CN107805597B - 基于微流控芯片的基因检测系统及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于微流控芯片的基因检测系统及检测方法，该检测系统包括壳体、微流控芯片、光学装置及转动装置。微流控芯片设置在容纳腔内，微流控芯片上设有加样池、分样元件以及反应元件，反应元件包括多个装载检测剂的反应池。上述检测系统一次上样能够同时检测多种病原微生物，样品处理步骤简单，检测效率高，同时加样量容易控制，进入每个反应池中的待检测样品体积相等，检测结果更加准确，检测过程自动化，满足口岸卫生检疫高效率、大样本量病原微生物快速检测排查的应用要求。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种基于微流控芯片的基因检测系统及检测方法。
背景技术
高致病性病原微生物大多数具有感染力强、传播快、潜伏期短和发病急等特点，所引起的疾病病原学复杂，给人类的健康、社会的稳定以及畜牧业安全等带来极大的威胁。当前，一些高致病性病原微生物已经跨越了种属之间的障碍，不定期在人类中爆发成为越来越常见的现象。由于口岸卫生检疫对象的复杂性、流动性，以及潜在高致病性病原微生物的未知性，多变性等众多因素，快速检测高致病性病原微生物非常有必要。
传统的检测方法主要有直接涂片镜检、分离培养等。然而依靠病原体微生物体外培养的显微检验方法耗时长，操作繁复，效率与通量也不理想。深入到分子水平和基因水平的检测手段不断出现并被广泛应用。其中具有代表性的是基于聚合酶链式反应(PCR，Polymerase chain reaction)和抗原抗体反应基础之上发展的系列检测方法。但传统的免疫检测技术存在的问题是难以对病原微生物感染的窗口期检出，即使感染者体内已感染了病毒，但由于病毒拷贝数少、病毒的抗体丰度低，往往检查病毒抗体的结果呈阴性而造成漏诊。实时荧光定量PCR技术是目前病原微生物核酸分子检测的主流方法，此方法特异性强，但是一次实验只能检测一种病原目标物，检测通量较低，同时检测大量的病原目标物则不能很好地应付。这两种方法在检测多种病原微生物时，往往都需要耗费较长的时间，这也延误了诊断和治疗的最佳时机。综上，传统的检测产品自动化程度不高，检测效率低，检测结果不准确。远远不能满足口岸卫生检疫高效率、大样本量病原微生物快速检测排查的应用要求。
发明内容
基于此，有必要提供一种检测效率高、检测结果准确的基于微流控芯片的基因检测系统及检测方法。
一种基于微流控芯片的基因检测系统，包括：
壳体，内设有容纳腔；
微流控芯片，设置在所述容纳腔内，所述微流控芯片上设有加样池、分样元件以及反应元件，所述加样池用于加入待检测样品，所述分样元件包括弧形通道和多个分样缓冲池，所述弧形通道与所述加样池连通，所述多个分样缓冲池位于所述弧形通道的外侧且沿所述弧形通道的周向依次排布，且所述分样缓冲池沿所述弧形通道的径向自所述弧形通道的外周缘向外延伸，所述多个分样缓冲池的体积相等，且从所述弧形通道的进口端至出口端方向所述分样缓冲池的深度依次减小，所述反应元件包括装载细菌检测剂的反应池、装载立克次体检测剂的反应池、装载病毒检测剂的反应池、装载真菌检测剂的反应池和装载生物毒素检测剂的反应池，所述反应池与所述分样缓冲池通过毛细管连通；
光学装置，包括激发光源、激发光透射镜和光学传感器，所述激发光源用于发射激光，所述激发光透射镜用于将所述激光聚焦照射到待检测的所述反应池上，以激发待检测的所述反应池内的反应物产生光信号，所述光学传感器用于接收所述光信号；及
转动装置，用于带动所述微流控芯片转动，以使各个所述反应池依次经过所述光学装置。
一种非疾病诊断和治疗的检测高致病性病原微生物含量的方法，包括如下步骤：
将待检测样品加入上述任一项所述的检测系统中，其中所述待检测样品置于所述加样池中；
通过所述转动装置带动所述微流控芯片以第一速率进行离心转动，以将所述加样池内的所述待检测样品从所述弧形通道依次进入多个所述分样缓冲池内；
通过所述转动装置带动所述微流控芯片以第二速率进行离心转动，以将所述分样缓冲池内的所述待检测样品通过所述毛细管进入所述反应池内；
通过所述转动装置带动所述微流控芯片以第三速率进行离心转动，使各个所述反应池依次经过所述光学装置，所述激发光源发射的激光通过所述激发光透射镜聚焦照射到待检测的所述反应池上，以激发待检测的所述反应池内的反应物产生光信号，所述光学传感器接收所述光信号；
根据所述光信号计算获得所述待检测样品中各高致病性病原微生物含量。
上述基于微流控芯片的基因检测系统包括壳体、微流控芯片、光学装置及转动装置。微流控芯片上设有加样池、分样元件以及反应元件。使用时，将待检测样品加入到微流控芯片的加样池中，并将微流控芯片安装在转动装置上，转动装置带动微流控芯片进行第一次转动，待检测样品在离心作用下进入弧形通道，从弧形通道的进口端至出口端依次填充多个分样缓冲池。多个分样缓冲池体积相等且从弧形通道的进口端至出口端分样缓冲池的深度依次减小，便于待检测样品顺利填满每个分样缓冲池，保证分样缓冲池内的待检测样品体积相等。然后通过转动装置带动微流控芯片进行第二次转动，分样缓冲池内的待检测样品从毛细管进入反应池中，与装载在反应池内的检测剂发生反应。之后微流控芯片在过转动装置的转动过程中，各个反应池依次经过光学装置，激发光源发射的激光通过激发光透射镜聚焦照射到待检测的反应池上，激发待检测的反应池内的反应物产生光信号，光学传感器接收光信号，从而计算获得待检测样品中各高致病性病原微生物含量等参数。上述检测系统一次上样能够同时检测多种病原微生物，样品处理步骤简单，检测效率高，同时加样量容易控制，进入每个反应池中的待检测样品体积相等，检测结果更加准确，检测过程自动化，满足口岸卫生检疫高效率、大样本量病原微生物快速检测排查的应用要求。
附图说明
图1为一实施方式的检测系统的结构示意图；
图2为图1所示的检测系统另一个方向的示意图；
