CN102260738A

CN102260738A - 一种寡核苷酸基因芯片及其在检测多种病菌方面的应用

Info

Publication number: CN102260738A
Application number: CN2011101425236A
Authority: CN
Inventors: 李守军; 贾坤; 林志雄
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2011-05-30
Filing date: 2011-05-30
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2031-05-30
Also published as: CN102260738B

Abstract

本发明一种寡核苷酸基因芯片及其在检测多种病菌方面的应用。所述寡核苷酸基因芯片的探针可分别与结核分枝杆菌（M ． tuberculosis）、牛分枝杆菌（M.bovis）、鸟分枝杆菌（M.avium）、副结核分枝杆菌（M.paratuberculosis）和布氏杆菌（Brucella）的PCR扩增产物进行杂交反应；所述探针分别具有SEQIDNO：25、SEQIDNO：31、SEQIDNO：35、SEQIDNO：37和SEQIDNO：39所示的核苷酸序列。本发明所述基因芯片应用于检测所述病菌具有良好的重复性，批间批内变异系数CV值％均小于15％。对致病菌待测样本的检测表现出了高的准确度，表明该方法特异性良好，灵敏度高，实现了高通量、平行化检测，检测结果快速、准确，从核酸制备到完成检测，整个过程仅需6～8h，在制备病原检测、进出口检疫、流行病学分析用的试剂和产品等方面具有广阔的前景。

Description

一种寡核苷酸基因芯片及其在检测多种病菌方面的应用

技术领域

本发明属于基因芯片技术领域，具体涉及一种寡核苷酸基因芯片及其在检测多种病菌方面的应用。

背景技术

牛结核病（Bovis Tuberculosis），是由牛分枝杆菌及结核分枝杆菌等菌引起的传染性疾病，该病不仅可以导致奶牛生产力下降，还是一种重要的人兽共患病，严重威胁着公共卫生安全。

牛布病（Brucellosis）是由流产布氏杆菌等菌引起的传染性疾病，可以导致奶牛的流产，同时该菌也可以感染人，且难以治愈，今年来人感染布氏杆菌的病例呈上升趋势，因此对于本病原菌的检测也具有重要的公共卫生学意义。

目前关于结核病原菌的检测主要是通过结核菌素实验，但是受制于物理以及生物因素的影响，对本类病原菌的检出率不高；细菌分离培养是经典的鉴别手段，但是分枝杆菌生长周期长，一般要培养4～8周，不利于快速诊断；PCR方法的建立可以实现快速、灵敏的检测，但是易受到污染从而导致假阳性的结果。通过检测外周血淋巴细胞释放IFN-γ的水平也可以对分枝杆菌感染进行检测，且具有较高的敏感性和特异性，不足之处是成本太高，且必须在采血后8h内完成检测。对于布氏杆菌的检测，主要是采用试管凝集试验以及虎红平板凝集试验，该方法会受到物理或生物因素影响，导致假阳性或者假阴性结果。

因此针对以上几种病原菌迫切需要研制出一种新型、快速、准确、高通量的检测技术，基因芯片方法以其特异性好，检测通量高而具有一定优势，目前利用基因芯片检测以上所述病原菌的相关技术亟待进一步研究。

发明内容

本发明的一个目的是针对现有技术的不足，提供一种应用于检测多种病菌的寡核苷酸基因芯片，所述病菌包括结核分枝杆菌（M．tuberculosis）、牛分枝杆菌（M. bovis）、鸟分枝杆菌（M. avium）、副结核分枝杆菌（M. paratuberculosis）和布氏杆菌（Brucella）等。

本发明的另一个目的是提供所述基因芯片在检测多种病菌方面的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种寡核苷酸芯片，包括基底和固定于该基底上的探针，所述探针可分别与结核分枝杆菌（M．tuberculosis）、牛分枝杆菌（M. bovis）、鸟分枝杆菌（M. avium）、副结核分枝杆菌（M. paratuberculosis）和布氏杆菌（Brucella）的PCR扩增产物进行杂交反应；

所述五种细菌的基因序列的检索号分别为：M. tuberculosis检索号为：S69737.1；M .bovis 检索号为：BX248341.1；M. avium 检索号为：NC_008595；M. paratuberculosis 检索号为：S74401.1；Brucella 检索号为：NC_006933.1。

所述探针是以Genebank上已公布的M．tuberculosis H37Rv、M. bovis AN5、M. avium、M. paratuberculosis和Brucella五种细菌的基因序列，分别选择M．tuberculosis H37Rv的mpt40基因、M. bovis AN5的pncA基因、M. avian的gyrB基因、M. paratuberculosis的IS-900基因、Brucella的Alkb基因序列为参考序列，通过DNA star软件分析比较，设计出多组引物，进行比较分析，针对每种细菌确定了一对特异性引物；克隆鉴定上述5种菌株的阳性质粒，构建质粒参比品；针对上述菌株基因片段设计了15条相应的寡核苷酸探针进行特异性的筛选检测，最终筛选出5条灵敏度高、特异性强的探针。

所述引物分别具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列；

所述探针分别具有SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31 、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列。

引物的核苷酸序列表示如下：

Figure 2011101425236100002DEST_PATH_IMAGE001

探针序列信息如下：

探针名称	探针序列（5'-3'）	长度(bp)
			pt1	ACGGGTGGCTCAAGTTGGGTCTGGT-NH2-	25
pb3	CGGCGTCATGGACCCTATATCTG-NH2-	23
			A3	TCGAGGGCCAGACCAAGACCAAAC-NH2-	24
P2	GGCGTGGTCGTCTGCTGGGTTGATC-NH2-	25
			B2	AACATTGACCGCATTCATGGGTTTCG-NH2-	26

在上述序列基础上，本领域技术人员可以通过常规方法进行引物和探针的合成。所有下游引物在合成中用生物素基团亚磷酰化试剂在5’端进行Cy3标记。寡核苷酸探针在3’端进行氨基修饰，氨基基团与探针序列之间以间隔臂（聚乙二醇磷酰化试剂）相连，增加探针的活性动力并提高杂交荧光信号的强度。

本发明同时提供了所述基因芯片在检测多种病菌方面的应用，筛选特异性探针，将所筛选出的特异探针点样至基片上，与待测病菌菌株PCR扩增产物进行杂交反应，洗涤干燥后经扫描仪扫描获取杂交信号，实现检测目的。

具体地，包括以下步骤：

（1）应用权利要求1所述的引物和探针，将探针点样至基因基片上；

（2）基因基片上的探针与待测病菌菌株的PCR扩增产物进行杂交反应；

（3）杂交反应后，洗涤干燥，经扫描仪扫描获取杂交信号。

步骤（2）所述PCR扩增为五重PCR不对称反应体系，扩增条件为：

所述结核分枝杆菌（M．tuberculosis）、牛分枝杆菌（M. bovis）、鸟分枝杆菌（M. avium）、副结核分枝杆菌（M. paratuberculosis）和布氏杆菌（Brucella）引物的荧光引物与非荧光引物的最适浓度比例分别为10：1、8：1、10：1、10：1、10：1；终浓度分别为1.0μM/0.1μM、1.0μM/0.125μM、0.75μM/0.075μM、2.0μM/0.2μM、1.0μM/0.1μM；

DNA聚合酶的用量为1.0U；Mg²⁺浓度为3.0mM/L；PCR退火温度56℃。步骤（2）所述杂交反应的条件为：杂交温度为42℃，杂交时间为60min。

本发明的有益效果是：本发明可以实现对不同病原菌的快速，高通量检测，且具有较好的敏感性特异性，可以满足对相关病原菌检测的要求。

寡核苷酸芯片技术是利用了反相杂交的原理，经过碱基互补配对的严谨性保证杂交反应具有高度的特异性。由于杂交体之间的氢键结合力弱于共价键，在杂交或洗涤时容易被破坏，因此需要通过提高杂交和洗涤的严谨性来提高检测特异性，降低错配和背景，提高信号强度。本发明根据已发表的M.tuberculosis、M. bovis、M. avium、M. paratuberculosis和Brucella五种菌株序列选择保守区域（M．tuberculosis H37Rv的mpt40基因、M. bovis AN5的pncA基因、M. avian的gyrB基因、M. paratuberculosis的IS-900基因、Brucella的Alkb基因序列），综合考虑了引物区的保守性、扩增片段的大小、多重PCR反应中退火温度等重要因素，精确设计引物和探针；

不对称PCR（asymmetric PCR）是用不等量的一对引物，经PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物（低浓度引物）消耗完后，非限制性引物（高浓度引物）引导的PCR就会产生大量的单链DNA，获得特异的探针互补单链靶片段，可最大限度获得荧光标记单链杂交模板，提高杂交效率，并可免去对称PCR扩增产物变性后杂交的步骤。本发明关键是控制限制性引物的绝对量以成功进行不对称PCR，当荧光引物与非荧光引物的比值越大，则扩增所得到的单链也就越多，但同时由于上下游引物用量的不平衡也会导致扩增效率的下降，荧光标记的产物的产量下降。荧光标记的产物以单链的形式存在无疑对于杂交反应是有益的，但产物的量的多少对于杂交信号的影响也不容忽视，因此本发明对于荧光与非荧光引物的比例进行了优化；

