CN101560562B - 一种检测土拉菌的基因液相芯片及其检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测土拉菌的基因液相芯片及其制备方法。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。本发明以fopA特异基因为靶序列，建立了土拉菌液相芯片和检测方法，为土拉菌的检测提供一条可行的途径。

Description

一种检测土拉菌的基因液相芯片及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种检测土拉菌(Francisella tularensis，F.t)的基因液相芯片及其制备方法。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。

背景技术

液相芯片检测是近几年发展起来的新兴技术，具有快速、特异、敏感的特点。悬浮芯片的基本原理是利用聚苯乙烯(polystyrene)所制作的微球，包覆不同比例的红光及红外光发色剂，而产生100种不同比例颜色，作为100种独特的色彩编号，每颗微球大小约5.5μm，可依不同研究目的如免疫分析、核酸研究、酶分析、受体和配体识别分析等，并根据不同研究目的而标定特定抗体、核酸探针及各种受体探针。

土拉菌(Francisella tularensis，F.t)为需氧球杆状小杆菌(0.2μm×0.2～0.7μm)，细胞单生，极其多形态，无芽孢，无动力；革兰氏染色阴性，染色时不易着色。本菌在普通培养基上不生长，在适当的固体培养基(如含1％血红蛋白的胱氨酸血琼脂培养基)上培养2～4d可形成光滑、凸起的灰白色菌落。血褪色并可以变成绿色。在石蕊牛奶中弱生长，可产弱酸。最适生长温度37℃，致死温度56℃10分钟。在低温下能很好的存活。

菌培养是诊断土拉弗氏菌病的金标准，根据该菌37℃生长缓慢、28℃几乎不生长的特性可与28℃较快生长的鼠疫杆菌、新凶手弗氏菌区别开来，但因其容易引起实验室感染，无法作为常规操作。而试管凝集法的敏感性和特异性都很高。分子生物学方法主要有PCR、实时荧光PCR等。

发明内容

本发明涉及一种改进的基因液相芯片及其制备方法，该基因液相芯片可以用于病原体土拉菌的检测。本发明还涉及利用所述的基因液相芯片进行检测的方法。

经过深入和大量的研究和实验，本发明以土拉菌fopA基因特异性序列为靶序列，建立了土拉菌液相芯片和检测方法，为该菌的检测提供一条可行的途径。

本发明所述的基因液相芯片包括：微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链亲和素-藻红蛋白，该基因液相芯片可检测土拉菌。

本发明还涉及上述可检测土拉菌的基因液相芯片，该芯片包括：荧光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链亲和素-藻红蛋白，其中

本发明的PCR反应体系包括：10×PCR缓冲液、dNTPs、Taq DNA聚合酶。

本发明的引物包括：

其中，下游引物是5’生物素标记的Ft-R。

具体例如是Ft-R：5’-生物素-GCTGTAGTCGCACCATTATCCT

本发明的捕获探针，所述的捕获探针具有特异性：

探针名称	探针靶位	探针序列(5’-3’)
			Ft	土拉菌fdX基因的989-1012bp	TGCTGGTTTAACATGGTTCTTTGG

上面所述探针在合成时在5’端进行氨基修饰，并且连接15-20个T或连接C12作为间隔链，然后将探针与所选的编码微球进行偶联。

本发明的微球，一般选择荧光编码的微球，例如来源于Luminex或其他代理公司的任何编号的微球，特异性探针与荧光编码微球偶联形成检测微球，由此构成检测芯片。

本发明的链亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-R-phycoerythrin，SA-PE)为一种荧光蛋白，能被液相芯片检测系统中的绿色激光激发发光，由此可以进行定性或定量检测。

本发明涉及上述基因液相芯片的制备方法，该方法包括：

1.选取编码微球，取适量如约1.25×10⁶个于离心管内，离心弃上清后，加入0.1mol/L的2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液使之重悬；