图3为图1所示检测系统的部分结构的示意图；
图4为图1所示检测系统的部分结构的示意图；
图5为图1所示检测系统的部分结构的示意图；
图6为图1所示检测系统的部分结构的示意图。
图7为用第1组检测剂荧光PCR检测不同的浓度的炭疽芽孢杆菌，获得的PCR扩增曲线以及制得的标准曲线图；
图8为用第2组检测剂荧光PCR检测不同的浓度的布鲁氏杆菌，获得的PCR扩增曲线以及制得的标准曲线图；
图9为用第3组检测剂荧光PCR检测不同的浓度的鼻疽伯克氏菌，获得的PCR扩增曲线以及制得的标准曲线图；
图10为用第4组检测剂荧光PCR检测不同的浓度的土拉弗氏菌制，获得的PCR扩增曲线以及制得的标准曲线图；
图11为用第5组检测剂荧光PCR检测不同的浓度的沙门氏菌，获得的PCR扩增曲线以及制得的标准曲线图；
图12为用第6组检测剂荧光PCR检测不同的浓度的伤寒沙门氏菌，获得的PCR扩增曲线以及制得的标准曲线图；
图13为用第7组检测剂荧光PCR检测不同的浓度的志贺氏菌，获得的PCR扩增曲线以及制得的标准曲线图；
图14为检测例一中检测rpoB基因的核酸样本时各反应池中荧光强度随时间变化制得的qPCR扩增曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
请参阅图1和图2，一实施方式的基于微流控芯片的基因检测系统01，包括壳体10、微流控芯片20、光学装置30以及转动装置40。其中壳体10内设有容纳腔1001，微流控芯片20设置在容纳腔1001内。
微流控芯片20的结构请参阅图3和图4，该微流控芯片20大致呈圆形。微流控芯片20上设有加样池210、分样元件220和反应元件230。其中一组加样池210、分样元件220和检测元件230形成一个微流控单元21。本实施方式的微流控芯片20包括四个绕圆心均匀分布的微流控单元21。当然，在其他实施方式中，微流控芯片20还可以是其他形状，例如矩形、多边形等等。微流控芯片20上的微流控单元21的数量还可以为一个、两个、三个、五个、七个等等。
具体地，加样池210上设有与外界连通的加样孔2001。分样元件220包括弧形通道221和多个分样缓冲池223，弧形通道221与加样池210连通。多个分样缓冲池223位于弧形通道221的外侧且沿弧形通道221的周向依次排布，且分样缓冲池223沿弧形通道221的径向自弧形通道221的外周缘向外延伸。多个分样缓冲池223的体积相等，且从弧形通道221的进口端至出口端方向分样缓冲池223的深度依次减小。反应元件230包括多个装载检测剂的反应池231，反应池231与分样缓冲池223通过毛细管240连通。具体地，每个分样元件220包括16个体积相等的分样缓冲池223，反应池231的数量与分样缓冲池223匹配。整个微流控芯片20上设有64个体积相等的分样缓冲池223和64个反应池231，实现高通量的检测。
具体地，分样缓冲池223为矩形分样缓冲池，矩形分样缓冲池的池底设有倒角。使得经过离心后待检测样品无残留的进入反应池231中，实际参与反应的样品更加准确。具体地，分样缓冲池223的深宽比为1:1～4:1，最靠近弧形通道210的进口端的深宽比越大，最靠近弧形通道210的出口端的深宽比越小。深是指分样缓冲池223的进口端至底部的距离，宽是指分样缓冲池223开口的宽度。在本实施方式中，最靠近弧形通道210的进口端的深宽比为4:1，最靠近弧形通道210的出口端的深宽比为1:1。待检测样品能够顺利填满每个分样缓冲池223，保证分样缓冲池内223的待检测样品体积相等。
具体地，分样元件220还包括废液池225，废液池225设置在弧形通道210的出口端，废液池225沿弧形通道210的径向向外延伸。经过离心后，待检测样品从弧形通道210的进口端至出口端依次填充多个分样缓冲池223，多余的待检测样品流入废液池225中，加样过程方便快捷。
具体地，反应元件230包括多个装载检测剂的反应池231，例如装载细菌检测剂的反应池231、装载立克次体检测剂的反应池231、装载病毒检测剂的反应池231、装载真菌检测剂的反应池231和装载生物毒素检测剂的反应池231。每个反应池231底部到微流控芯片20边缘距离相等，例如为1mm。使得检测时光路传播距离相等，光信号传播变异系数尽可能小。
在一个实施方式中，反应元件230包括分别装载如下检测剂的反应池231，每一组检测剂中均包括上游引物、下游引物和探针。其中，第1组检测剂：用于检测炭疽芽孢杆菌，上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQID No.3所示。上述引物和探针针对rpoB基因设计。第2组检测剂：用于检测布鲁氏杆菌，上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示，探针序列如SEQ IDNo.6所示。上述引物和探针针对IS711基因设计。第3组检测剂：用于检测鼻疽伯克氏菌，上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示，探针序列如SEQ IDNo.9所示。上述引物和探针针对fliP基因设计。第4组检测剂：用于检测土拉弗氏菌，上游引物序列如SEQ ID No.10所示，下游引物序列如SEQ ID No.11所示，探针序列如SEQ IDNo.12所示。上述引物和探针针对tul4基因设计。第5组检测剂：用于检测沙门氏菌，上游引物序列如SEQ ID No.13所示，下游引物序列如SEQ ID No.14所示，探针序列如SEQ IDNo.15所示。上述引物和探针针对invA基因设计。第6组检测剂：用于检测伤寒沙门氏菌，上游引物序列如SEQ ID No.16所示，下游引物序列如SEQ ID No.17所示，探针序列如SEQ IDNo.18所示。上述引物和探针针对staG基因设计。