随着生物技术的不断发展，对蛋白质、核酸及细胞标记的要求越来越高，传统的同位素标记方法已不能适应当今的发展。而发展起来的荧光探针技术已经在蛋白质、核酸、细胞检测及免疫分析等方面显现出巨大的潜能。荧光探针技术具备高度灵敏性和极宽的动态响应时间，可以使研究人员高灵敏和高选择性地检测复杂生物分子，包括活细胞中的特定成分。尤其近年来发展起来的荧光化学传感器和分子信号系统更是使荧光探针技术的应用有了很大程度的提高和扩充。如今，它的应用已深入到药物学、生理学、环境科学、信息科学等诸多领域。随着生命科学的飞速发展，对活性高、特异选择性好和灵敏度高的新型荧光探针的需求就显得越来越迫切了。目前，用于标记或衍生的荧光探针主要有荧光素类、罗丹明类、邻苯二甲醛类等化合物。其中荧光素及其衍生物在生物研究领域中占有极其重要的位置，一百年来一直是化学及生物分析领域中研究的热点。本发明采用PCR反应荧光标记法标记将荧光素Cy3标记修饰在特异性下游引物在5′端，获得较大的掺合标记率和背景强度，PCR反应过程中，通过Taq酶把荧光标记的引物掺入到PCR产物中，在完成对样品荧光标记的同时实现了对目标片段的特异性扩增，因而使得荧光标记效率大大提高，能够满足基于寡合苷酸芯片检测的灵敏度要求，从而本发明的检测目的。

探针浓度是影响探针特异性的重要因素，为了保证荧光信号强度，本发明综合考虑各种因素对检测效果的影响以及相互之间的影响作用，经过大量实验总结和分析，确定所用探针浓度选定为50μM，为成功筛选出5条特异探针制备牛结核及布病寡核苷酸芯片提供技术保证之一。

综上所述，本发明以Genebank上已公布的M．tuberculosis H37Rv、M. bovis AN5、M. avium、M. paratuberculosis和Brucella五种细菌的基因序列，分别选择M．tuberculosis H37Rv的mpt40基因、M. bovis AN5的pncA基因、M. avian的gyrB基因、M. paratuberculosis的IS-900基因、Brucella的Alkb基因序列为参考序列（Gene Bank检索号：M. tuberculosis检索号为：S69737.1；M .bovis 检索号为：BX248341.1；M. avium 检索号为：NC_008595；M. paratuberculosis 检索号为：S74401.1；Brucella 检索号为：NC_006933.1），通过DNA star软件分析比较，设计了12对引物用于比较分析，每种细菌挑选出一对特异性引物；克隆鉴定5种菌株的阳性质粒，构建质粒参比品；针对这个基因片段设计15条相应的寡核苷酸探针进行特异性的检测，最终筛选出5条灵敏度高、特异性强的探针点样，制备基因芯片；并最终确定M.tuberculosis、M.bovis、M.paratuberculosis、M. avium和Brucella的荧光引物与非荧光引物最佳比率、最适DNA聚合酶的用量、最适Mg²⁺浓度、最适PCR退火温度、最佳杂交温度和最适杂交时间等重要条件，本发明确定了每条探针的cutoff值，当检测单一菌株时，检测的灵敏度可达到10³ copies/μL；假定五种病原菌同时存在时，检测的灵敏度可达到10⁵ copies/μL。

本发明基因芯片检测方法具有良好的重复性，批间批内变异系数CV值％均小于15％。对致病菌待测样本的检测表现出了高的准确度，表明该方法特异性良好，灵敏度高，实现了高通量、平行化检测，检测结果快速、准确，从核酸制备到完成检测，整个过程仅需6～8h，在病原检测、进出口检疫、流行病学调查等方面具有广阔的前景。

附图说明

图1结核分枝杆菌和牛分枝杆菌探针矩阵分布图；

图2鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌及布氏杆菌探针矩阵分布图；

图3本发明基因芯片制备后外观；

图4牛分枝杆菌引物筛选电泳结果；

图5结核分枝杆菌引物筛选电泳结果；

图6鸟分枝杆菌引物筛选电泳结果；

图7副结核分枝杆菌引物筛选电泳结果；

图8布氏杆菌引物筛选电泳结果；

图9结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌、布氏杆菌的重组阳性质粒鉴定结果；

图10结核分枝杆菌不同引物浓度比芯片的检测结果；

图11结核分枝杆菌不同引物浓度比芯片杂交结果；

图12牛分枝杆菌不同引物浓度比芯片检测结果；

图13牛分枝杆菌不同引物浓度比芯片杂交结果；

图14鸟分枝杆菌不同引物浓度比芯片检测结果；

图15鸟分枝杆菌不同引物浓度比芯片杂交结果；

图16副结核分枝杆菌不同引物浓度比芯片检测结果；

图17副结核分枝杆菌不同引物浓度比芯片杂交结果；

图18布氏杆菌不同引物浓度比芯片检测结果；

图19布氏杆菌不同引物浓度比芯片杂交结果；

图20本发明检测用芯片外观及矩阵分布；

图21不同引物用量杂交信号图；

图22不同聚合酶用量芯片检测结果；

图23不同Mg²⁺浓度芯片检测结果；

图24不同退火温度芯片检测结果；

图25不同杂交温度芯片检测结果；

图26不同杂交时间芯片检测结果；

图27芯片特异性检测结果；

图28基因芯片检测灵敏度检测结果；

图29牛分枝杆菌灵敏度检测；

图30芯片检测结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌、布氏杆菌致病菌灵敏度结果；

图31多重PCR灵敏性结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。

实验材料

1.试剂

10×Buffer、dNTPs、Ex-Taq酶、Mg²⁺等PCR相关试剂购自宝生物（大连）有限公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自TIANGEN生物技术有限公司；pGEM-T连接试剂、SDS、琼脂糖购自Promega生物技术有限公司。

EDTA缓冲液：EDTA 0.05g，NaCl 0.05g，KCl 0.05g，Na₂HPO4 0.288g，KH₂PO4 0.05g，加双蒸水至250mL，高压灭菌，4℃保存备用。

PBS缓冲液(pH7.3)：NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na₂HPO4·12H₂O 2.9g，KH₂PO4 0.2g，加双蒸水至1,000mL，高压灭菌，4℃保存备用。

TE（pH8.0）：10mmol/ L Tris-Cl (pH8.0)，1mmol/ L EDTA（pH8.0）。

5×TBE：54g Tris，27.5g 硼酸，20mL 0.5mol/ L EDTA（pH8.0），加三蒸水定容至1,000mL。工作液浓度为1×。

50×TAE：242g Tris，57.1mL 冰醋酸，100mL 0.5mol/ L EDTA (pH8.0)，加三蒸水至1,000mL。工作液浓度为1×。

DNA纯化试剂盒E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit和质粒快速提取试剂盒E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit为Omega公司产品。

2.仪器

Sport Array 24基因芯片点样仪（美国Perkin Elmer），Scan array GX基因芯片扫描仪（美国Perkin Elmer），Mai Tai生物芯片杂交仪（SciGene），醛基化基因芯片片基、基因芯片点样液购自北京博奥生物技术有限公司、凝胶成像及分析系统（美国ABI公司），高速冷冻离心机（美国Beckman Allegra）。PCR仪（英国Thermo Hybaid公司），微量可调移液器（德国Eppendorf公司），高压灭菌锅（Sanyo公司），凝胶电泳仪（BIO-RAD公司），1K15台式离心机（Sigma公司）、台式恒温振荡培养箱（德国GFL公司）。

3.实验所用菌株

结核分枝杆菌M．tuberculosis H37Rv、牛分枝杆菌M. bovis AN5、M. avium、M. paratuberculosis标准株购自中国兽医药品监察所大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌等均为常规市购菌株。

4.探针、引物的合成及标记

寡核苷酸探针和引物由英潍捷基生物技术有限公司合成与标记。

5.培养基及电泳试剂配制

LB液体培养基：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl10g加单蒸水定容到1000mL，121～125℃高压灭菌15min，置4℃冰箱备用。制备LB固体培养基时，在其中加入琼脂粉15g，高压灭菌，无菌操作倒入灭菌平皿中，凝固后于温箱中培养过夜，4℃保存备用。

LB固体培养基：在LB液体培养基中加入琼脂粉至终浓度1.5%（W/V），121.5℃高压灭菌15min后分装入灭菌平皿内，凝固后4℃保存备用。

含Amp的LB固体培养基的制备：LB固体培养基高压灭菌，冷却至50℃后加入终浓度为100μg/mL的Amp，倒入平皿中，4℃保存备用。

1.5%的琼脂糖凝胶：称取琼脂糖1.5g放入锥形瓶，用1×TAE缓冲液定容至100mL。

其他试剂、材料、仪器和方法，除非特别说明，皆为本技术领域常规使用的试剂、材料、仪器和方法。

实施例1

（一）本发明基因芯片引物的设计及筛选

1.引物的设计

以Genebank ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov ) 已公布的M．tuberculosis H37Rv、M. bovis AN5、M. avium、M. paratuberculosis、Brucella五种细菌的基因序列，分别选择M．tuberculosis H37Rv的mpt40基因、M. bovis AN5的pncA基因、M. avian的gyrB基因、M. paratuberculosis的IS-900基因、Brucella的Alkb基因序列为参考序列（Gene Bank检索号：M. tuberculosis检索号为：S69737.1；M .bovis 检索号为：BX248341.1；M. avium 检索号为：NC_008595；M. paratuberculosis 检索号为：S74401.1；Brucella 检索号为：NC_006933.1），通过DNA star软件分析比较，选取无变异或变异最小的片段，利用Primer Premier5.0和Oliga6.0软件分别设计多对引物引物用于比较分析，本实施例分别选取2～3对引物，将其详细信息列于表1。

