100mL的容量瓶中，用10mL蒸馏水洗涤烧杯3次并移入容量瓶中，用HCl调pH值为8.0，最后用蒸馏水定容到100ml，翻转容量瓶使之充分混匀。

12)内参照：组成为10³copies/mL含内参照基因质粒；临用经分光光度计精确定量的含内参照基因的高浓度质粒，用1×TE溶液作10倍梯度稀释至10³copies/mL作为内参照，0.5mL/管分装。

13)阳性对照：组成为10⁶copies/mL～10⁷copies/mL含目的片段质粒；临用经紫外分光光度计精确定量的含目的片段的高浓度质粒，用预先配制好的1×TE溶液作10倍梯度稀释至10⁶copies/mL～10⁷copies/mL作为阳性对照，0.5mL/管分装。阳性对照品为含目的基因的质粒。

14)阴性对照：组成为1×TE溶液，将配制好的1×TE作为阴性对照，1mL/管分装。

松材线虫PCR反应液的配方如下表2：

表2

最后，试剂盒组成部分如表3：

表3

本发明还揭示了一种利用实施例1的试剂盒实现松材线虫PCR检测方法。

实施例2

一、试剂准备：

1、将试剂盒从-20℃拿出，室温平衡20分钟。

2.将热启动Taq酶和UNG酶瞬时离心后，放于-20℃中备用。

3.确定需要进行的反应管数n后，取出松材线虫的PCR反应液，将n×44.3μl松材线虫PCR反应液，n×0.5μl热启动Taq酶和n×0.2μl UNG酶加入一个离心管中并振荡混匀，瞬时离心后，向每一个PCR反应管中分装45μl，盖上管盖后避光放于4℃冰箱备用。

4.将阳性对照、阴性对照、内参照放于4℃冰箱中备用。

二、待测样本处理：

适用标本类型：创面拭子

1、向1.5ml离心管中加入1ml生理盐水，充分洗涤带有创面拭子的棉签，并挤干棉签；

2、将盛有棉签洗涤液的1.5mL离心管，13000r/min离心5min；

3、弃上清，沉淀中加入100μL DNA提取液，备用。

三、样本DNA提取：

1、阴性对照样本制备：取出阴性对照，8000r/min离心数秒，吸取100μl至1.5ml灭菌离心管中，加入20μl内参照。

2、阳性对照样本制备：取出阳性对照，8000r/min离心数秒，吸取100μl至1.5ml灭菌离心管中，加入20μl内参照。

3、将待测样本、阳性对照样本和阴性对照样本瞬时离心后95℃干浴10min，13000r/min离心1min，上清液用于PCR扩增。

四、PCR反应

1、加样

向准备好的PCR反应液管中分别加入5μl上清液待测样品、阴性对照样品、阳性对照样品，盖紧管盖后瞬时低速离心。

2、PCR扩增

将准备好的PCR反应管放置于PCR仪上，编辑样本信息并按下表4的循环参数进行扩增反应。

五、检验结果的分析

1.结果分析条件设定

1.1 ABI7500基线设定：取2到最小ct值前3个循环值作为基线，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，即阴性对照的Ct＝40或者“undet.”为准。

1.2 STRATAGENEMx3000P基线设定：选择“适合基线(Adaptivebaseline)”设定时的荧光信号。阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，即Ct＝40或者“NoCt”为准。

2.质控标准

本试剂盒阴、阳性对照应同时满足以下条件，否则本次实验视为无效：

2.1阴性质控：FAM通道Ct值＝40或“No Ct”或者“undet.”，内参照HEX通道Ct值＜40。

2.2阳性质控：FAM通道Ct值≤35，且有较好的对数增长曲线，内参照HEX通道Ct值≤40。

3、检测结果

3.1松材线虫阴性(低于检测下限)：FAM通道Ct值＝40或者“NoCt”或者“undet.”，内参照HEX通道Ct值＜40。

3.2松材线虫阳性：FAM通道Ct值≤35，且有较好的对数增长曲线；内参照HEX通道Ct值≤40。

3.3反应无效，应重新测定：FAM通道Ct值＝40或者“NoCt”或者“undet.”，内参照HEX通道Ct值＝40或者“NoCt”或者“Undet.”。

另外，通过对本发明试剂盒灵敏度和精密度进行研究，如图2、图3、图4所示，显示其具备以下性能：

图2：松材线虫基因灵敏度参比品检测结果图，所测浓度依次为1.0×10⁵copies、ml、1.0×10⁴copies/ml、1.0×10³copies/ml、1.0×10²copies/ml，最低检出限为1.0×10²copies/ml。