第7组检测剂：用于检测志贺氏菌，上游引物序列如SEQ ID No.19所示，下游引物序列如SEQ ID No.20所示，探针序列如SEQ IDNo.21所示。上述引物和探针针对ipaH基因设计。第8组检测剂：用于检测鹦鹉热衣原体，上游引物序列如SEQ ID No.22所示，下游引物序列如SEQ ID No.23所示，探针序列如SEQ IDNo.24所示。上述引物和探针针对ompA基因设计。第9组检测剂：用于检测普氏立克次氏体，上游引物序列如SEQ ID No.25所示，下游引物序列如SEQ ID No.26所示，探针序列如SEQID No.27所示。上述引物和探针针对gltA基因设计。第10组检测剂：用于检测埃博拉病毒，上游引物序列如SEQ ID No.28所示，下游引物序列如SEQ ID No.29所示，探针序列如SEQID No.30所示。上述引物和探针针对埃博拉病毒核蛋白设计。第11组检测剂：用于检测汉坦病毒，上游引物序列如SEQ ID No.31所示，下游引物序列如SEQ ID No.32所示，探针序列如SEQ ID No.33所示。上述引物和探针针对汉坦病毒核蛋白设计。第12组检测剂：用于检测禽流感病毒，上游引物序列如SEQ ID No.34所示，下游引物序列如SEQ ID No.35所示，探针序列如SEQ ID No.36所示。上述引物和探针针对禽流感病毒基质蛋白。第13组检测剂：用于检测天花病毒，上游引物序列如SEQ ID No.37所示，下游引物序列如SEQ ID No.38所示，探针序列如SEQ ID No.39所示。上述引物和探针针对A38R基因设计。第14组检测剂：用于检测肉毒梭状芽孢杆菌，上游引物序列如SEQ ID No.40所示，下游引物序列如SEQ ID No.41所示，探针序列如SEQ ID No.42所示。上述引物和探针针对botA基因设计。第15组检测剂：用于检测金黄色葡萄球菌，上游引物序列如SEQ ID No.43所示，下游引物序列如SEQ ID No.44所示，探针序列如SEQ ID No.45所示。上述引物和探针针对fmhB基因设计。第16组检测剂：用于检测相思子毒素，上游引物序列如SEQ ID No.46所示，下游引物序列如SEQ ID No.47所示，探针序列如SEQ ID No.48所示。上述引物和探针针对凝集素设计。具体地，反应元件230还包括分别装载第17组检测剂的反应池231。其中第17组检测剂：用于细菌阳性质控，上游引物序列如SEQ ID No.49所示，下游引物序列如SEQ ID No.50所示，探针序列如SEQ IDNo.51所示。上述引物和探针针对16S rDNA基因设计。通过阳性质控，更加准确的反应检测结果。
具体地，探针的5'端上设有FAM荧光基团，3'端上设有TAMRA荧光基团。在检测的过程中，如果同时针对多种病原微生物进行检测，常出现因各个引物退火温度不同，导致同时检测时退火温度难以协调，检测结果不准确的问题。本研究查找具有特异性的病原微生物靶标基因，设计筛选出上述分别针对特定的基因或蛋白进行设计的检测剂，特异性设计的17组检测剂引物退火温度均在60℃左右，避免同时检测时因退火温度不同导致检测结果不准确的问题，经过一次样本处理，能够同时检测7种细菌、2种立克次体、4种病毒、1种真菌和2种生物毒素，以及1个阳性质控，检测准确性好，灵敏度高。从未具有统一扩增条件，实现大规模阵列qPCR，简化基于传统扩增管单一样本检测的实现难度，提高qPCR检测通量与检测效率，符合口岸卫生检疫的实际需求。
具体地，一个反应池231装载一组检测剂。一组检测剂中，上游引物的浓度为300nmol/L～500nmol/L，下游引物的浓度为300nmol/L～500nmol/L，探针的浓度为200nmol/L～400nmol/L。
具体地，微流控芯片20包括底板和顶板，在底板上开设相应的加样池210、分样缓冲池223和反应池231的槽，槽深均为2.0mm。将每一组的上游引物、下游引物、探针混合配制成预置液，然后分别点到反应池231中，两个或两个以上的反应池231中可以含有相同的检测剂，以在一个检测中获得两个或两个以上的平行实验的结果，提高检测的准确性。点样完成后用顶板封装，常温干燥或冻干，制得微流控芯片20。优选地，顶板为透明度高的压敏膜，检测的时候透明度高的压敏膜朝向光学装置30一侧。优选地，微流控芯片20的边缘进行了抛光处理，使得检测时光信号传播变异系数尽可能小。
具体地，请参阅图5，本实施方式中，毛细管240包括导液管241和阻止管243，毛细管240进行了疏水处理。导液管241用于连通分样缓冲池223和反应池231。阻止管243与导液管251交叉，部分导液管241延导液管241的径向向外凸起形成阻止管243。具体地，导液管241和阻止管243组合形成十字架的形状。当待检测样品经过第二次离心进入反应池231中后，后续加热反应时，进入反应池231的溶液不会倒流入分样缓冲池223中造成液体泄漏以及交叉污染。
在一个实施方式中，微流控芯片20上还设有虹吸通道250，虹吸通道250用于连通加样池210和分样元件220。该虹吸通道250的一端连接加样池210，另一端连接弧形通道210的进口端，虹吸通道250上设有多个弯道251，避免液体倒流。具体地，虹吸通道250进行亲水处理，虹吸通道250将加样池210中的液体吸入到弧形通道210中。在离心运动的作用下，弧形通道210内的液体依次填充多个分样缓冲池223，多余的待检测样品流入废液池225中。
在一个实施方式中，微流控芯片20上还设有排气管260，排气管260用于将加样池210和分样元件220气流导通，排气管260一端连接加样池210，排气管260的另一端连接弧形通道210的出口端。通过设置排气管260，使得加样池210和弧形通道210内的气压平衡，便于弧形通道210内的液体依次填充多个分样缓冲池223。具体地，部分排气管260延排气管260的径向向外凸起形成排气腔261，排气腔261上设有与外界连通的排气孔2003。待检测样品填充多个分样缓冲池223后，挤出的气体通过排气管260进入排气腔261中，由排气孔2003排出。排气腔261处的体积较大，以防液体被溅出。
