CN101563455A - 鸟分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用它们检测鸟分枝杆菌的方法 - Google Patents
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Abstract
目的在于提供新的鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)检测用引物以及使用所述引物的简便、迅速且高精确度的鸟分枝杆菌的检测方法，本发明是“含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部或该序列的互补序列的一部分或全部并且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸、含有该寡核苷酸的鸟分枝杆菌检测用引物和探针、使用该引物和/或探针的鸟分枝杆菌的检测方法”的发明。
Description
技术领域
本发明涉及利用核酸扩增和其检测体系，在临床检查中检测、鉴定鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium，以下称为M.avium)的方法。
背景技术
非结核性抗酸菌(nontuberculous mycobacterium)是被分类在分枝杆菌(Mycobacterium，以下有时也单独简写为M.)属的具有抗酸性性质的革兰氏阳性杆菌，是结核菌群和麻疯分枝杆菌(Mycobacterium leprae)以外的一种抗酸菌。喀痰的抗酸菌涂片检查中呈现阳性的病例的15～20％在其后的菌种鉴定检查中被诊断为由于非结核性抗酸菌形成的感染病。
在非结核性抗酸菌中，临床上成为问题的菌种已知有鸟分枝杆菌(M.avium)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare，以下也表示为“M.intracellulare”)、堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)、海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)、戈氏分枝杆菌(Mycobacteriumgordonae)、苏尔加分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)、蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)、偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)、龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)、脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessus)等。
这其中最常见的是鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌。鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌极为相似，难以区分，因此将鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌合起来称作鸟分枝杆菌复合群(Mycobacterium avium complex，MAC)。非结核性抗酸菌症患者大概70％为MAC感染症，其次多的是堪萨斯分枝杆菌症，占20％。而且，其余的10％是由其它菌株导致的感染症。
非结核性抗酸菌一般毒力弱，可以说对健康人无害。但是，偶尔对人也表现出感染性。这其中，已知MAC引起结核后遗症(肺感染症)，对于AIDS等易感染患者引起机会性传染。因此，迅速且正确地检测非结核性抗酸菌在治疗上特别重要。
而且，由于非结核性抗酸菌症近年有增加倾向，因此强烈希望开发出在短时间内鉴别结核菌和非结核性抗酸菌的方法。进一步地，用核酸扩增法检测和诊断鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌的方法已应用于健康保险，即使从这方面出发，其诊断上的意义也较大。
另外，非结核性抗酸菌大多数对抗结核药表现出抗性。因此，当患者存在抗酸菌感染症的嫌疑时，结核症还是非结核性抗酸菌症的鉴别诊断在决定治疗方针上很重要。进一步地，由非结核性抗酸菌引起的疾病因其菌的种类不同，治疗法也各异，所以确定其菌种也非常重要。然而，由于非结核性抗酸菌症没有特异的临床症状，所以根据临床所见、病理组织学所见鉴别结核症和非结核性抗酸菌症，以及进一步确定非结核性抗酸菌的种类极其困难。因此，结核症还是非结核性抗酸菌症的诊断必须通过菌的鉴定进行。
用于诊断非结核性抗酸菌症的一般的菌的鉴定法是喀痰涂片检查。但是，该检查仅判断其病原菌是否是“抗酸菌阳性”，而无法鉴别该病原菌是结核菌还是非结核性抗酸菌。因此，通常，在喀痰涂抹检查中为阳性时，通过在小川培养基等培养基上分离培养菌，进行菌的培养检查，鉴别是结核菌还是非结核性抗酸菌。然后再进行生物化学的试验，鉴定菌种。然而分枝杆菌属发育一般比较慢，例如，只进行菌的分离培养也需要3～4周。而且，要获得用于鉴定菌种的各种生物化学试验的结果，还需要2～3周。因此，进行以往的基本方法即如上的涂片检查和培养检查，获得是否是结核症的诊断结果的方法是需要相当长时间的方法。