2.用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针(即捕获探针Ft)稀释，加至微球悬浮液中，振荡混匀；

3.加入10mg/mL的EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐)溶液至微球与探针混和液中，振荡混匀，室温孵育例如30分钟；

4.用例如0.02％PBST洗涤，14000g下离心；移弃上清液，将上述微球重悬于例如1ml的0.1％SDS(即十二烷基磺酸钠)中，洗涤，离心；

5.移弃上清液，微球重悬于例如100μl pH8.0TE中，振荡悬起混匀，得到偶联好的检测微球，即本发明的基因液相芯片。4℃避光保存。

另一方面，本发明还涉及上述土拉菌检测基因液相芯片的检测方法，该方法包括：样本核酸的提取，PCR扩增，检测病原体。本发明对上述三个步骤的操作和条件进行了改进和优化。

本发明的样本核酸的提取方法采用

采用NaI裂解-玻璃粉吸附法提取样本的核酸。例如，具体步骤如下：

1)向每管样本中加入6mol/L NaI，振荡混匀，煮沸；

2)离心，转上清液至另一含20％玻璃粉液的离心管中；

3)充分混匀，室温放置10分钟，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上；8000r/分钟离心，小心倾去上清液；

4)向玻璃粉-DNA沉淀中加入75％乙醇1ml，充分混匀，离心，小心倾去上清液；

5)重复步骤(4)，然后置于37℃恒温箱内干燥；

6)向上述干燥的玻璃粉-DNA沉淀中加20μl TE，充分混匀，65℃加热，离心，回收上清液备用。

本发明的PCR扩增方法包括：

以上述核酸提取步骤中制备的上清液作为PCR反应的模板，采用PCR反应体系以及反应条件：

本发明的PCR体系：

10×PCR缓冲液：    3μl

Taq DNA聚合酶：    0.3μl

dNTPs：             0.3μl

上游引物：          0.3μl

下游引物：          0.3μl

模板DNA：           2μl

双蒸水ddH₂O：       补足30μl

反应条件：

预变性：

94-96℃             10分钟

35个循环：

94-96℃             30-40秒

55-58℃             30-40秒

72℃                30-40秒

延伸：

72℃                4-7分钟

同时，PCR空白对照品为如下：

10×PCR缓冲液：     3μl

Taq酶：             0.3μl

dNTPs：             0.3μl

上游引物：          0.3μl

下游引物：          0.3μl

双蒸水ddH₂O：       补足30μl

反应结束后以1％的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况。

本发明的检测方法，优选是：

1)取上述两种偶联微球混合，装于PCR管中，根据微球计数结果计算相应加入量，使每种微球的量相同，每次反应每种3000-5000个；

2)向各管中加5～17μl上面的PCR扩增得到的产物，混匀；

3)95℃变性10分钟；随后45～60℃反应10～30分钟；

4)离心或抽滤去掉未结合的PCR产物；

5)再向各孔加SA-PE，室温避光孵育，抽滤去掉未结合的SA-PE；

6)再向各孔加入75μlTE悬浮液，振荡使微球重悬；

7)反应结束后上LUMINEX检测仪器进行检测。例如使用Bio-plex检测设备，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发微球基质的染料从而对微球编号进行识别，绿色激光对结合体的荧光蛋白进行识别，实现捕获探针捕获的PCR产物的定量分析。

附图说明：

附图为用探针Ft检测土拉菌核酸的剂量-反应曲线，即模板DNA的量与发生反应的荧光信号值MFI之间的对应关系；横轴代表PCR反应体系中模板DNA的浓度(fg/test)，纵轴代表荧光信号值MFI。

具体实施方式

实施例1、基因液相芯片的制备

1.选取编码微球，如027号，取约1.25×10⁶个置于离心管，14000g下离心，例如离心3-5分钟，小心吸出上清液；

2.加入50μl 0.1mol/L的2-(n-吗啉代)乙磺酸溶液，振荡混匀。

3.用蒸馏水将合成的寡核苷酸探针稀释到0.1mmol/L；将1μl稀释的探针Ft加于027号微球悬浮液中，振荡混匀。

4.加入2.5μl新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液至微球与探针混和液中，振荡，室温孵育30分钟。