在一个实施方式中，微流控芯片20上设有导热通道270，导热通道270贯穿微流控芯片20。在加热时，通过导热通道270导通微流控芯片20两面的气流，使得微流控芯片20受热均匀。
具体的，微流控芯片20为圆形微流控芯片，加样池210、分样元件220和反应元件300沿微流控芯片20的径向依次向外分布，弧形通道210与微流控芯片20同心设置。
具体地，请参阅图6，光学装置30包括激发光源310、激发光透射镜320、射出光透镜330、滤片340以及光学传感器350。激发光源310用于发射激光，激发光透射镜320用于将激光聚焦照射到待检测的反应池231上，以激发待检测的反应池231内的反应物产生光信号。激发光源310例如为发光二极管或激光光源等。反应池231中的反应物在激发光的照射下产生光信号，射出光透镜330用于汇聚反应池231内的反应物产生的光信号。滤片340用于将汇聚后的光信号过滤以传输至光学传感器350中，通过光学传感器350接受并记录每个反应池231的信号强度。光学传感器350例如为光电倍增管或光电二极管等。当然，在其他实施方式中，射出光透镜330和滤片340也可以省略。
在一个实施方式中，激发光源310发射的激光照射在待检测的反应池231上，且激光与微流控芯片20所在的平面垂直。激发光源310正对微流控芯片20，发射的激光照射在反应池231上。具体地，光学传感器350安装在壳体10上，且光学传感器350与微流控芯片20所在的平面平行。在微流控芯片20转动的过程中接受各个反应池231发出的光信号。具体地，检测时，激发光源310、激发光透射镜320和待检测的反应池231三者在一条直线上。待检测的反应池231、射出光透镜330、滤片340以及光学传感器350在一条直线上。进一步地，射出光透镜330、滤片340以及光学传感器350靠近微流控芯片20的边缘设置。激发光源310、激发光透射镜320和待检测的反应池231连成的直线与待检测的反应池231、射出光透镜330、滤片340以及光学传感器350连成的直线在待检测的反应池231处相交且两条直线相互垂直，降低检测时因仪器导致的差异性，提高检测的灵敏度。
具体地，转动装置40用于带动微流控芯片20转动，以使各个反应池231依次经过光学装置30，实现检测过程自动化。转动装置40例如为旋转电机等。
请再次参阅图1，在一个实施方式中，检测系统01还包括加热器50和冷却器60，加热器50和冷却器60均位于容纳腔1001内。加热器50包括热源51和散热器53，热源51用于提供热能。散热器51环绕热源51设置。散热器53例如为风扇，通过散热器53加速热源51产生的热量扩散到容纳腔1001内，使得微流控芯片20升温均匀。冷却器60用于对微流控芯片20降温。在反应过程中，根据进程不同，需要快速切换温度，以使待检测样品与检测剂在反应池231内能够顺利反应。具体地，冷却器60设置在微流控芯片20的正下方。
上述设置的加热器50和冷却器60，利用非接触平衡温控技术实现高通量微流控芯片的同步快速温度控制。该温控技术相较于传统基于热电半导体(帕尔贴)的加热方式具有以下几个优势：a)减少了温度控制成本，不再依赖于传统接触式热电半导体模块，更适合于小型微流控芯片的整体温度控制；b)升降温迅速，且旋转式空气传热温度均一性更好；c)扩展兼容性强，针对不同形状及不同结构的微流控芯片都能很好的进行温度控制及优化测试，摆脱了传统接触式温控模块的尺寸局限且没有边缘效应。
在一个实施方式中，壳体10上设有空气通道开关1003。壳体10气密封好，打开或关闭气体通道开关1003，加速容纳腔1001与外界的气体对流。
具体的，微流控芯片20可拆卸的设置在转动装置40。检测系统01还包括锁定微流控芯片20的锁定机构70，通过的锁定机构70防止离心过程中微流控芯片20偏离运行轨道。
上述检测系统01，一次上样能够同时检测多种病原微生物，样品处理步骤简单，检测效率高，同时加样量容易控制，进入每个反应池231中的待检测样品体积相等，检测结果更加准确，检测过程自动化，满足口岸卫生检疫高效率、大样本量病原微生物快速检测排查的应用要求。
一实施方式的非疾病诊断和治疗的检测高致病性病原微生物含量的方法，包括如下步骤S110～S150。
S110、将待检测样品加入图1所示的检测系统中，其中待检测样品置于加样池中。
具体地，待检测样品可以是血清，粉末等。将待检测样品配制成溶液形式，从加样孔2001加入到加样池210中。
S120、通过转动装置带动微流控芯片以第一速率进行离心转动，以将加样池内的待检测样品从弧形通道依次进入多个所述分样缓冲池内。
具体地，第一速率为800rpm～1000rpm。通过离心使得待检测样品进入弧形通道210，从弧形通道210的进口端至出口端依次填充多个分样缓冲池223，多余的待检测样品流入废液池225中。
S130、通过转动装置带动微流控芯片以第二速率进行离心转动，以将分样缓冲池内的待检测样品通过毛细管进入反应池内。
具体地，第二速率为2500rpm～3000rpm。在较大的离心速率作用下，分样缓冲池内223的待检测样品经过从毛细管240进入反应池231中，与预先储存在反应池231内的检测剂发生反应。
S140、通过转动装置带动微流控芯片以第三速率进行离心转动，使各个反应池依次经过光学装置，激发光源发射的激光通过激发光透射镜聚焦照射到待检测的反应池上，以激发待检测的反应池内的反应物产生光信号，光学传感器接收光信号。
具体地，第三速率为200rpm～600rpm。微流控芯片20以较低的速率转动，反应池231依次经过光学装置30，通过光学装置30检测获得相应的反应光信号。
S150、根据光信号计算获得待检测样品中各高致病性病原微生物含量。