另一方面，近年来，已经开发了在基因水平上检测菌的技术。例如，利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction；PCR)等核酸扩增技术的诊断技术作为用于检测菌的有用手段进行了研究。该方法由于灵敏度高，因此只要样品中有几个菌，就可以检测到菌。而且，有在短时间(即使长也只是4天)内能够检测到(可以鉴定菌种)的优点。但是，用通常的PCR法无法判断菌数。而且，无论是活菌还是死菌都同样地检测出来。而且，只要样品中有菌，则无论菌数多少都被判定为阳性。因此，用PCR法对患者的细菌是否存在感染性的诊断变得不确实。加之，PCR法中存在由于灵敏度过高，因此容易出现假阳性的判定等问题。
作为利用PCR法检测鸟分枝杆菌的方法，有使用特异于例如MacSequevar基因区域、鸟分枝杆菌19千道尔顿蛋白质(MAV19 k)基因区域、和胞内分枝杆菌核糖体蛋白质s1基因区域的二个以上区域的寡核苷酸引物的多重引物组，检测MAC核酸的方法(专利文献1)。但是，该检测方法无法判断鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌。而且，专利文献1还公开了只检测鸟分枝杆菌的引物Msqv-Av探针、和特异于鸟分枝杆菌的核酸的引物MAV19K引物。但是，也记载了即使通过使用这些探针和引物的检测方法，也无法根据鸟分枝杆菌的株明确鉴定为鸟分枝杆菌的情况。也就是说，这些探针和引物的鸟分枝杆菌特异性无论如何也无法满足。
而且，已知使用扩增夹着基因插入序列IS901的插入部位的DNA碱基序列的引物进行PCR，根据获得的引物延伸产物的链长，判定是鸟结核菌(鸟分枝杆菌)还是胞内分枝杆菌的方法(专利文献2)。但是，通过使用该引物的PCR，不论样品是鸟结核菌(鸟分枝杆菌)时，还是胞内分枝杆菌时都获得了引物延伸产物，因此该判断方法不能说是特异于鸟分枝杆菌的方法。而且，根据引物延伸产物的链长判断二者这样的方法复杂，存在根据判断者不同而其判定结果不同的情况，不能说是准确的判定方法。
除PCR法之外，还有利用链置换扩增法(SDA法；Strand DisplacementAmplification Method)的检测方法。例如，特开平10-4984号公报(专利文献3)中公开了以编码分枝杆菌α抗原之一部分的BCG85-B基因的63个核苷酸片段作为目标的方法。该方法首先使用扩增鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌这两种菌所具有的BCG85-B基因的目标序列的引物，用SDA法进行核酸扩增反应。然后，基于该结果，检测MAC的方法。也就是说，在该方法中使用的引物是使鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌这两者均扩增的引物。但是，该方法理所当然地在样品中存在鸟分枝杆菌时和存在胞内分枝杆菌时这两种情况下都获得了引物延伸产物。因此，通过该方法可以检测MAC，但无法特异性检测鸟分枝杆菌。而且，即使在检测MAC时，也存在出现假阳性的情况。
特开2001-103986号公报(专利文献4)中公开了用于检测MAC的引物，作为捕捉探针和检测用探针使用的寡核苷酸。然而，该引物扩增鸟型结核菌(鸟分枝杆菌)和胞内分枝杆菌这两种菌所具有的dnaJ基因的48bp目标序列。也就是说，在样品中存在鸟分枝杆菌时、存在胞内分枝杆菌时都发生扩增反应。因此，使用该引物进行SDA法，使用捕捉探针和检测用探针检测引物延伸产物，基于其结果能够进行MAC的检测。但是，无法不检测胞内分枝杆菌而特异性检测鸟分枝杆菌。
此外，还有利用LAMP(环介导的等温扩增，Loop-Mediated IsothermalAmplification)法，来扩增鸟分枝杆菌的核酸的方法(专利文献5)等。但是，LAMP法存在无法获知所扩增的DNA的碱基序列、能够有效扩增的DNA的长度有限，出现假阳性等问题。
而且，鸟分枝杆菌中存在血清型4～6、8～11和21型，胞内分枝杆菌中存在血清型7、12～20、25型这样的多种血清型。因此，难以发现株间的共有序列。因此，现状是只用采用单一的引物组的PCR难以检测所有血清型的鸟分枝杆菌。
根据以上内容，目前的现状是希望建立特异且迅速地检测鸟分枝杆菌的方法。
【专利文献1】特开平11-69999号公报
【专利文献2】特许第3111213号公报
【专利文献3】特开平10-4984号公报
【专利文献4】特开2001-103986号公报
【专利文献5】特开2005-204582号公报
【非专利文献1】F.Poly等人，J.Bacteriology，2004，186(14)，4781-4795页
发明内容
发明要解决的课题
本发明是鉴于上述所述状况形成的发明，目的在于提供排除诊断上假阳性的新的鸟分枝杆菌检测用引物、以及使用该引物的简便、迅速且精确度高的鸟分枝杆菌的检测方法。此外，目的还在于提供通过一次测定就可以特异且有效地检测多个血清型的鸟分枝杆菌的新的鸟分枝杆菌检测用引物，以及使用该引物简便、迅速且高精确度的鸟分枝杆菌的检测方法。
用于解决课题的手段
本发明是以解决上述课题为目的形成的发明，其构成如下。
(1)寡核苷酸，其含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列(其中，A表示腺嘌呤、C表示胞嘧啶、G表示鸟嘌呤、T表示胸腺嘧啶，另外，任意位置的T还可以被替换成尿嘧啶(U)，下同)的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交。
(2)鸟分枝杆菌检测用引物，其含有下述寡核苷酸，所述寡核苷酸含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41和序列号42的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交。