表1 引物的详细信息

Figure 2011101425236100002DEST_PATH_IMAGE002

Figure 2011101425236100002DEST_PATH_IMAGE003

注：M. tuberculosis检索号：S69737.1；M .bovis检索号：BX248341.1；M. avium 检索号：NC_008595；M. paratuberculosis 检索号：S74401.1；Brucella 检索号：NC_006933.1

2.本发明基因芯片引物的筛选

A细菌DNA的制备

挑取适量菌落（常规培养条件，挑取1～2个菌落）于装有1000μL无菌水的离心管中，12000 g离心5 min。吸去水，使细菌沉淀尽可能干燥。向装有细菌沉淀的离心管中加入600μL细胞裂解液（30 mmol/ L Tris. HCl pH8. 0，0. 1 mol/ L EDTA ，0. 1 mol/ L NaCl ，以上试剂在使用前均分装高压灭菌），再加20μL 10 mg/ mL的蛋白酶K，然后加200μL 1 %SDS，混匀，55 ℃保温1 h。12000 g离心5 min，取上清液于另一离心管中。向上清液中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1，体积比），反复混匀，12000 g 离心5 min，取上清液于另一离心管中。向上清液中加入2倍体积的无水乙醇，混匀，冰上放置10 min，12000 g离心5 min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。加入30μL TE缓冲液（其中含有20μg/ mL的胰RNA 酶），使DNA完全溶解，获得DNA为模板，- 20 ℃保存备用。上述所有操作均在BSL-2生物安全实验室完成。

B各片段的PCR扩增：以获得的DNA为模板进行PCR扩增，扩增体系为25μL。具体反应条件如下：

Figure 2011101425236100002DEST_PATH_IMAGE004

扩增完成后，各取5μL进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，扫描并观察结果。从上述引物对中各筛选出一对作为特异性引物序列，交由上海英骏生物技术有限公司重新合成，并在下游引物的5′端用Cy3标记，获得较大的掺合标记率和背景强度，保证扩增效率。

（二）质粒参比品的建立

为了便于开展结核及布病基因芯片检测方法的研究，确定统一的标准，并提供阳性标准对照品，本实施例特建立本发明所用的所有靶基因模板的标准品，作为实验的参比品。

（三）靶基因片段的扩增

以M.tuberculosis、M.bovis、M.avium、M.paratuberculosis和Brucella的基因组DNA作为模板，分别用针对每种菌株的所设计的不同引物对进行相应的PCR扩增，按如下体系配制PCR反应液。充分混匀，短暂离心后，置于PCR仪上进行PCR扩增。循环参数如下：94℃ 5min预变性，94℃ 30s，56℃ 30s和72℃ 30s，30个循环后72℃延伸5min。扩增完成后，各取5μL在1.5%琼脂糖凝胶电泳上进行分析

PCR反应组分	体积（μL）
		10×PCR Buffer(含20mM Mg²⁺)	2.5
上游引物（25uM）	0.5
		下游引物（25uM）	0.5
dNTP(2.5mM)	2.0
		模板	1.0
Taq DNA聚合酶（2.5U/μL)	0.5
		ddH2O	18
总计	25

（四）阳性质粒克隆及鉴定

1.感受态细胞的制备

以无菌环取冻存的大肠杆菌DH5α划线接种于LB平板，37℃培养过夜。挑取生长良好的单菌落接种于3mL LB液体培养基，37℃震荡培养4～6小时。将培养物按1%的比例接种于100mL LB液体培养基，37℃震荡培养至培养物的OD₆₀₀ 值约为0.5～0.8。将培养物倒入无菌的预冷的50mL离心管中，1000 g 4℃离心5 min。弃上清，将沉淀重悬于无菌的10mL0.1moL/L CaCl₂中水浴10 min。弃上清，将沉淀重悬于无菌的4mL 0.1moL/L CaCl₂中，加无菌甘油至终浓度为15%，混匀后分装至预冷的灭菌Eppendorf管，200μL/管，置于-70℃保存备用。

2. DNA片段的回收和纯化

按DNA凝胶纯化试剂盒说明书步骤进行。将PCR产物电泳后，在紫外灯下用清洁的手术刀片切下含有目的基因片段的凝胶并称重，按300μL/100mg加入试剂盒中的溶液2，再加入10μL试剂盒中的溶液1，置56～60℃的水浴10min，每3min振摇一次，使凝胶完全融化，14000 g离心1min。弃上清，用500μL溶液3重复操作一次。弃上清，置室温下至少30min，待沉淀呈乳白色，加入pH值为8.2的TE 40μL重悬沉淀，置56～60℃的水浴10min，每3min振摇一次，14000 g离心1min。取上清即为DNA片段溶液，冻存于-20℃备用。

3.连接：将上述纯化产物3μL，进行连接，将下述成分充分混匀，并短暂离心后，置于室温连接6h。反应体系如下：

连接反应组分	体积（μL）
		2×Buffer	5.0
T4 DNA连接酶	1.0
		pGEM-T载体	1.0
PCR产物	3.0
		Total	10μL

4.连接产物转化DH5α感受态细胞

按《分子克隆实验指南》第二版的方法进行。具体操作步骤如下：

（1）从-70℃冰箱取出DH5α 感受态细胞，立即手搓溶解，加入5μL连接产物,轻轻混匀，同时设阳性对照和阴性对照，冰浴30min，然后不要摇动管42℃热激90s，再次冰浴5min。

（2）向离心管中加入800μL 37℃预热的新鲜LB液体培养基，将管转移至摇床，37℃摇床150r/min振摇培养45min，恢复抗性。

（3）将适当体积（每个90mm平板约200μL）已转化的感受态细胞涂布于含Amp（10μg/mL）的LB固体培养基上。

（4）将涂好的平板室温放置一段时间至液体被吸收，然后倒置平皿，37℃温箱中培养过夜。

5.质粒DNA的小量制备

重组质粒的抽提按照OMEGA公司的E.N.Z.A质粒小抽试剂盒说明书进行。具体步骤如下：

（1）无菌挑取单菌落接种于含有5mL LB（Amp 100μg/mL）液体培养基的试管中，37℃、160r/min 摇床培养过夜，以扩增质粒。

（2）收集5mL 培养液，室温下12000×g 离心1min以收集菌体。

（3）尽量吸弃培养基，往沉淀中加入250μL SolutionI/RNaseA 混合液，涡漩重悬细胞。

（4）往重悬混合液中加入250μL SolutionII，轻轻颠倒旋转混匀4~6次，使菌体充分裂解直至形成透亮的裂解液。把裂解液放于室温2min。

（5）加入350μL Solution III，温和的上下颠倒离心管数次，直至形成白色絮状沉淀为止。于室温下10,000×g离心10min。

（6）将HinBind柱子套入2mL的收集管中，小心将上清液转移到柱子中。转移上清时，不要将细胞杂质等沉淀物转移到柱子中。室温下，10,000×g 离心1min，让上清液流过柱子，使质粒结合到柱子上。

（7）弃去滤出液，柱子重新套回收集管中，加入500μL Buffer HB。室温10 ,000×g 离心1min。

（8）弃去滤出液，柱子重新套回收集管中，加入750μL Wash Buffer，10,000×g 离心1min，弃去滤出液。

（9）重复步骤（7）一次。

（10）室温下，10,000×g离心空柱1min以干燥柱子。

（11）将柱子套回1.5mL 离心管中，加入50μL TE 缓冲液至柱子基质，室温下静置3min，10,000×g 离心1min 洗脱DNA。

6.重组质粒的PCR鉴定

取重组质粒1μL，作100× 稀释后，取1μL作模板。在PCR管中依次加入以下组分：灭菌水38.5 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，dNTP 3 μL，10×buffer 5 μL，模板1 μL，DNA Taq加至0.5 U，混匀后以下列条件进行扩增：94℃2min，1个循环；95℃ 30s，52℃ 45s，72℃ 45s，35个循环；72℃ 7min。扩增完毕后取5μL 1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并由上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。

（五）质粒参比品的建立

提取的质粒用NanoDrop 2000分光光度计在260nm波长处定量。按照1 OD=50μg计算所提取质粒的质量浓度，并按公式（浓度（copies/μL）=OD₂₆₀×稀释倍数×50×阿伏加德罗常数/双链长度bp×660）计算出质粒拷贝数。然后在无菌的条件下，把质粒溶液稀释至每微升含量为10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷等7个数量级，分装（200μL/管），－70℃保存。每次使用时取出1支，即可作为模板进行PCR扩增。