例如，光学传感器记录所有反应池231反应过程中的荧光信号强度值，绘制对应的扩增曲线，并对反应结果进行分析，获得待检测样品中各高致病性病原微生物含量。
上述检测方法能够直接检测未经处理的复杂样本，例如血清，粉末等，且具有单次反应同步快速检测多种病原体的能力，缩短口岸卫生检疫响应时间，提高检测效率。上述检测方法自动化程度高，避免了潜在的生物安全威胁，通过离心微流控芯片技术可快速实现同一生物样本或临床样本的样品高通量分配，减少了试剂消耗与时间消耗，具有显著的成本效益。
以下为具体检测例
检测例一：微流控芯片高通量基因检测系统01如图1所示，反应元件230包括64个反应池231，标号分别为1号～64号。其中1号～3号分别装载高、中、低三个浓度的第1组检测剂，4号～51号分别装载高、中、低三个浓度的第2组～第16组检测剂。52号装载第17组检测剂(阳性对照)。第53号～64号为空白对照。其中1号～51号中高浓度检测剂上游引物的浓度为500nmol/L、下游引物的浓度500nmol/L、探针的浓度为400nmol/L。中浓度检测剂上游引物的浓度为400nmol/L、下游引物的浓度400nmol/L、探针的浓度为300nmol/L。低浓度检测剂上游引物的浓度为300nmol/L、下游引物的浓度300nmol/L、探针的浓度为200nmol/L。第17组检测剂中上游引物的浓度为400nmol/L、下游引物的浓度400nmol/L、探针的浓度为300nmol/L。先进行预实验，其中，用第1组检测剂荧光PCR检测不同的浓度的炭疽芽孢杆菌，获得的PCR扩增曲线以及制得的标准曲线如图7所示。用第2组检测剂荧光PCR检测不同的浓度的布鲁氏杆菌，获得的PCR扩增曲线以及制得的标准曲线如图8所示。用第3组检测剂荧光PCR检测不同的浓度的鼻疽伯克氏菌，获得的PCR扩增曲线以及制得的标准曲线如图9所示。用第4组检测剂荧光PCR检测不同的浓度的土拉弗氏菌制，获得的PCR扩增曲线以及制得的标准曲线如图10所示。用第5组检测剂荧光PCR检测不同的浓度的沙门氏菌，获得的PCR扩增曲线以及制得的标准曲线如图11所示。用第6组检测剂荧光PCR检测不同的浓度的伤寒沙门氏菌，获得的PCR扩增曲线以及制得的标准曲线如图12所示。用第7组检测剂荧光PCR检测不同的浓度的志贺氏菌，获得的PCR扩增曲线以及制得的标准曲线如图13所示。各组检测剂中上游引物的浓度为400nmol/L，下游引物的浓度为400nmol/L，探针的浓度为300nmol/L。从图7～图13可以看出，各组检测剂制得的标准曲线线性好，说明设计的引物特异性好、灵敏度高，且各组检测剂引物退火温度均在60℃左右，避免同时检测时因退火温度不同导致检测结果不准确的问题，能够用在一块微流控芯片20上进行检测。
然后将待检测样品(rpoB基因的核酸样本)从加样孔2001加入到加样池210中。将加样后的微流控芯片20放置在转动装置40上，并用锁定机构70锁定。启动检测系统01，转动装置40带动微流控芯片20以800rpm离心1min，离心使得待检测样品进入弧形通道210，从弧形通道210的进口端至出口端依次填充多个分样缓冲池223。多个分样缓冲池223体积相等且从弧形通道210的进口端至出口端分样缓冲池223的深度依次减小，便于待检测样品顺利填满每个分样缓冲池223，保证分样缓冲池223内的待检测样品体积相等。然后转动装置40带动微流控芯片20以2500rpm离心2min，使得每个分样缓冲池223内的待检测样品从毛细管240进入反应池231中，与预先储存在反应池231内的检测剂发生反应。然后将离心速率降至400rpm。启动加热器50进行加热，热源51开始升温对容纳腔1001内的空气进行加热，同时散热器53开始工作并引起内循环气流将热空气搅动使得微流控芯片20得到均匀加热。达到目标温度95℃后，热源51将降低功率以维持微流控芯片20进行PCR(聚合酶链式反应)所需的变性温度。此后，气体通道开关1003打开，热源51停止工作。冷却器60开始工作，将外部冷空气引入系统中替代原有热空气完成降温，达到目标温度60℃后，气体通道开关1003关闭，同时冷却器60停止工作，维持微流控芯片20进行PCR所需的延伸时间。这样即完成一轮PCR循环过程。光学装置30在微流控芯片20进行PCR延伸时间内完成对反应池231的荧光检测，当容纳腔1001内温度达到60℃时，激发光源310开始工作，此时微流控芯片20的反应池231在400rpm的转速下将依次通过激发光的光路，激发光在激发光透射镜320的作用下聚焦在反应池231中并激发出反应池231内检测剂(如引物、探针)进行qPCR反应水解探针所产生的荧光信号。荧光信号依次通过射出光透镜330和滤片340，最终被光学传感器350接收。光学传感器350接受并记录当前循环信号强度，40轮循环后，系统将记录完所有反应池231的40轮循环荧光信号强度值，绘制对应的qPCR扩增曲线，结果如图14所示。第1号～3号以及第52号四个反应池中有qPCR扩增曲线，而其他编号的反应池无qPCR扩增曲线。该检测系统01能够获得各个反应池231的光信号，同时检测多种病原微生物，样品处理步骤简单，检测效率高。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳国际旅行卫生保健中心
深圳市检验检疫科学研究院
<120> 基于微流控芯片的基因检测系统及检测方法
<160> 51
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgtcgtaca cttgatcgca 20
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gccttctgac tcaggagcat aa 22
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcagctcaa catcaccttc taccactcc 29