(3)鸟分枝杆菌检测用探针，其含有下述寡核苷酸，所述寡核苷酸含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交。
(4)鸟分枝杆菌的检测方法，其特征在于使用含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸作为引物或/和探针。
(6)鸟分枝杆菌检测用试剂盒，其含有下述寡核苷酸作为引物或/和探针，所述寡核苷酸含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交。
本发明人对于目前已经确定的鸟分枝杆菌和其它生物的各种基因，反复进行了各种间的各基因序列的同源性的理论的验证和实验的验证。其结果是，发现在通过采用微阵列法的方法获得的鸟分枝杆菌来源的碱基序列的片段中，存在与鸟分枝杆菌的基因序列特异性杂交，对鸟分枝杆菌的检测有用的碱基序列。
因此，基于这些见解进一步进行了专心研究，其结果是获得了特异于鸟分枝杆菌的寡核苷酸(序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136表示的碱基序列)，发现这些碱基序列对鸟分枝杆菌的检测有用。而且，还基于这些序列开发了鸟分枝杆菌检测用引物和探针，并最终建立了使用它们进行的鸟分枝杆菌的检测方法。
发明的效果
根据使用本发明的引物或/和探针的鸟分枝杆菌的检测方法，与以往的通过菌的培养检查等鉴定菌种的方法相比，可以极为迅速且高精确度地进行鸟分枝杆菌的检测。而且，通过用本发明的检测方法进行鸟分枝杆菌的检测，与以往的通过使用引物或/和探针的PCR法进行的诊断方法相比，可以排除诊断上的假阳性，可以以更高的精确度且正确地而又特异性地进行鸟分枝杆菌的检测和诊断。而且，通过使用本发明的检测方法，还可以进行鸟分枝杆菌菌体的定量。
另外，若通过使用含有本发明的序列号130～136所示的序列来源的序列、即含有序列号130～205所示的序列的引物或/和探针的鸟分枝杆菌的检测方法，就可以在一次的测定中将多个血清型的鸟分枝杆菌与其他的分枝杆菌属细菌区分，特异地且有效地检测。而且，由此可以获得检测操作变得简单，诊断所需要的时间也缩短这样的效果。
附图的简要说明
【图1】是实施例2获得的、使用引物12Fw_1和引物12Rv_1，使用分枝杆菌属细菌来源的DNA样品和大肠杆菌(Escherichia coli)来源的DNA样品作为模板，以嵌入剂(Intercalater)法获得的实时PCR结果为基础获得的熔解曲线分析的结果。
【图2】表示实施例5获得的实时PCR检测结果，是将Ct值(y轴)相对于各PCR用DNA样品的基因组的拷贝数(x轴，对数值)作图而得的标准曲线。
【图3】是汇总表示实施例6获得的、使用引物12Fw_1和引物12Rv_1，使用鸟分枝杆菌来源的基因组DNA样品作为模板、以嵌入剂法获得的实时PCR结果为基础获得的熔解曲线分析的结果，与比较例1获得的、使用引物MAV19K_F1s和引物MAV19K_Rvs、使用鸟分枝杆菌来源的基因组DNA样品作为模板、以嵌入剂法获得的实时PCR结果为基础获得的扩增曲线的图。
【图4】是实施例8获得的，使用引物Mac_12Fw01和引物Mac_12Rv01，使用各种鸟分枝杆菌菌株来源的DNA样品、M.chimaea来源的DNA样品和M.velatum来源的DNA样品作为模板，以嵌入剂法获得的实时PCR结果为基础获得的熔解曲线分析的结果。
【图5】是实施例10获得的、使用引物Mac_12Fw01和引物Mac_12Rv01、使用分枝杆菌属细菌来源的DNA样品和大肠杆菌来源的DNA样品作为模板、以嵌入剂法获得的实时PCR结果为基础获得的熔解曲线分析的结果。
【图6】是实施例12获得的、使用引物Mac_12Fw01和引物Mac_12Rv01、使用鸟分枝杆菌来源的基因组DNA样品作为模板、以嵌入剂法获得的实时PCR结果为基础获得的熔解曲线分析的结果。
【图7】表示实施例12获得的实时PCR检测结果，是将Ct值(y轴)相对于各PCR用DNA样品的基因组的拷贝数(x轴，对数值)作图而得的标准曲线。
符号说明
图3中的各记号分别表示以下情况的结果。
(1)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为105个拷贝，进行以新的候选序列13作为目标的实时PCR的情况。
(2)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为104个拷贝，进行以新的候选序列13作为目标的实时PCR的情况。
(3)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为103个拷贝，进行以新的候选序列13作为目标的实时PCR的情况。
(4)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为102个拷贝，进行以新的候选序列13作为目标的实时PCR的情况。
(5)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为10个拷贝，进行以新的候选序列13作为目标的实时PCR的情况。
(6)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为0个拷贝，进行以新的候选序列13作为目标的实时PCR的情况。
图3中(7)～(12)分别表示以下情况。
(7)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为105个拷贝，进行以鸟分枝杆菌的19千道尔顿蛋白质基因区域作为目标的实时PCR的情况。