（六）寡核苷酸探针的筛选

1.寡核苷酸探针的设计

通过牛结核及布病引物筛选试验，每种菌挑选出一对特异性引物，针对这个基因片段设计了相应的寡核苷酸探针进行特异性的检测。本实施例给出针对每个基因片段设计的3～5条不同长度、不同位置的探针，筛选出灵敏度高、特异性强的探针用于基因芯片检测。设计的探针序列及详细信息见表2。

表2 检测牛结核及布病备选的寡核苷酸探针序列

Figure 2011101425236100002DEST_PATH_IMAGE005

2.寡核苷酸探针及引物的合成与标记

寡核苷酸探针采用标准亚磷酰胺化学方法合成。所有下游引物在合成中用生物素基团亚磷酰化试剂在5’端进行Cy3标记。所有引物及探针均由上海英骏生物技术有限公司按照要求合成标记。

3.基因芯片制备

寡核苷酸探针冻干粉融解前先3000 g离心45s，然后轻轻打开管盖，加入适当的灭菌去离子水溶解，用去离子水作为空白对照，根据提供的探针浓度，将各个探针用灭菌去离子水稀释至100μmoL/L，待用。探针筛选时，为便于操作，分为两次实验进行，即先筛选结核分枝杆菌及牛分枝杆菌特异探针，再筛选剩余菌株探针。点样矩阵排布见附图1和附图2。点样时，计算好点样位置，为便于识别，将自制贴膜贴于芯片片基上，见附

图3。附图1中，QC：质控；pt1-pt4分别为结核分枝杆菌特异探针；pb1-pb4为牛分枝杆菌特异探针；neg：阴性探针；b：空白对照；附图2中，QC：质控；B1、B2分别为布氏杆菌特异探针；P1、P2为副结核分枝杆菌特异探针；A1、A2、A3为鸟分枝杆菌特异探针；neg：阴性探针；附图3中左侧1-10：芯片点样区域；右侧：芯片制备后显微镜下图片。寡核苷酸探针用2×点样液稀释至终浓度50μmoL/L，取10μL转移至384孔板。用基因芯片点样仪将探针点到空白的醛基化修饰玻片上，点样仪内保持温度为23℃，相对湿度为60%-70％。寡核苷酸芯片制备完毕后，于100%湿盒中水合12h以上，使用前至少在室温放置干燥18h，待用。探针每点直径250μm，点间距为500μm。

4.芯片的杂交与检测

寡核苷酸基因芯片预处理：寡核苷酸芯片用0.2% SDS清洗2次，接着以去离子水清洗2次，然后放入1.5%～3.0%的硼氢化钠磷酸盐乙醇溶液中（pH7.0磷酸盐缓冲液：无水乙醇=3：1，体积比）作用5min，去离子水清洗后室内晾干或离心甩干，然后用于杂交。

杂交和杂交后处理：将5μL Cy3标记的PCR产物与10μL杂交液混合，转移至芯片的杂交区，芯片置于密闭的杂交盒中在42℃水浴中保温1h。杂交结束后，取出杂交盒中的芯片，先用预热的洗液A轻轻冲洗芯片表面残留的杂交液，然后将芯片置于洗涤器，在洗液A（1×SSC，0.2%SDS，预热至42℃），洗液B(0.2×SSC预热至42℃)和洗液C(0.1×SSC预热至42℃)中依次震荡洗涤2min。置室温晾干或离心甩干。

扫描和结果判定：芯片杂交洗涤干燥后，用芯片扫描仪Scan array GX在激光波长540nm，发射波长570nm（Cy3）PMT 650nm，power33%下对芯片进行扫描。在扫描出的TIFF图像中，使用F532 median作为单个点的信号强度，在扣除背景值以后，以每条探针重复点的均值计算信号强度，用扫描仪自带软件对结果进行分析。

5.寡核苷酸探针的筛选与优化

荧光引物与非荧光引物比例的确定

引物不对称PCR扩增会产生大量的单链DNA，可以省去杂交前对PCR产物变性的步骤，会提高基因芯片的杂交效率。在上述PCR反应条件不变的基础上，分别优化荧光引物（荧光引物MTR1，MBR3， MAR1， MPR1， BR2；非荧光引物MTF1，MBF3，MAF1，MPF1，BF2）在反应体系的最佳浓度比例。用于扩增不同基因片段的下游荧光引物终浓度为0.5μM，上游非荧光引物加入体系中的终浓度分别为0.5μM、0.1μM、0.05μM、0.025μM，上下游引物之间的比例即为：1：1、5：1、10：1、20：1。分别以质粒参比品（10⁶copies/μL）为模板进行扩增，产物分别与相应的芯片杂交。

本发明采用共聚焦自动扫描仪Scan array GX在激光波长540nm，发射波长570nm（Cy3）下对芯片扫描，分别进行自动聚焦预扫描和选择试验区域进行精细扫描，以便较低的背景下获得较高的信号值。并通过以下措施保证优良的扫描效果：（1）开始扫描前，对机器预热15min后再进行扫描；（2）引物等试剂分装后避光保存，减少冻融次数；所用的试剂保持稳定、均一；（3）杂交反应体系的量根据矩阵大小而定，过少会造成各探针点处的杂交液分布不均匀；过多则会溢出盖玻片外，阵列边缘的杂交液在杂交过程中挥发，边缘的探针接触不到杂交液造成周边信号弱，信号分布不均匀。（4）杂交过程中，保证杂交盒内100%的湿度，防治杂交液蒸干影响杂交效果。（5）杂交盒置于水浴或恒温箱时，如果不加盖玻片的情况下杂交，将杂交盒切实放平整，防止杂交液四散。（6）洗涤完后，尽快进行扫描，防止荧光淬灭；若扫描的背景信号过强，则说明有可能是芯片洗涤问题，可以更换新的杂交液或者增加杂交后清洗的次数。洗片的强度和时间应保持一致，每次洗片时振摇的速度、幅度尽量保持一致。

（六）探针对模板特异性的检测

按照上述PCR反应条件在相同条件下，按照已筛选好的引物浓度比，用M.tuberculosis、M. bovis、M. avium、M. paratuberculosis和Brucella的引物分别扩增其它四种细菌以及大肠杆菌、葡萄球菌和去离子水，将PCR产物与相对应的芯片进行杂交、扫描，阳性质粒作对照。

（七）实验结果

1. 引物的筛选

M. bovis引物的筛选

以M. bovis基因组核酸为模板，MBF1/MBR1引物对和MBF3/MBR3引物对均能顺利扩增出与预期大小相符的片段，MBF2/MBR2出现非特异性扩增，电泳结果见附图4，附图4中M：DL2000 Marker；1：MBF1/MBR1；2：MBF2/MBR2；3 MBF3/MBR3。

tuberculosis引物的筛选

以M. tuberculosis基因组核酸为模板，MTF1/MTR1引物能够顺利扩增出与预期大小相符的片段，MTF2/MTR2引物对也能扩增目的片段，但扩增效果不理想，条带不够清晰单一，故选取MTF1/MTR1作为扩增M. tuberculosis片段引物，电泳结果见附图5。附图5中，M：DL2000 Marker；1：MTF1/MTR1；2：MTF2/MTR2。

M. avium引物的筛选

以M. avium基因组核酸为模板，MAF1/MAR1和MAF3/MAR3引物对均能顺利扩增出与预期大小相符的片段，MAF2/MAR2引物对未见扩增，电泳结果见附图6，附图6中，M：DL2000 Marker；1：MAF1/MAR1；2：MAF2/MAR2；

3 MAF3/MAR3。选取MAF1/MAR1作为扩增M. avium的引物。

M. paratuberculosis引物的筛选

以M. paratuberculosis基因组核酸为模板，MPF1/MPR1和MPF2/MPR2引物对均能顺利扩增出与预期大小相符的片段，电泳结果见附图7，附图7中M：DL2000 Marker；1：MPF1/MPR1；2：MPF2/MPR2。

Brucella引物的筛选

以Brucella基因组核酸为模板，两对引物均能顺利扩增出与预期大小相符的片段，电泳结果见附图8，附图8中M：DL2000 Marker；1：BF1/BR1；2：BF2/BR2。

根据电泳结果以及寡核苷酸芯片对引物的要求，最终选择MTF1/MTR1、MBF3/MBR3、MAF1/MAR1、MPF1/MPR1、BF2/BR2引物用于扩增M.tuberculosis、M. bovis、M. avium、M. paratuberculosis和Brucella片段。

重组质粒的PCR鉴定

将所选引物的扩增产物克隆进载体pGEM-T后，经PCR鉴定和测序验证，最终获得目的重组质粒，分别命名为pGEM-MT，pGEM-MB，pGEM-MA，pGEM-MP，pGEM-B，鉴定结果见附图9，附图9中M：DL2000 Marker；1：结核分枝杆菌；2：牛分枝杆菌；3：鸟分枝杆菌；4：副结核分枝杆菌；5：布氏杆菌。