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cctactgctg ctcctgttga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgtcgagctg ccagttgtaa 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caccaccgac gaagccgcca g 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcaggtcaa cgagcttcac 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgaacagcgt gaggaagagg 20
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
catcgtcgtg ctgtcgctgc tgc 23
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgctgctcag acagctacta c 21
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcttgtatca tggcacttag aacc 24
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aagctgctgc tgtatctaag ccaactgca 29
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggagcatatt cgtggagcaa tg 22
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
catcctcaac ttcagcagat acca 24
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
actgctcgta attcgccgcc attgg 25
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
tggctgaagg aaggtcatct c 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tccggcatcc agtacgttat g 21
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
taacggcagc ggcaaccaca ccta 24
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
caggcagaag agcagaagta tgag 24
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cagtctcacg catcacctgt g 21
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgcatccgca tcaccgctca gac 23
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tcaggagatc cttgcgatcc 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cggtctgcca tttgcttctg 20
<210> 24
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
acttggtgtg acgccattag catccgc 27
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
catgcagacc atgagcagaa tg 22
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
accagtgcta atacatgcaa aagg 24
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cctgatgagc cagcaatccg aactgttga 29
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggcaccacag gagatcttga 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcttggtgat gtggaggttg 20
<210> 30
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
cgacgacgat gacgacagcc aaccag 26
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
tccagataca gcagcagtta gc 22
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gcctttgact cctttgtctc cata 24
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
tgcctaatgc cacttgccgc tgc 23