5.用0.02％PBST 1ml洗涤1次，离心14000g 3-5分钟。

6.移弃上清液，微球重悬于1ml 0.1％SDS中，洗涤，离心。

7.移弃上清液，微球重悬于100μl pH8.0TE中，振荡悬起混匀，即得到偶联好的检测微球。

8.用血球计数器计数微球的数量，换算出每种微球的单位浓度。

9.把偶联好的检测微球放在4℃避光保存，一般每种探针偶联的微球单独保存，使用时，根据检测项目选择要混合的微球种类。

实施例2、样本核酸的提取

采用NaI裂解-玻璃粉吸附法提取样本的核酸。具体如下：

1)向每管样本中加入6mol/L NaI 100μl，振荡混匀，煮沸30分钟。

2)将上述煮沸处理的样本于10000r/分钟离心5分钟，将上清液转至另一含20％玻璃粉液的离心管中。

3)充分混匀，置室温10分钟，8000r/分钟离心2分钟，小心倾去上清液。

4)向玻璃粉DNA沉淀中加入75％乙醇1ml，充分混匀，洗涤玻璃粉，8000r/分钟离心2分钟，小心倾去上清液。

5)重复清洗一次后，放置于37℃恒温箱使彻底干燥。

6)向上述晾干的玻璃粉-DNA沉淀中加20μlTE，充分混匀，65℃加热15分钟。8000r/分钟离心2分钟，回收上清液备用。

实施例3、PCR扩增

以回收的上清液作为PCR反应的模板，PCR反应体系以及反应条件：

PCR体系：

10×PCR缓冲液：     3μl

Taq酶：             0.3μl

dNTPs：             0.3μl

上游引物：          0.3μl

下游引物：          0.3μl

模板DNA：           2μl

双蒸水ddH₂O：       补足30μl

反应条件：

预变性：

94℃                10分钟

35个循环：

94℃                30秒

58℃                30秒

72℃                40秒

延伸：

72℃                7分钟

同时设置PCR空白对照，如下：

10×PCR缓冲液：     3μl

Taq酶：             0.3μl

dNTPs：        0.3μl

上游引物：     0.3μl

下游引物：     0.3μl

双蒸水ddH₂O：  补足30μl

反应结束后以1％的琼脂糖凝胶电泳检查扩增情况。

实施例4、检测

1.取偶联微球027号各5000个混合，分装于PCR管中(根据微球计数结果计算相应加入量)

2.向各管中加5～17μl上面的PCR产物使其终体积为50μl。

3.95℃变性10分钟。

4.45～60℃反应10～30分钟。

5.转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物。

6.再向各孔加75μl 4ng/μl SA-PE，室温避光孵育10分钟，抽滤去掉未结合的SA-PE。

7.再向各孔加入75μl悬浮液，振荡使微球重悬。

8.反应结束后上机检测。

9.Bio-plex检测系统，通过红、绿两束激光检测，红色激光激发微球基质的染料从而对微球编号进行识别，绿色微球对表面结合的荧光染料进行识别，实现捕获探针捕获的PCR产物的定量分析。

在检测时，同时以PCR阴性对照进行检测做为检测本底。对于每个检测体系和检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球群的荧光强度中位值(Median Fluorescence Intensity，MFI)，亦即读取的这种编号的微球群(100个或以上)的每个微球信号强度的统计平均值。结果判断：当待检测样本孔的MFI值为本次检测背景信号强度三倍以上时即判为阳性。