(8)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为104个拷贝，进行以鸟分枝杆菌的19千道尔顿蛋白质基因区域作为目标的实时PCR的情况。
(9)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为103个拷贝，进行以鸟分枝杆菌的19千道尔顿蛋白质基因区域作为目标的实时PCR的情况。
(10)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为102个拷贝，进行以鸟分枝杆菌的19千道尔顿蛋白质基因区域作为目标的实时PCR的情况。
(11)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为10个拷贝，进行以鸟分枝杆菌的19千道尔顿蛋白质基因区域作为目标的实时PCR的情况。
(12)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为0个拷贝，进行以鸟分枝杆菌的19千道尔顿蛋白质基因区域作为目标的实时PCR的情况。
用于实施发明的最佳方式
本发明中鸟分枝杆菌基因是指鸟分枝杆菌所具有的全基因组序列中的任意的碱基序列单元(区域)。
作为本发明所涉及的寡核苷酸，可以例举含有选自序列表的序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列(其中，A表示腺嘌呤、C表示胞嘧啶、G表示鸟嘌呤、T表示胸腺嘧啶，另外，任意位置的T还可以被替换成尿嘧啶(U)，下同)的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸(以下有时略记为本发明的寡核苷酸)。
本发明涉及的序列号1所示的碱基序列的寡核苷酸大小为981个碱基、序列号2所示的碱基序列的寡核苷酸大小为326个碱基、序列号3所示的碱基序列的寡核苷酸大小为503个碱基、序列号4所示的碱基序列的寡核苷酸大小为587个碱基、序列号5所示的碱基序列的寡核苷酸大小为622个碱基。
而且，序列号37所示的碱基序列的寡核苷酸大小为1020个碱基，序列号38所示的碱基序列的寡核苷酸大小为959个碱基，序列号39所示的碱基序列的寡核苷酸大小为896个碱基，序列号40所示的碱基序列的寡核苷酸大小为744个碱基，序列号41所示的碱基序列的寡核苷酸大小为790个碱基，序列号42所示的碱基序列的寡核苷酸大小为569个碱基。
而且，序列号130所示的碱基序列的寡核苷酸大小为833个碱基、序列号131所示的碱基序列的寡核苷酸大小为955个碱基、序列号132所示的碱基序列的寡核苷酸大小为810个碱基、序列号133所示的碱基序列的寡核苷酸大小为872个碱基、序列号134所示的碱基序列的寡核苷酸大小为933个碱基、序列号135所示的碱基序列的寡核苷酸大小为630个碱基，以及序列号136所示的碱基序列的寡核苷酸大小为1085个碱基。
作为本发明涉及的含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸，可以例举，例如(1)含有与选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列具有约70％以上、优选约80％以上、更优选约90％以上、更优选约95％以上的同源性的碱基序列的寡核苷酸，或(2)特征在于含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列中的连续的10个碱基以上、优选15个碱基以上、更优选20个碱基以上的寡核苷酸等。
作为本发明涉及的含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的全部的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如，由选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列组成的寡核苷酸，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的寡核苷酸。
优选地，可以例举由选自序列号130～136的碱基序列组成的寡核苷酸，或含有选自序列号130～136的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分的寡核苷酸的优选例子，可以例举含有选自序列号130～136的碱基序列的一部分的寡核苷酸。
作为含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号6～32、序列号43～129、和序列号137～205的碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。
优选地，可以例举含有选自序列号137～205的碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。
而且，优选含有选自序列号6～32、序列号43～129、和序列号137～205的碱基序列中的连续的10个碱基以上、优选15个碱基以上的寡核苷酸等。
作为含有选自序列号6～32、序列号43～129、和序列号137～205的碱基序列的全部的寡核苷酸的具体例子，可以例举由选自序列号6～32、序列号43～129、和序列号137～205的碱基序列组成的寡核苷酸，或含有选自序列号6～32、序列号43～129、和序列号137～205的碱基序列的寡核苷酸。