图3：松材线虫基因精密度检测结果图，依次1.0×10⁴copies/ml、1.0×10³copies/ml，各重复10次。内参照结果为阳，PCR反应体系以及操作正常，如图3所示，本实验结果精密度达到100％。

图4：绿脓基因特异性结果，如图所测为1.0×10⁶copies/ml、1.0×10⁵copies/ml的阳性对照，拟松材线虫、松树DNA、天牛、松毛虫，结果如图4所示，除阳性对照外结果全为阴性。

因此，结合图2～图4可以看出，本试剂盒具有如下特点：

1、DNA提取效果好；

2、具有很高的准确性、灵敏度和特异性；

3、无须PCR后处理，完全闭管扩增和检测，采用了dUTP-UNG系统，有助于避免扩增产物的污染；

4、操作简单、耗时短(1～2小时)；

5、结果客观可靠，仪器自动收集和分析数据。

综上，经过我们前期的研究实验及最后的临床验证等证明，该产品明显优于目前临床主要采用的科玛嘉培养基鉴别方法，适于临床样本检测松材线虫使用。

本发明的技术内容及技术特征已揭示如上，然而熟悉本领域的技术人员仍可能基于本发明的教示及揭示而作种种不背离本发明精神的替换及修饰，因此，本发明保护范围应不限于实施例所揭示的内容，而应包括各种不背离本发明的替换及修饰，并为本专利申请权利要求所涵盖。

Claims

1.一种松材线虫PCR检测试剂盒，其特征在于：包括待测的DNA靶基因和PCR反应液，所述PCR反应液中包括引物A和荧光探针A，所述引物A分为上游引物A和下游引物A，

所述DNA靶基因的核苷酸序列为：

所述上游引物A的核苷酸序列为：5’-CCGTTTGGTGATGTTGTTTCA-3’；

所述下游引物A的核苷酸序列为：5’-GCAAGGCTTCACGACGAA-3’；

2.根据权利要求1所述的松材线虫PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括：

tap酶：浓度5u/u l，包括10×PCR Buffer、25mmol/L MgCl₂；

UNG酶：浓度＞1u/μl；

阴性对照：组成为1×TE溶液。

3.根据权利要求1所述的松材线虫PCR检测试剂盒，其特征在于，所述1×TE溶液的配制：称取0.12114g的Tris，0.292g EDTA加入己含60mL蒸馏水的100mL烧杯中，振摇使之充分溶解，移入100mL的容量瓶中，用10mL蒸馏水洗涤烧杯3次并移入容量瓶中，用HCl调pH值为8.0，最后用蒸馏水定容到100ml，翻转容量瓶使之充分混匀。

4.根据权利要求1～3任意一项所述的松材线虫PCR检测试剂盒，其特征在于，还包括一GAPDH内参照基因，所述内参照基因包括引物B和荧光探针B，所述引物B分为上游引物B和下游引物B，

所述上游引物B的核苷酸序列为：5’-TATGACAACAGCCTCAAGAT-3’；

所述下游引物B的核苷酸序列为：5’-AGTCCTTCCACGATACCA-3’；

5.根据权利要求4所述的松材线虫PCR检测试剂盒，其特征在于，所述荧光探针A的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团；所述荧光探针B的5’端标记HEX荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。

6.一种利用权利要求2～5任意一项所述的试剂盒检测松材线虫的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S4，根据相应的质控标准分析检测结果。

7.根据权利要求6所述的松材线虫的检测方法，其特征在于，所述待测DNA样本、阴性对照样本和阳性对照样本的制备：

8.根据权利要求6所述的松材线虫的检测方法，其特征在于，所述步骤S1：确定需要进行的反应管数n，将n×44.3μl松材线虫PCR反应液，n×0.5μl热启动Taq酶和n×0.2μl UNG酶加入一个离心管中并振荡混匀，瞬时离心后，向每一个PCR反应液管中分装45μl，盖上管盖后转移到加样区，避光放于4℃冰箱备用。

9.根据权利要求6所述的松材线虫的检测方法，其特征在于，所述循环参数包括：