3.寡核苷酸探针的筛选与优化

M. tuberculosis寡核苷酸探针的筛选与优化结果

以1×10⁶copies/μL的结核分枝杆菌重组阳性质粒pGEM-MT为模板，采取不对称引物比例法进行PCR，基因芯片杂交结果和荧光信号值统计结果见附图10和附图11。附图10中，1引物浓度1:1 ；2引物浓度5:1；3引物浓度10:1；4引物浓度20:1；附图11中从曲线右端结束点的高低来看，从上至下的曲线分别表示是探针pt1、pt2、pt4、pt3的杂交信号。

MTR1 (荧光标记引物)与MTF1 (非荧光标记引物)引物比例不同时，杂交信号有着明显的差异，引物比例在10：1时荧光信号值明显高于其它组。从附图11可以看出荧光引物与非荧光引物比例在1：1到20：1范围内，随着非荧光引物用量的减少，杂交信号增强；但随着非荧光引物进一步减少时，杂交信号开始减弱。因此，扩增M. tuberculosis MTR2(荧光标记引物)与MTF2(非荧光标记引物)的最适比例为10：1。探针pt1的杂交信号也明显高于pt2，其他两条探针未见杂交信号。

M. bovis寡核苷酸探针的筛选与优化结果

以1×10⁶copies/μL的牛分枝杆菌重组阳性质粒pGEM-MB为模板，采取不对称引物比例法进行PCR，基因芯片杂交结果和荧光信号值统计结果见附图12和附图13。附图12中，1引物浓度1:1 ；2引物浓度5:1；3引物浓度10:1；4引物浓度20:1；附图13中，从曲线右端结束点的高低来看，从上至下的曲线分别表示是是探针pb4、pb3、pb1、pb2的杂交信号。

MBR3 (荧光标记引物)与MBF3(非荧光标记引物)引物比例不同时，杂交信号有着明显的差异，引物比例在5：1时荧光信号值明显高于其它组。实验结果表明荧光引物与非荧光引物比例在1：1到20：1范围内，随着非荧光引物用量的减少，杂交信号增强；因此，扩增M. bovis片段时MBR1 (荧光标记引物)与MBF1(非荧光标记引物)引物的最适比例为5：1。探针pb3在引物浓度比为5:1 的时候，杂交信号也明显高于pb1、pb2。

M. avium寡核苷酸探针的筛选与优化结果

以1×10⁶copies/μL的鸟分枝杆菌重组阳性质粒pGEM-MA为模板，采取不对称引物比例法进行PCR，基因芯片杂交结果和荧光信号值统计结果见附图14和附图15。附图14中，1引物浓度1:1 ；2引物浓度5:1；

3引物浓度10:1；4引物浓度20:1；附图15中，从曲线右端结束点的高低来看，从上至下的曲线分别表示是探针A3、A2、A1的杂交信号。

从附图15可以看出三条探针的杂交信号存在差异，而且当MAR1(荧光标记引物)与MAF1(非荧光标记引物)引物比例不同时，杂交信号也存在差异，当荧光引物与非荧光引物的比值为10：1时，得到的荧光值最高，当荧光引物的浓度再增加时，信号值不再增强，反而下降。因此，扩增鸟分枝杆菌时MAR1(荧光标记引物)与MAF1(非荧光标记引物)的最适比例为10：1。由图可知探针A3杂交信号值最强，选择A3作为检测探针。

M. paratuberculosis寡核苷酸探针的筛选与优化结果

以1×10⁶copies/μL的副结核分枝杆菌重组阳性质粒pGEM-MP为模板，采取不对称引物比例法进行PCR，基因芯片杂交结果和荧光信号值统计结果见附图16和附图17。附图16中，1引物浓度1:1 ；2引物浓度5:1；3引物浓度10:1；4引物浓度20:1；附图17中，从曲线右端结束点的高低来看，从上至下的曲线分别表示是探针P2、P1的杂交信号。

从附图17可以看出MPR1(荧光标记引物)与MPF1(非荧光标记引物)引物比例不同时，杂交信号存在差异，当荧光引物与非荧光引物的比值为10：1时，得到的荧光值最高，当荧光引物的浓度再增加时，信号值不再增强，反而下降。因此，扩增M. paratuberculosis片段时MPR1(荧光标记引物)与MPF1(非荧光标记引物)的最适比例为10：1。从附图17可以看出探针P2在引物浓度比10：1时杂交信号最强。

Brucella寡核苷酸探针的筛选与优化结果

以1×10⁶copies/μL的布氏杆菌重组阳性质粒pGEM-B为模板，采取不对称引物比例法进行PCR，基因芯片杂交结果和荧光信号值统计结果见

附图18和附图19。附图18中，1引物浓度1:1 ；2引物浓度5:1；3引物浓度10:1；4引物浓度20:1；附图19中，从曲线右端结束点的高低来看，从上至下的曲线分别表示是探针B2、B1的杂交信号。

从附图19中可以看出BR2 (荧光标记引物)与BF2 (非荧光标记引物)引物比例不同时，杂交信号存在差异，当荧光引物与非荧光引物的比值为20：1时，得到的荧光值最高。因此，扩增Brucella片段时BR2与BF2的最适比例为20：1。探针B2在引物浓度比为20:1 的时候，杂交信号也明显高于B1。

探针特异性的检测

通过以上芯片实验结果表明，在除对应位置出现阳性信号外，其它探针均没有阳性信号产生，全部为阴性。根据荧光信号强度和与其它探针杂交结果，最终筛选出pt1、pb3、A3、P2和B2 五条特异性探针。

实施例2 应用本发明寡核苷酸芯片检测牛结核及布病（Brucellosis）

试剂： PCR相关试剂购自宝生物（大连）有限公司，SDS、琼脂糖购自Promega公司。

仪器：Sport Array 24基因芯片点样仪（美国Perkin Elmer），Scan array GX基因芯片扫描仪（美国Perkin Elmer），Mai Tai生物芯片杂交仪（SciGene），醛基化基因芯片片基、基因芯片点样液购自北京博奥生物技术有限公司、凝胶成像及分析系统（美国ABI公司），高速冷冻离心机（美国Beckman Allegra）。PCR仪（英国Thermo Hybaid公司），微量可调移液器（德国Eppendorf公司），高压灭菌锅（Sanyo公司），凝胶电泳仪（BIO-RAD公司），1K15台式离心机（Sigma公司）、台式恒温振荡培养箱（德国GFL公司）。

实验所用病毒毒株：结核分枝杆菌M．tuberculosis H37Rv、牛分枝杆菌M. bovis AN5、 M. avium、M. paratuberculosis标准株购自中国兽医药品监察所。大肠杆菌，链球菌，葡萄球菌等均为常规市购菌。

探针、引物的合成及标记：寡核苷酸探针及引物合成和Cy3标记由上海英骏生物技术有限公司完成。

1.牛结核及布病检测用寡核苷酸芯片的制备

参照实施例1探针筛选结果，从备选的13条探针中筛选出5条最佳探针制备奶牛结核及布病寡核苷酸芯片，体系中还有1条阴性探针（大豆Lectin基因，序号K00821.1作为对照，用于监测杂交反应，设置质控列作为检测时位置参见附图20。附图20中，左边为芯片外观，右边为探针微阵列示意图，其中，QC：质控列；T：结核分枝杆菌探针；M：牛分枝杆菌探针；B：布氏杆菌探针；P：副结核分枝杆菌探针；A鸟分枝杆菌探针；Neg：阴性对照。分别用于检测M．tuberculosis、M. bovis、M. avium、M. paratuberculosis和Brucella，具体序列见表3。

表3 检测牛结核及布病的最终探针序列

探针名称	探针序列（5'-3'）	长度(bp)
			pt1	ACGGGTGGCTCAAGTTGGGTCTGGT-NH2-	25
pb3	CGGCGTCATGGACCCTATATCTG-NH2-	23
			A3	TCGAGGGCCAGACCAAGACCAAAC-NH2-	24
P2	GGCGTGGTCGTCTGCTGGGTTGATC-NH2-	24
			B2	AACATTGACCGCATTCATGGGTTTCG-NH2-	26
QC	NH2-(T)25-GCAAGACAAGTGGAAGTGTG-HEX	45
			Neg	AGTACAGTTCTGGGAGTCTCAATCT-NH2-	25

2.多重PCR体系的优化

多重PCR技术的发展，使得同一反应体系检测多个样品得以实现，其操作简便、快速，因此在生物学研究和医学检验领域中得到广泛的应用。但要得到准确可靠的反应结果，需根据不同的模板，摸索最适合的条件，配置出比例适当的PCR反应试剂。参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg²⁺，为PCR反应的五要素，PCR体系中各反应液的量不同，会对扩增有一定的影响。本发明对引物浓度、酶的用量、Mg²⁺浓度、退火温度等重要因素进行了优化。

多重PCR扩增体系的建立

PCR反应体系的基本模式（以25μL总反应体积为例）

PCR反应组分	体积（μL）
		10×PCR Buffer(Mg²⁺ Free)	2.5
上游引物（25uM）	0.5
		下游引物（25uM）	0.5
Mg²⁺(20mM )	2.0
		dNTP(2.5mM)	2.0
模板DNA*	1.0
		Taq DNA聚合酶（2.5U/μL)	0.5
ddH2O	16
		总计	25