作为其优选的具体例子，可以例举由选自序列号137～205的碱基序列组成的寡核苷酸、或含有选自序列号137～205的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号1所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号6～9和序列号24～25的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号2所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举含有选自序列号10～11和序列号26的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号3所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号12～13和序列号27的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号4所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号14～21和序列号28～31的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号5所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号22～23和序列号32的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号37所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号43～54和序列号101～106的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号38所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举含有选自序列号55～66和序列号107～112的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号39所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号67～74和序列号113～116的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号40所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号75～82和序列号117～120的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号41所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号83～92和序列号121～125的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号42所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号93～100和序列号126～129的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号130所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号137～144和序列号183～186的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号131所示的碱基序列的一部的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号145～148和序列号187～188的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号132所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号149～158和序列号189～193的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号133所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号159～164和序列号194～196的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号134所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号165～170和序列号197～199的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号135所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号171～174和序列号200～201的碱基序列的寡核苷酸。
作为含有序列号136所示碱基序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号175～182和序列号202～205的碱基序列的寡核苷酸。
作为本发明中涉及的含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部的寡核苷酸，可以例举例如含有与本发明的由选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列组成的寡核苷酸杂交的碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸等。
上述的所谓本发明的具有与由选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列组成的寡核苷酸杂交的碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸，具体可以例举，本发明的含有与选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列组成的寡核苷酸在高严格条件或严格条件下杂交的碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸等。
而且，这里所谓的“高严格条件”，具体是，例如“50％甲酰胺中在42～70℃、优选60～70℃进行杂交，然后于0.2～2×SSC、0.1％十二烷基硫酸钠(SDS)中、在25～70℃清洗”这样的条件。
而且，所谓“严格条件”，具体是指例如“在6×SSC或与它同等盐浓度的杂交溶液中，于50～70℃温度条件下杂交16小时，用6×SSC或与它同等的盐浓度的溶液等根据需要进行预清洗后，用1×SSC或与它同等的盐浓度的溶液等清洗”这样的条件。
作为本发明涉及的含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部的寡核苷酸，可以例举例如，
(1)含有与选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列具有约70％以上、优选约80％以上、更优选约90％以上、更优选约95％以上的同源性的碱基序列的寡核苷酸，或
(2)特征在于含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列中的连续的10个碱基以上、优选15个碱基以上、更优选20个碱基以上的寡核苷酸等。
作为本发明涉及的含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的全部的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如，由选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列组成的寡核苷酸，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的寡核苷酸。
优选地，可以例举由选自序列号130～136的碱基序列的互补序列组成的寡核苷酸，或含有选自序列号130～序列号136的碱基序列的互补序列的寡核苷酸。
作为含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分的寡核苷酸的优选例子，可以例举含有选自序列号130～136的碱基序列的互补序列的一部分的寡核苷酸。
作为含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分的寡核苷酸的具体例子，可以例举例如含有选自序列号6～32、序列号43～129、和序列号137～205的碱基序列的互补序列的一部分或全部的寡核苷酸。
优选地，可以例举含有选自序列号137～205的碱基序列的互补序列的一部分或全部的寡核苷酸。
而且，优选含有选自序列号6～32、序列号43～129、和序列号137～205的碱基序列的互补序列中连续的10个碱基以上、优选15个碱基以上的寡核苷酸。
作为含有选自序列号6～32、序列号43～129、和序列号137～205的碱基序列的互补序列的全部的寡核苷酸的具体例子，可以例举，例如由选自序列号6～32、序列号43～129、和序列号137～205的碱基序列的互补序列组成的寡核苷酸，或含有选自序列号6～32、序列号43～129、和序列号137～205的碱基序列的互补序列的寡核苷酸。
作为其优选的具体例子，可以例举由选自序列号137～205的碱基序列的互补序列组成的寡核苷酸，或含有选自序列号137～205的碱基序列的互补序列的寡核苷酸。
所谓本发明涉及的与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸，可以例举具有与鸟分枝杆菌基因的碱基序列在高严格条件或严格条件下杂交的碱基序列的寡核苷酸等。所述高严格条件和严格条件如上所述。
另外，本发明的寡核苷酸既可以是脱氧核糖核酸(DNA)，也可以是核糖核酸(RNA)。当为核糖核酸时，将胸苷残基(T)替换为尿苷残基(U)是不言而喻的。另外也可以是在合成时将任意位置的T变成U进行合成而得的含有尿苷残基的DNA。同样也可以是将任意位置的U变为T的含有胸苷残基的RNA。另外，还可以是1个或者多个核苷酸缺失、插入或被置换的寡核苷酸。也可以1个或者多个核苷酸是像次黄苷(I)那样的修饰核苷酸。
作为获得本发明的寡核苷酸的方法，没有特别的限定，可以例举例如使用自身公知的化学合成法制备的方法。该方法与通过使用载体等的基因操作法来获得寡核苷酸或多核苷酸的方法(克隆法)相比，可以容易、大量且便宜地获得一定品质的寡核苷酸。
例如在DNA合成中通常进行的，只要使用DNA合成仪，用通常的亚磷酰胺法合成寡核苷酸，通过使用阴离子交换柱层析的常规方法进行纯化，就可以得到作为目标的本发明的寡核苷酸。
另外，可以将寡核苷酸的合成委托商家，从商家购买。