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gcgactacca caaacccact a 21
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
caccatttgc ctagcctgac 20
<210> 36
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ctgctgcttg ctcacttgat cctgccat 28
<210> 37
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tctgctaacg aggctgctat tac 23
<210> 38
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gtgctagacg caacctttct atga 24
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
cgccactgcc gttgctgctg 20
<210> 40
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gcccagattt tacatttggt tttg 24
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tgtgctaatg ttactgctgg a 21
<210> 42
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
tgatacaaat cctcttttag gtgcaggca 29
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ggaacgcgat ggcttcttaa c 21
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
tcgctatatt ttcttttggg tcca 24
<210> 45
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cagcatctcc atcttcatgc aacgcatca 29
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
caggatcacg aagcattcaa tacg 24
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cttggaactg cgcttggtag 20
<210> 48
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
accgtgcagc ttattcttcg tcgtctcg 28
<210> 49
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
tcctacggga ggcagcagt 19
<210> 50
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ggactaccag ggtatctaat cctgtt 26
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
cgtattaccg cggctgctgg cac 23
Claims (10)
1.一种基于微流控芯片的基因检测系统，其特征在于，包括：
壳体，内设有容纳腔；
微流控芯片，设置在所述容纳腔内，所述微流控芯片上设有加样池、分样元件以及反应元件，所述加样池用于加入待检测样品，所述分样元件包括弧形通道和多个分样缓冲池，所述弧形通道与所述加样池连通，所述多个分样缓冲池位于所述弧形通道的外侧且沿所述弧形通道的周向依次排布，且所述分样缓冲池沿所述弧形通道的径向自所述弧形通道的外周缘向外延伸，所述多个分样缓冲池的体积相等，且从所述弧形通道的进口端至出口端方向所述分样缓冲池的深度依次减小，所述微流控芯片为圆形微流控芯片，所述加样池、所述分样元件和所述反应元件沿所述微流控芯片的径向依次向外分布，所述弧形通道与所述微流控芯片同心设置，所述反应元件包括装载细菌检测剂的反应池、装载立克次体检测剂的反应池、装载病毒检测剂的反应池、装载真菌检测剂的反应池和装载生物毒素检测剂的反应池，所述反应池与所述分样缓冲池通过毛细管连通；
光学装置，包括激发光源、激发光透射镜和光学传感器，所述激发光源用于发射激光，所述激发光透射镜用于将所述激光聚焦照射到待检测的所述反应池上，以激发待检测的所述反应池内的反应物产生光信号，所述光学传感器用于接收所述光信号；及
转动装置，用于带动所述微流控芯片转动，以使各个所述反应池依次经过所述光学装置。
2.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述反应元件包括分别装载如下检测剂的反应池，每一组所述检测剂中均包括上游引物、下游引物和探针；
第1组检测剂：用于检测炭疽芽孢杆菌，上游引物的序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示，探针序列如SEQ ID No.3所示；
第2组检测剂：用于检测布鲁氏杆菌，上游引物序列如SEQ ID No.4所示，下游引物序列如SEQ ID No.5所示，探针序列如SEQ ID No.6所示；
第3组检测剂：用于检测鼻疽伯克氏菌，上游引物序列如SEQ ID No.7所示，下游引物序列如SEQ ID No.8所示，探针序列如SEQ ID No.9所示；