*其中模板DNA采用不同浓度的质粒参比品

将上述各组分加入无菌离心管中，混匀，离心，按下列参数进行PCR循环：

Figure 2011101425236100002DEST_PATH_IMAGE006

先按照初步的反应条件进行扩增，再对反应体系的不同组分如非荧光引物浓度和荧光引物浓度比、Mg^2＋浓度、Taq酶用量、退火温度等做进一步的优化。

多重PCR引物用量的优化

为保证各基因的扩增效率相似，合适的引物浓度在多重PCR反应体系中尤为重要。另外，在PCR反应体系中，引物浓度过高可能引发错配，导致非特异性扩增；而引物浓度过低会影响PCR产物的获得率，因此有必要对引物用量进行优化。根据实施例1的实验结果，在分别确定了荧光引物和非荧光引物的比例后，在此基础上对四组引物之间的用量比例进行优化。具体用量见表4。分别以质粒参比品（10⁶copies/μL）为模板，按照上述PCR反应参数进行扩增，扩增产物分别与芯片杂交。

表4 荧光引物/非荧光引物游引物用量（μM/μM）

组别	M.tuberculosis	M.bovis	M.paratuberculosis	M. avium	Brucella
						1	0.5 /0.025	0.5/0.0125	0.5/0.05	1.0/0.1	0.5/0.05
2	0.75/0.0375	0.75/0.01875	0.5/0.05	1.0/0.1	1.0/0.025
						3	1.0/0.05	1.0/0.125	0.75/0.075	2.0/0.2	1.0/0.1
4	1.0/0.05	1.0/0.025	1.0/0.1	2.0/0.2	0.5/0.0125

DNA聚合酶用量的优化

耐热DNA聚合酶的研究近几年来得到长足的发展，这在PCR发展中起到了重要的作用。DNA聚合酶用量也是影响PCR扩增效果的因素之一，浓度过低或者过高均不利于PCR反应。在上述PCR反应基础上，五种菌株上下游引物浓度分别为1.0μM/0.05μM、1.0μM/0.125μM、0.75μM/0.075μM、2.0μM/0.2μM、1.0μM/0.1μM，Taq DNA聚合酶的终浓度分别为0.25U、0.5U、1U、2U、（U：活性单位）进行优化，其他反应条件同上。分别以质粒灵敏度参比品（10⁶copies/μL）为模板，按照上述PCR反应参数进行扩增，扩增产物分别与芯片杂交。

Mg²⁺浓度的优化

在PCR反应体系中，Mg²⁺浓度是一个重要的影响因素，适当的Mg²⁺浓度是保证反应质量的必要条件，Mg²⁺浓度过高又会抑制酶的活性。通过调整Mg²⁺的用量，本发明比较了不同Mg²⁺浓度对基因芯片杂交的影响，使反应体系中Mg²⁺的终浓度分别为2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM，以质粒参比品（10⁶copies/μL）为模板，按照上述PCR反应参数进行扩增，扩增产物分别与芯片杂交。

PCR退火温度的优化

在上述优化的PCR反应条件下，分别选择五对引物Tm值附近的54℃、56℃、58℃、60℃作为优化温度，以质粒比品（10⁶copies/μL）为模板，按照上述PCR反应参数进行扩增，扩增产物分别与芯片杂交。

3.杂交反应体系的建立与优化

杂交温度的优化

杂交温度是直接影响基因芯片杂交信号的重要因素，通过对杂交温度的优化可以更有效的控制基因芯片杂交的严谨性。本发明对杂交温度进行优化，计算探针的Tm值后，分别选取Tm附近的37℃、42℃、55℃、60℃进行杂交，反应条件参照以上优化结果而定。

杂交时间的优化

杂交时间的长短不仅影响基因芯片杂交信号强度，也是能否快速诊断的重要环节，通过对杂交时间的优化可以在最短时间得出最准确的判定结果。本发明对杂交时间进行优化，分别选取30min、45min、60min和90min进行杂交，其它反应条件同上。

4.寡核苷酸芯片检测体系的评价

Cutoff值的确定

Cutoff值是判断基因芯片荧光信号值是否为阳性的标准，本发明在特异性评价的基础上，对探针的cutoff值进行计算和确定。

特异性检测

芯片特异性是所建立的基因芯片方法最重要的因素，本发明为了更好、更全面的评价所研制的基因芯片的特异性，共选取大肠杆菌、链球菌、葡萄球菌以及单纯杂交液对照，按照上述优化好的五重PCR反应参数和杂交条件分别扩增，扩增产物分别与芯片杂交获取数据进行评价。

灵敏度

基于上述得到的每种探针的cutoff值，用两种方法对基因芯片灵敏度进行评价，分别选取四种病毒质粒参比品梯度稀释为10⁶～10¹copies/μL，按照上述优化好的五重PCR反应参数和杂交条件分别扩增、杂交，对每个梯度的荧光信号值进行统计分析，高于对应探针cutoff值的荧光信号值作为阳性杂交反应。

其中：

A单一病毒检测灵敏度

为了评价该基因芯片方法对单一菌株的检测能力，选择牛分枝杆菌为例进行单一菌株检测灵敏度的评价。即在五重PCR反应体系中，以1×10⁶copies/μL的牛分枝杆菌的质粒参比品进行多重PCR扩增和基因芯片杂交。同时以普通PCR进行扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳，比较两种方法的灵敏度。

B五种菌株检测灵敏度

为了评价该基因芯片方法对多种菌株高通量、平行化检测能力，我们同时选取不同浓度的五种菌株质粒参比品进行多重PCR扩增和基因芯片杂交。同时以普通PCR对五种菌株质粒参比品进行多重扩增，1%琼脂糖凝胶电泳，比较两种方法的灵敏度。

5.重复性

选取五病毒10⁶ copies/μL为模板，按照上述优化好的多重PCR反应参数和杂交条件分别扩增后，与基因芯片杂交，对所得荧光信号值进行统计分析，同时设立无模板的阴性对照。实验重复5次，计算片内及片间重复性，从而对本方法检测的重复性进行考核。

6.基因芯片模拟样本的检测

为了评价本方法对现地样本检测的能力，本发明制作了模拟样本进行检测。参照方法（陈茹，2008）的介绍，将标准菌株按照一定比例混入结核阴性牛血液及牛奶样品，参照本章介绍的核算制备方法，提取核酸后进行多重PCR扩增，然后与芯片杂交，检验该方法对模拟样本的检测能力。

实验结果：

1.多重PCR体系的优化

引物用量的优化

基因芯片杂交结果和荧光信号值统计分析结果见附图21。附图21中，上图中a为引物组1优化结果，b为引物组2优化结果，c为引物组3优化结果，d为引物组4优化结果；下图为不同引物浓度杂交信号图。从结果可以看出不同的引物浓度其芯片的杂交信号值差异显著。c组的荧光信号值最强，因此确定五PCR反应体系中各引物对的终浓度分别为：1.0μM/0.05μM、1.0μM/0.025μM、1.0μM/0.1μM、2.0μM/0.2μM、1.0μM/0.1μM。

DNA聚合酶用量优化

基因芯片杂交结果和荧光信号值统计分析结果见附图22。附图22中，上图a: 0.25U; b: 0.5U; c: 1.5U; d: 1.5U；下图为杂交信号统计图。DNA聚合酶的终浓度不同，杂交信号值也有所不同，DNA聚合酶的终浓度在1U时荧光信号值最强，因此，在PCR反应体系中DNA聚合酶的用量为1.0U。

Mg²⁺浓度的优化

基因芯片杂交结果和荧光信号值统计分析结果均见附图23。附图23中，上图中a为Mg²⁺浓度为2.0mM时杂交结果，b为Mg²⁺浓度为2.5mM时杂交结果，c为Mg²⁺浓度为3.0mM时杂交结果，d为Mg²⁺浓度为3.5mM时杂交结果；下图为杂交信号统计图。结果显示当Mg²⁺浓度不同时，基因芯片杂交荧光信号值存在着较大的差异，综合四条探针的荧光信号亮度最终确定Mg²⁺浓度为3mM。

PCR退火温度的优化

基因芯片杂交结果和荧光信号值统计分析结果见附图24。附图24中，上图中a为54℃退火时杂交结果，b为56℃退火时杂交结果，c为58℃退火时杂交结果，d为60℃退火时杂交结果；下图为杂交信号统计图。从图中可以看出当退火温度为56℃时杂交的荧光信号值最强，而其他退火温度得到的PCR产物进行基因芯片杂交得到的荧光信号值均有不同程度的降低；退火温度过高，引物的特异性增强的同时，和模板的结合效率降低。因此，在多重PCR反应中，最终选择56℃作为反应的退火温度。

2.杂交反应体系的建立与优化

杂交温度的优化

基因芯片杂交结果和荧光信号值统计分析结果均见附图25。附图25中，上图中a为37℃杂交结果，b为42℃杂交结果，c为55℃杂交结果，d为60℃杂交结果；下图为杂交信号统计图。在37℃和42℃杂交时，各探针的荧光信号值稍高于以55℃和60℃杂交的信号值。为保证杂交的严谨性和准确性，得到理想的荧光信号值，又能选择合适的温度（温度超过55℃，操作不慎会发生轻微烫伤），因此，本发明选择42℃作为最终的杂交温度。