作为寻找(筛选)能完成本发明的目标的寡核苷酸的方法，有在FEMSMicrobiology Letters 166：63-70，1998或者Systematic and AppliedMicrobiology 24：109-112，2001等中所显示的扣除法，即从作为目标的基因组DNA来源的DNA片段群中，除去与来自想要区别的生物种的基因组DNA的DNA片段群反应的片段，从而浓缩候选序列的方法，等等。
另外，人们还考虑了通过从作为目标的基因组DNA和来自想要区别的生物种的基因组DNA制成扩增产物的差异显示这样的方法，即利用随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)的方法(特愿平11-155589号公报)。
进而，通过使用被称为所谓微阵列法的方法，也可以寻找能完成本发明的目标的寡核苷酸，并可以得到本发明的寡核苷酸。该方法的概略如下。
即，例如制成来自鸟分枝杆菌基因组的DNA的鸟枪法克隆，从得到的鸟枪法克隆中纯化DNA。接着，用PCR等扩增这些来自鸟枪法克隆的纯化DNA，然后配置在载玻片上，并通过常规方法制成微阵列。另外，将作为目标的来自鸟分枝杆菌的基因组DNA制成荧光标记(标记1)的DNA片段群。另一方面，将来自要区别的生物种的基因组DNA片段另外制成荧光标记(标记2)的DNA片段群。然后，通过在同一反应体系分别使用标记1和标记2进行竞争杂交法，从而检测微阵列上的纯化DNA与标记1和标记2的反应性(结合性)。通过该检测，可以选定与作为目标的鸟分枝杆菌的基因组DNA来源的片段群(标记1)更特异性地反应的序列候选群(参照例如非专利文献1等的记载)。
通过以上的方法，可以选择与作为目标的鸟分枝杆菌基因的碱基序列特异性杂交的寡核苷酸。以下就使用微阵列法的本发明的寡核苷酸的选定方法的一个例子进行详细说明。
(1)鸟分枝杆菌来源的纯化基因组DNA的制备
首先，获得鸟分枝杆菌来源的纯化基因组DNA。例如，可以购买市售的鸟分枝杆菌来源的基因组DNA，可以通过常规方法从鸟分枝杆菌菌株中提取、纯化DNA。而且，还可以委托商家从鸟分枝杆菌菌株中提取、纯化基因组DNA，来获得该基因组DNA。
作为市售的鸟分枝杆菌来源的纯化基因组DNA，有例如鸟分枝杆菌来源的基因组DNA(Mycos Research公司(美国)制)等。
市售的鸟分枝杆菌的纯化DNA可以直接使用，也可以使用市售的试剂盒等进行通常的核酸扩增反应，再使用获得的扩增产物。
为了从鸟分枝杆菌菌株中获得纯化基因组DNA，可以将鸟分枝杆菌菌株使用常规方法(例如高压蒸气灭菌处理和使用玻璃珠等将菌体进行破碎处理方法)进行破碎处理后，按照常规方法，进行DNA的提取、纯化。
(2)全基因组鸟枪法文库(Whole Genome Shotgun library)的制作
作为进行鸟分枝杆菌的全基因组鸟枪法文库的制作的方法的一个例子，以下说明对Venter等人，Science.2001年2月16日；291(5507)：1304-1351中记载的全基因组鸟枪法进行了改变的方法。
首先，将上述(1)获得的鸟分枝杆菌来源的纯化基因组DNA用适当的缓冲液等稀释后，例如在终浓度为20％的甘油存在下，在5kPa～9kPa的压力下，用雾化器处理约1～15分钟，进行DNA的片段化处理。通过这样的处理，可以有效回收500～1000bp大小的目标组分(DNA片段)。将得到的组分利用市售的提取柱进行纯化。
然后将得到的组分(DNA片段，含有目的DNA片段)按照常规方法通过连接整合到载体DNA中，得到重组DNA(鸟分枝杆菌的全基因组鸟枪法文库)。
作为用于上述操作的载体DNA，当之后转化的宿主细胞为大肠杆菌时，为例如pBS[例如pBSII sk+载体(Stratagene公司)]、pQE-TRI质粒(Qiagen公司生产)、pBluescript、pET、pGEM-3Z、pGEX等载体。根据所使用的载体种类不同，可以在连接之前，预先将DNA片段用DNA聚合酶处理，将DNA片段的末端进行平端化处理。
然后，用得到的重组DNA转化适当的宿主细胞，从而得到转化体。
作为用于上述操作的宿主细胞，可列举例如大肠杆菌(Escherichia.coli)，优选JM109、DH5α、TOP10等。此外，还可使用质粒、噬菌体DNA的导入效率更高的感受态细胞(Competent Cell)。可列举例如大肠杆菌JM109感受态细胞(TakaraBio公司生产)等。
宿主细胞的转化可以根据例如D.M.Morrison的方法(Method inEnzymology，68，326-331，1979)等进行。而当使用市售的感受态细胞时，可以根据该制品的说明书进行转化。
作为选择导入了“整合了目的DNA片段的重组DNA”的转化体的方法，有例如利用用于转化的载体的性质的方法。例如，在使用含有氨苄青霉素抗性基因的载体的情况下，通过在含有氨苄青霉素的培养基上培养转化体，并对得到的克隆进行选择，可以容易地获得导入整合了目标DNA片段的重组DNA的转化体(鸟分枝杆菌的基因组DNA来源的全基因组鸟枪法克隆文库)。
(3)微阵列制作
接下来用下述方法制作微阵列。
即，根据常规方法从上述(2)得到的转化体的文库(鸟分枝杆菌的基因组DNA来源的全基因组鸟枪法克隆文库)中纯化DNA。使用纯化的DNA作为模板，使用适当的引物[市售的引物也可以，例如M13 Primer M1(タカラバイオ社制造)和引物M13 Primer RV(タカラバイオ社制造)等]，按照常规方法进行PCR后，纯化获得的PCR扩增产物。然后根据常规方法将纯化的PCR扩增产物点印到微阵列用载玻片上。然后对该载玻片进行UV照射(60mJ～300mJ/cm2)，将PCR扩增产物(含有来自鸟分枝杆菌的目标基因组DNA)固定在载玻片上，做成微阵列。
此外，为了选择所得的微阵列上的含有与鸟分枝杆菌基因的碱基序列特异性杂交的DNA片段的斑点，根据需要，还可以使对照样品并列地固定化于上述微阵列上。