实施例5、定量检测：

提取土拉菌的基因组DNA，利用核酸蛋白分析仪测定其浓度，进行系列稀释，PCR扩增后，同上面检测步骤进行检测，Bio-Plex Version 4.0分析，拟合出剂量-反应曲线和曲线方程。样本检测值代入方程实现定量检测。

结果

针对土拉菌的检测，本发明设计了位于染色体fopA基因的探针进行检测。提取土拉菌基因组DNA测定浓度后进行10倍系列稀释，3fg～3×107fg，按上述确定的方法进行PCR扩增和检测，拟合曲线，得出曲线方程：

探针Ft的曲线方程：FI＝-2.56466+(2725.31+2.56466)/((1+(Conc/260493)^-2.09241))^0.331445

从标准曲线推算检出限，本体系的检出限为0.95pg/test。

从上述结果可以得出，本发明的悬浮芯片和检测方法具有以下优越性：

1.灵敏：较之于普通的多重PCR反应，本发明的灵敏度提高从以下两个方面体现：1)检测仪器存在信号的放大系统；2)PCR产物带上的生物素与荧光染料藻红蛋白连接的亲和素结合的放大作用。

2.特异：采用核酸探针技术对标记上生物素的PCR产物进行特异性的识别，而非传统的电泳方法通过PCR产物片段大小进行识别。

3.准确高效：整合核酸体外扩增、核酸分子杂交、编码微球、生物素标记、荧光检测和流式细胞技术于一体，同时实现核酸样品的检测、鉴定，使结果准确，工作高效。

4、芯片制作方便：只用设计好待检目标菌的引物，优化PCR条件，标记对应的探针于编码微球，即可组装成检测体系。

5、本发明涉及的方法同样适用于其他病原体或目标物的核酸检测。

6、可实现多重检测，待检目标灵活可调：可根据不同检测目标，选择对应的引物和微球，组成不同目标组合的检测体系。

Claims (2)

1.一种检测土拉菌(Francisella tularensis)的基因液相芯片，该芯片包括：荧光编码的微球、捕获探针、引物、PCR反应体系、链亲和素-藻红蛋白；

其中所述引物包括：

Ft-F    GGGCAAATCTAGCAGGTCAAG

Ft-R    GCTGTAGTCGCACCATTATCCT

下游引物5’端经生物素标记：

Ft-R：5’-生物素-GCTGTAGTCGCACCATTATCCT；

其中所述捕获探针选自：

探针名称    探针序列(5’-3’)

Ft    TGCTGGTTTAACATGGTTCTTTGG

上面所述探针在合成时在5’端进行氨基修饰，并且连接15-20个T作为间隔链，然后将探针与所选的编码微球进行偶联。

2.用权利要求1所述的基因液相芯片检测土拉菌的非诊断性检测方法，该方法包括：样本核酸的提取，PCR扩增，检测病原体核酸；其中所述样本核酸的提取包括以下步骤：

1)向每管样本中加入NaI，振荡混匀，煮沸；

2)离心，转上清液至另一含20％玻璃粉液的离心管中；

3)充分混匀，室温放置，使暴露的DNA吸附于玻璃粉上；离心，小心倾去上清液；

4)向玻璃粉-DNA沉淀中加入75％乙醇，充分混匀，离心，小心倾去上清液；

5)重复步骤4)，然后置于37℃恒温箱内干燥；

6)向上述干燥的玻璃粉-DNA沉淀中加20μl TE，充分混匀，65℃加热，离心，回收上清液备用；

其中所述检测步骤包括：

1)取偶联微球，装于PCR管中，根据微球计数结果计算相应加入量；

2)向各管中加5～17μl PCR扩增得到的产物，混匀；

3)95℃变性10分钟；随后45～60℃反应10～30分钟；

4)离心或抽滤去掉未结合的PCR产物；

5)再向各孔加链亲和素-藻红蛋白，室温避光孵育，抽滤去掉未结合的SA-PE；

6)再向各孔加入75μlTE悬浮液，振荡使微球重悬；上检测仪器进行检测。

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