杂交时间的优化

基因芯片杂交结果和荧光信号值统计分析结果见附图26。附图26中，上图中a为杂交30min结果，b为杂交45min结果，c为杂交60min结果，d为杂交90min结果；下图为杂交信号统计图。从附图26的下图可以看出随着杂交时间的增加，杂交信号值也加大，但当杂交时间达到60min时，杂交信号值变化不大，杂交信号达到饱和。综合考虑快速、准确的要求，在即保证信号强度又能缩短检测时间的前提下，本发明选择60min作为芯片的杂交时间。

4.寡核苷酸芯片检测体系的评价

Cutoff值的确定：通过反复的实验和数据统计，我们确定将阴性对照探针的荧光平均值＋2SD作为每条探针的cutoff值，每条探针的cutoff值见表5所示。

表5五条探针的cutoff值

菌株名称	阴性探针荧光平均值	标准差SD	cutoff 值
				M. tuberculosis	431.37	89.81	614.96
M. bovis	389.79	76.68	543.15
				M. paratuberculosis	667.25	74.37	815.99
M. avium	570.36	86.63	753.62
				Brucella	496.37	79.25	654.87

特异性

基因芯片杂交结果见附图27。附图27中，a: M.tuberculosis； b: M. bovis； c: Brucella； d: M. avium；e: M. paratuberculosis； f: H₂O。从基因芯片杂交结果可以看出，在优化的PCR条件下，五种菌株PCR产物均与芯片上的探针特异性结合。同时该芯片上点制了与动物基因序列无同源性的大豆基因作为阴性对照探针，从结果看出无论任何情况下，这条探针均无荧光信号出现，因此，作为监控由于操作污染等原因造成的假阳性结果出现。上述的结果可以说明本方法具有很好的特异性，可以对五种致病菌进行准确检测。

灵敏度

A 单一菌株灵敏度检测

以牛分枝杆菌毒质粒参比品10⁷ copies/μL，倍比稀释为10⁶，10⁵，10⁴，10³，10²，10¹，10⁰七个梯度，以上述的PCR和基因芯片杂交的条件

进行实验，结果见附图28和附图29，附图28中a-f分别表示10⁷ 、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10² copies/μL；附图29中， M：DL2000 Marker；1-8：10⁷ 、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10² 、10¹、10⁰copies/μL。PCR检测结果表明在10³copies/μL时电泳条带模糊，不能作出准确判断，芯片结果表明在10³copies/μL 时可以看到清晰的荧光信号，在10²copies/μL所得到的杂交信号值低于该探针的cutoff值，因此，该基因芯片体系检测单一病原菌时，检测的灵敏度为10²copies/μL。

B五种菌株灵敏度检测

为了评价该基因芯片方法对五种致病菌高通量、平行化检测能力，我们同时选取五种病原菌进行多重PCR扩增和基因芯片杂交，得到一系列的芯片杂交图和PCR电泳图，分别见附图30和附图31。附图30中，

a-d分别表示10⁷ 、10⁶、10⁵、10⁴ copies/μL；附图31中，M: DL2000 Marker；1-7：10⁷ 、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10² 、10¹ copies/μL。

PCR检测结果表明在10⁵copies/μL时看不到电泳条带，芯片结果是当模板浓度低于10⁵copies/μL时，有些探针信号值也不强，甚至低于cutoff值。当模板浓度高于10⁵copies/μL时，五种病原菌对应的探针均产生阳性信号。因此，可以说明本发明所建立的基因芯片同时检测五种病原菌的灵敏度可达到10⁵copies/μL。

重复性

基因芯片重复性评价统计结果见表6所示。同一芯片上不同探针的不同点的片内重复性CV值均小于15％，不同批次点制的芯片片间重复性结果的CV%值均小于15％，说明本发明建立的奶牛结核及布病检测基因芯片具有良好的重复性。

表6 基因芯片重复性评价统计结果

Figure 2011101425236100002DEST_PATH_IMAGE007

实验结论

三重PCR或超过三重以上PCR进行传染性疾病诊断和其它基因检测过程中，常常存在病原体和其它基因检测灵敏度不高问题，成为限制多重PCR特别是三重以上PCR在临床诊断和其它基因检测的瓶颈。据报道，在分子检测领域，多重PCR中含有的引物对数量越多，检测的灵敏度越低，在之前的研究中最多有四重PCR进行猪病毒病基因芯片的诊断（杨林，2007）。本发明通过对引物不对称比例、引物用量、Mg^2＋浓度、DNA聚合酶用量等重要因素进行优化，获得了很好的效果，成功实现采用五重不对称PCR对奶牛常见的典型两病致病菌的检测提供有效地解决方案。

各类PCR成功的关键在于设计出合适的引物以及确定适宜的引物浓度。最理想的情况是多重反应中所有的引物都能以相同的效率扩增每一类扩增子。引物比例不合适会造成PCR产物得率较低，进而导致杂交信号强度较低。本发明通过上下游引物的不对称比例，使得PCR扩增中产生大量的核苷酸单链，引物之间不对称的比例对基因芯片杂交信号的影响较大，在最佳的比例条件下，产生的单链会更有效的与探针杂交，在确定荧光引物与非荧光引物之间最佳的引物比例的基础上，本发明在探针筛选时引物的比例筛选实验基础上，再进一步结合多重PCR对五对引物的用量进行优化，精确确定五对引物用量为1.0μM/0.05μM、1.0μM/0.125μM、0.75μM/0.075μM、2.0μM/0.2μM、1.0μM/0.1μM时,获得最强杂交信号，PCR扩增效率显著提高。

多重PCR某些片段扩增产量低一直制约着该方法的推广应用，为解决这一问题，本发明改变了聚合酶浓度并延长反应时间。这两种改进均能增加聚合酶延伸每一种引物、模板杂合分子的概率。最适的酶浓度和延伸时间的确定需要综合考虑PCR的总循环数。本发明通过大量试验分析和总结，确定最适宜Taq酶浓度用量为1.0U，检测中1U荧光信号值最高。

在PCR反应体系中，Mg²⁺浓度是一个重要的影响因素，适当的Mg²⁺浓度是保证反应质量的必要条件。Mg²⁺浓度增加能增强Taq酶聚合活性和提高引物与模板的结合效率，从而增加目的产物的产量。但是，同时也会降低引物结合的特异性，使得非目的位点能够和引物结合，造成非特异性片段的生成。过多的Mg²⁺可以稳定DNA双链，阻止DNA完全变性，从而降低PCR产率。过多的Mg²⁺也可稳定产物在不正确模板位点退火，从而降低多重PCR的特异性。另一方面，不足的Mg²⁺可降低多重PCR产物的量。因此Mg²⁺浓度过高或过低都会使PCR反应受到不利的影响。由于Taq DNA聚合酶是Mg²⁺依赖型酶，本发明总结发现优化Mg²⁺是提高多重PCR扩增效率的关键之一。除了Taq DNA聚合酶以外，模板DNA引物和dDNTP都可以与Mg²⁺结合，因此优化Mg²⁺必须综合考虑和分析dNTP浓度、特异的模板DNA和样本缓冲液的组成等因素的影响。本发明总结，多重PCR使用的MgCl₂在3mM时探针的荧光信号最强，芯片检测结果最好。

PCR反应的退火温度是影响PCR扩增的重要因素，退火温度过低会造成大量非特异性扩增，但有利于保证引物的通用性；退火温度过高会减少非特异性结合，但也降低了PCR产物的得率。同时，退火时间较长也会造成非特异性扩增，退火时间过短又会引起扩增不完全。就本发明来说，既要保证引物的扩增的特异性，同时又要保证引物的通用性，为了最大限度的获得PCR产物，在上述优化结果的基础上，对PCR反应的退火温度进行优化，结果显示综合考虑引物通用性和特异性等因素，PCR反应的退火温度为56℃。

杂交过程需要维持一定温度，目前可以通过水浴的方式，也可以采用杂交箱为杂交提供一定的温度，在这个温度下，玻片上的寡核苷酸探针与单链扩增产物退火结合。较低温度下杂交会使得荧光信号值更高，但是会伴有非特异性杂交，特异性降低；较高温度下杂交则会提高结果的特异性，但杂交温度过高探针与目的片段不能很好的结合，会使杂交信号值降低，从而降低了杂交信号及检测的灵敏度。虽然温度的考察似乎可以通过实验中不断重复进行选择，但是将温度因素与整个复杂的反应体系进行综合考虑时，本发明对于杂交温度的总结付出了艰巨而创造性的劳动，本发明分别考察了不同杂交温度对目的片段杂交信号的影响，本发明杂交温度为42℃时，所选探针的信号绝对值较高，而随着温度的升高信号值变化不明显。所以本方法最终确定最佳杂交温度为42℃。

同样，杂交时间的长短对杂交信号也有一定影响，杂交时间过短，芯片上的探针杂交未达到饱和，芯片杂交信号较弱；杂交时间过长，实验周期加长，影响实验进程与效率。根据大量实验结果，选取芯片杂交时间为60min，取得满意效果。

特异性是评价一种检测方法的最基本因素，本发明共选取5种病原菌进行特异性评价，为了保证探针的特异性，运用分析软件进行初筛，然后通过标准菌株对探针进行仔细筛选通过基因芯片杂交结果显示所选探针与所代表的菌株之间的对应关系，除了目的毒株外并无其他非特异性荧光信号出现。从本发明结果可以看出建立的寡核苷酸芯片检测方法能够对所述致病菌的进行特异性诊断。