第4组检测剂：用于检测土拉弗氏菌，上游引物序列如SEQ ID No.10所示，下游引物序列如SEQ ID No.11所示，探针序列如SEQ ID No.12所示；
第5组检测剂：用于检测沙门氏菌，上游引物序列如SEQ ID No.13所示，下游引物序列如SEQ ID No.14所示，探针序列如SEQ ID No.15所示；
第6组检测剂：用于检测伤寒沙门氏菌，上游引物序列如SEQ ID No.16所示，下游引物序列如SEQ ID No.17所示，探针序列如SEQ ID No.18所示；
第7组检测剂：用于检测志贺氏菌，上游引物序列如SEQ ID No.19所示，下游引物序列如SEQ ID No.20所示，探针序列如SEQ ID No.21所示；
第8组检测剂：用于检测鹦鹉热衣原体，上游引物序列如SEQ ID No.22所示，下游引物序列如SEQ ID No.23所示，探针序列如SEQ ID No.24所示；
第9组检测剂：用于检测普氏立克次氏体，上游引物序列如SEQ ID No.25所示，下游引物序列如SEQ ID No.26所示，探针序列如SEQ ID No.27所示；
第10组检测剂：用于检测埃博拉病毒，上游引物序列如SEQ ID No.28所示，下游引物序列如SEQ ID No.29所示，探针序列如SEQ ID No.30所示；
第11组检测剂：用于检测汉坦病毒，上游引物序列如SEQ ID No.31所示，下游引物序列如SEQ ID No.32所示，探针序列如SEQ ID No.33所示；
第12组检测剂：用于检测禽流感病毒，上游引物序列如SEQ ID No.34所示，下游引物序列如SEQ ID No.35所示，探针序列如SEQ ID No.36所示；
第13组检测剂：用于检测天花病毒，上游引物序列如SEQ ID No.37所示，下游引物序列如SEQ ID No.38所示，探针序列如SEQ ID No.39所示；
第14组检测剂：用于检测肉毒梭状芽孢杆菌，上游引物序列如SEQ ID No.40所示，下游引物序列如SEQ ID No.41所示，探针序列如SEQ ID No.42所示；
第15组检测剂：用于检测金黄色葡萄球菌，上游引物序列如SEQ ID No.43所示，下游引物序列如SEQ ID No.44所示，探针序列如SEQ ID No.45所示；
第16组检测剂：用于检测相思子毒素，上游引物序列如SEQ ID No.46所示，下游引物序列如SEQ ID No.47所示，探针序列如SEQ ID No.48所示。
3.根据权利要求2所述的检测系统，其特征在于，所述检测剂中，所述上游引物的浓度为300nmol/L～500nmol/L，所述下游引物的浓度为300nmol/L～500nmol/L，所述探针的浓度为200nmol/L～400nmol/L。
4.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述光学装置还包括射出光透镜和滤片，其中，所述射出光透镜用于汇聚所述反应池内的反应物产生的所述光信号，所述滤片用于将汇聚后的所述光信号过滤以传输至所述光学传感器。
5.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述激发光源发射的所述激光照射在待检测的所述反应池上，且所述激光与所述微流控芯片所在的平面垂直，所述光学传感器安装在所述壳体上，且所述光学传感器与所述微流控芯片所在的平面平行。
6.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述微流控芯片上还设有：
废液池，所述废液池设置在所述弧形通道的出口端，所述废液池沿所述弧形通道的径向向外延伸；
虹吸通道，用于连通所述加样池和所述分样元件，所述虹吸通道的一端连接所述加样池，所述虹吸通道的另一端连接所述弧形通道的进口端，所述虹吸通道上设有多个弯道；及
排气管，用于将所述加样池和所述分样元件气流导通，所述排气管一端连接所述加样池，所述排气管的另一端连接所述弧形通道的出口端，部分所述排气管延所述排气管的径向向外凸起形成排气腔，所述排气腔上设有与外界连通的排气孔。
7.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述分样缓冲池为矩形分样缓冲池，所述矩形分样缓冲池的池底设有倒角，所述分样缓冲池的深宽比为1:1～4:1。
8.根据权利要求1所述的检测系统，其特征在于，所述检测系统还包括：
加热器，位于所述容纳腔内，所述加热器包括热源和散热器，所述热源用于提供热能，所述散热器环绕所述热源设置；及
冷却器，位于所述容纳腔内，所述冷却器用于对所述微流控芯片降温。
9.一种非疾病诊断和治疗的检测高致病性病原微生物含量的方法，其特征在于，包括如下步骤：
将待检测样品加入如权利要求1～8任一项所述的检测系统中，其中所述待检测样品置于所述加样池中；
通过所述转动装置带动所述微流控芯片以第一速率进行离心转动，以将所述加样池内的所述待检测样品从所述弧形通道依次进入多个所述分样缓冲池内；
通过所述转动装置带动所述微流控芯片以第二速率进行离心转动，以将所述分样缓冲池内的所述待检测样品通过所述毛细管进入所述反应池内；
通过所述转动装置带动所述微流控芯片以第三速率进行离心转动，使各个所述反应池依次经过所述光学装置，所述激发光源发射的激光通过所述激发光透射镜聚焦照射到待检测的所述反应池上，以激发待检测的所述反应池内的反应物产生光信号，所述光学传感器接收所述光信号；以及
根据所述光信号计算获得所述待检测样品中各高致病性病原微生物含量。
10.根据权利要求9所述的检测高致病性病原微生物含量的方法，其特征在于，所述第一速率为800rpm～1000rpm，所述第二速率为2500rpm～3000rpm，所述第三速率为200rpm～600rpm。
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