Cutoff值是判断杂交荧光信号是否为阳性的标准，本发明通过多次重复实验，对阳性荧光信号值、阴性荧光信号值进行统计分析，针对每一条探针确定对应的cutoff值。

为了评价基因芯片检测的灵敏度，选取五种病源菌质粒参比品梯度稀释为10⁷－10¹copies/μL，PCR扩增后与基因芯片杂交，结果显示本方法对于单一病毒的灵敏度为10³copies/μL；同时，本发明对基因芯片检测多种病原混合感染的能力进行评价，结果显示5种病原菌同时存在时，检测的灵敏度可达到10⁵copies/μL。虽然在多种病原同时存在时，基因芯片检测的灵敏度有所下降，但是对于实际应用检测来说，多种病原同时存在的机率较小，本发明所述基因芯片应用于多种病原菌的检测是完全可行的。

基因芯片的重复性是显示该方法是否准确、可靠的标志。重复性受到诸多因素的影响，如基片的制备、芯片储存、洗涤液浓度等。本发明对基因芯片片间和片内重复性进行评价，结果显示片间和片内的CV值均小于15％，说明本发明建立的基因芯片检测所述致病菌芯片方法的重复性和稳定性符合要求。

综上所述，本发明建立了五重PCR反应体系，最佳扩增条件为：5对引物的荧光引物与非荧光引物的最适浓度比例分别为10：1、8：1、10：1、10：1、10：1；终浓度分别为1.0μM/0.1μM、1.0μM/0.125μM、0.75μM/0.075μM、2.0μM/0.2μM、1.0μM/0.1μM；DNA聚合酶的用量为1.0U；Mg²⁺浓度为3.0mM/L，PCR退火温度56℃。确定杂交反应体系最佳杂交条件为：杂交温度为42℃，杂交时间为60min。确定每条探针的cutoff值。当检测单一菌株时，检测的灵敏度可达到10³ copies/μL；假定五种病原菌同时存在时，检测的灵敏度可达到10⁵ copies/μL。

本发明基因芯片检测方法具有良好的重复性，批间批内变异系数CV值均小于15％。对临床模拟样本的检测表现出了高的准确度，表明该方法特异性良好，灵敏度高，实现了高通量、平行化检测，检测结果快速、准确，从核酸制备到完成检测，整个过程仅需6～8h，在制备病原检测、进出口检疫、流行病学分析用试剂和产品等方面具有广阔的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种寡核苷酸基因芯片及其在检测多种病菌方面的应用

<130>

<160> 41

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物MTF1

<400> 1

agggaatgct cggcaacgc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物MTR1

<400> 2

tggtccgctc ggtctgggtt 20

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物MTF2

<400> 3

caacgggtgg ctcaagt 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物MTR2

<400> 4

ctcggtctgg gttttcg 17

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 引物MBF1

<400> 5

tggcgtgccg ttctcgt 17

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物MBR1

<400> 6

gaagcggcgg actaccat 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物MBF2

<400> 7

gaagcggcgg actaccat 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物MBR2

<400> 8

gctgtcaggt ccaccagca 19

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 引物MBF3

<400> 9

ctcagctggt catgttcgcg at 22

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物MBR3

<400> 10

cggtgtgccg gagaagccg 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物MAF1

<400> 11

accgcacctt ccactaccc 19

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物MAR1

<400> 12

gctgacgaaa ccgccttgt 19

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物MAF2

<400> 13

accgcacctt ccactaccc 19

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物MAR2

<400> 14

ctgcacgaac gacttcacct c 21

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物MAF3

<400> 15

cgcggtgatc tcggtcaagg t 21

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物MAR3

<400> 16

cggcagtcgg cgagcttg 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物MPF1

<400> 17

actcgaccgc taattgag 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 引物MPR1

<400> 18

cagcgcggcc tcgtcgtt 18

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物MPF2

<400> 19

cgtctttggc gtcggtcttg c 21

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物MPR2

<400> 20

cgtcgggtat ggctttcatg tgg 23

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 引物BF1

<400> 21

gcgaataaag ccaacacccg 20

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 引物BR1

<400> 22

tgcgagatgg acgaaaccc 19

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物BF2

<400> 23

caacggctca gatcaaggtc aat 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 引物BR2

<400> 24

agcgcatgcg agatggacga aac 23

<210> 25

<211> 27

<212> DNA

<213> 探针pt1

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 25

acgggtggct caagttgggt ctggtnh 27

<210> 26

<211> 27

<212> DNA

<213> 探针pt2

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 26

gggtctggtc gaattcggtg gagtcnh 27

<210> 27

<211> 27

<212> DNA

<213> 探针pt3

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 27

aatcaacttc aattgcgagg tgtggnh 27

<210> 28

<211> 27

<212> DNA

<213> 探针pt4

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 28

cgaaatgaca atgcagggaa cgcganh 27

<210> 29

<211> 28

<212> DNA

<213> 探针pb1

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 29

acatcgaccc gggtgacgac ttctccnh 28

<210> 30

<211> 32

<212> DNA

<213> 探针pb2

<220>

<221> misc_feature

<222> (31)..(31)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 30

aaccaaggac ttccacatcg acccgggtga nh 32

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 探针pb3

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 31

cggcgtcatg gaccctatat ctgnh 25

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 探针pb4

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 32

gctcgctggc ggtaaccggt ggcnh 25

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 探针A1

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 33

accaagacca aactgggcaa caccgnh 27

<210> 34

<211> 27

<212> DNA

<213> 探针A2

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 34

gccagaccaa gaccaaactg ggcaanh 27

<210> 35

<211> 26

<212> DNA

<213> 探针A3

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 35

tcgagggcca gaccaagacc aaacnh 26

<210> 36

<211> 27

<212> DNA

<213> 探针P1

<220>

<221> misc_feature

<222> (26)..(26)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 36

ggcgtggtcg tctgctgggt tgatcnh 27

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 探针P2

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 37

tcggcgtggt cgtctgctgg gttnh 25

<210> 38

<211> 26

<212> DNA

<213> 探针B1

<220>

<221> misc_feature

<222> (25)..(25)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 38

ttgaccgcat tcatgggttt cgtcnh 26

<210> 39

<211> 28

<212> DNA

<213> 探针B2

<220>

<221> misc_feature

<222> (27)..(27)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 39

aacattgacc gcattcatgg gtttcgnh 28

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 质控粒子序列

<400> 40

gcaagacaag tggaagtgtg 20

<210> 41

<211> 25

<212> DNA

<213> 阴性对照

<400> 41

agtacagttc tgggagtctc aatct 25

Claims

1.一种应用于检测样本中多种病菌的寡核苷酸芯片，包括基底和固定于该基底上的探针，其特征在于所述探针可分别与结核分枝杆菌（M．tuberculosis）、牛分枝杆菌（M. bovis）、鸟分枝杆菌（M. avium）、副结核分枝杆菌（M. paratuberculosis）和布氏杆菌（Brucella）的PCR扩增产物进行杂交反应；

所述探针是以Genebank上已公布的M．tuberculosis H37Rv、M. bovis AN5、M. avium、M. paratuberculosis和Brucella五种细菌的基因序列，分别选择M．tuberculosis H37Rv的mpt40基因、M. bovis AN5的pncA基因、M. avian的gyrB基因、M. paratuberculosis的IS-900基因、Brucella的Alkb基因序列为参考序列，设计引物，筛选得到；

所述引物分别具有SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4 ；SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24所示的核苷酸序列；

所述探针分别具有SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：31 、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：39所示的核苷酸序列；

上述引物中所有下游引物在5’端进行Cy3标记；所述探针在3’端进行氨基修饰。

2.一种权利要求1所述基因芯片在检测多种病菌方面的应用，其特征在于包括以下步骤：

（2）基因基片上的探针与待测病菌菌株的PCR扩增产物进行杂交反应；所述待测病菌为结核分枝杆菌（M．tuberculosis）、牛分枝杆菌（M. bovis）、鸟分枝杆菌（M. avium）、副结核分枝杆菌（M. paratuberculosis）和布氏杆菌（Brucella）；

（3）杂交反应后将洗涤干燥后芯片经扫描仪扫描获取杂交信号。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于步骤（2）所述PCR扩增为五重PCR不对称反应体系，扩增条件为：

所述结核分枝杆菌（M．tuberculosis）、牛分枝杆菌（M. bovis）、鸟分枝杆菌（M. avium）、副结核分枝杆菌（M. paratuberculosis）和布氏杆菌（Brucella）引物的荧光引物与非荧光引物的最适浓度比例分别为10：1、8：1、10：1、10：1、10：1；终浓度分别为1.0μM/0.1μM、1.0μM/0.125μM、0.75μM/0.075μM、2.0μM/0.2μM、1.0μM/0.1μM；DNA聚合酶的用量为1.0U；Mg²⁺浓度为3.0mM/L；PCR退火温度56℃。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于步骤（2）所述杂交反应的条件为：杂交温度为42℃，杂交时间为60min。