例如，使用想要区别的生物种来源的基因组DNA片段[例如rpsl(专利文献1)等胞内分枝杆菌所具有的序列的DNA片段、KATS2序列(特开平11-155589号公报)等堪萨斯分枝杆菌中特异的碱基序列的DNA片段、例如大肠杆菌DNA等分枝杆菌属菌以外的菌来源的DNA]、作为用于比较、评价特异性的指标的公知的DNA片段[例如MAV19K(专利文献1)等鸟分枝杆菌所具有的公知的碱基序列的DNA片段]，使之与上述载玻片上的鸟枪法克隆来源的PCR产物并列固定。通过使用该公知DNA片段作为对照斑点，可以选择与鸟分枝杆菌基因的碱基序列特异性杂交的DNA片段的斑点，从而提高检测的精确度。
(4)目标基因组DNA的荧光色素标记
i)目标基因组DNA的荧光色素标记
例如，通过使用己氨基-UTP的间接标记法等常规方法，用标记物质标记例如用上述(1)的方法获得的鸟分枝杆菌来源的纯化基因组DNA。而且，用与标记上述鸟分枝杆菌来源的纯化基因组DNA的标记物质不同的标记物质标记对照用基因组(例如胞内分枝杆菌等非结核型抗酸菌、牛型结核菌等结核菌等)DNA。
作为上述DNA的标记使用的标记物质，可以例举通常在该领域中使用的标记物质，作为广泛使用的标记物质，可以例举Cy3(AmershamBioscience有限公司商品名)、Cy5(Amersham Bioscience有限公司商品名)、Alexa555(Invitrogen公司商品名)、Alexa647(Invitrogen公司商品名)等。
例如通过对DeRisi研究室(www.microarrays.org)发表的方法进行改变的间接标记法、使用Cy3和Cy5作为标记物质的标记方法为例进行说明。该方法首先进行酶延伸反应，制成分子内掺入了带有氨基的αUTP的DNA链。然后通过使荧光色素(琥珀酰亚胺体)化学键合在该DNA链的氨基上，标记DNA。
也就是说，首先对起始材料(鸟分枝杆菌来源的基因组DNA和对照用基因组DNA)按照常规方法进行热变性处理[可以使用BioPrime DNAlabeling system(Invitrogen公司制)等市售试剂盒]。然后向热变性处理物中添加DTT 2μl、dATP/dCTP/dGTP的混合液、dTTP、Ha-dUTP、克列诺酶，于37℃进行3小时左右的延伸反应。将得到的反应产物装到超滤柱中，以14000转/分钟离心4分钟左右后，将浓缩液回收到微管中，用真空干燥离心机等使其完全干燥。然后向干燥的上述反应产物中加NaHCO3，混合后常温下静置2～3分钟。
另外，制备将Cy3(或Cy5)溶于DMSO中的溶液(Cy-染色溶液Cy3、Cy-染色溶液Cy5)。将该Cy-染色溶液Cy3加到使用对照用基因组来源的DNA得到的上述反应产物中。另外，将Cy-染色溶液Cy5加到使用鸟分枝杆菌来源的基因组DNA得到的上述反应产物中。将各反应产物于40℃避光下温育60分钟左右。再分别向各个反应产物中加4M NH2OH，搅拌后通过避光下温育15分钟左右，得到各个基因组来源的DNA的标记产物。然后将得到的标记产物加到超滤柱中，于14000转/分钟离心4分钟左右后，将浓缩液回收到微管中，用真空干燥离心机使其完全干燥。
ii)标记产物的片段化工序
制备0.04M Tris-醋酸(pH8.1)、0.1M醋酸钾、0.03M醋酸镁四水合物组成的溶液，加入上述(4)i)获得的干燥状态的各基因组来源的DNA的标记产物中。然后使干燥状态的基因组来源的DNA的标记产物悬浮混合到该溶液中。于94℃加热处理15分钟左右，可得到100个碱基～300个碱基的各基因组来源的DNA的标记产物的片段化生成物(Cy3标记产物、Cy5标记产物)。
将得到的Cy3标记产物和Cy5标记产物分别加到超滤柱中，于14000转/分钟离心4分钟左右后，将浓缩液回收到微管中，用真空干燥离心机等使其完全干燥。
然后在该微管中加入用含有鲑鱼精DNA(10mg/mL)、甲酰胺，并用ArrayHyb杂交缓冲液(SIGMA社制)将总量调整到40～50μl的试剂溶液(是后面使用的微阵列的盖玻片尺寸为24×55mm时的组成)，将上述得到的干燥物在同一溶液中悬浮混合后，于95℃温育5分钟，制备Cy3Cy5标记产物混合溶液(鸟分枝杆菌来源的基因组DNA的Cy5标记产物的片段化生成物与胞内分枝杆菌来源的基因组DNA的Cy3标记产物的片段化生成物的混合溶液)。然后在用于接下来的(5)的微阵列杂交之前保存在70℃。
(5)微阵列杂交(在阵列上的DNA-DNA杂交)
然后，通过常规方法对鸟分枝杆菌来源的基因组DNA的全基因组鸟枪法克隆的微阵列进行Cy3Cy5标记产物的杂交。
例如，将上述(4)ii)制备的Cy3Cy5标记产物混合溶液加到上述(3)的工序获得的鸟分枝杆菌来源的基因组的全基因组鸟枪法克隆的微阵列上，盖上盖玻片。将它装到杂交盒中后，于65℃避光下使之反应8小时以上，进行杂交。杂交后，通过于室温将微阵列连同盖玻片一起浸入到2×SSC-0.1％SDS溶液中，取下盖玻片。用1×SSC、0.03％SDS溶液(60℃)清洗10分钟，用0.2×SSC溶液(42℃)清洗10分钟，用0.05×SSC溶液(室温)清洗约10分钟后，于800转/分钟离心约5分钟使其干燥。
(6)荧光强度的测定；从信号检测至量化
使用荧光解读扫描仪，测定上述(5)获得的经微阵列杂交处理的微阵列上的荧光强度。此时，测定在Cy3和Cy5的2信道的荧光强度，得到荧光检测数据。为了进行荧光信号的量化，可以使用市售的DNA芯片表达图像分析软件。而且按照软件的操作步骤，可进行斑点自动识别、背景计算、荧光强度比的标准化。
杂交中使用的Cy5标记产物是将鸟分枝杆菌来源的基因组DNA进行标记而得的DNA片段群，Cy3标记产物是将对照用基因组DNA进行标记而得的DNA片段群。因此，测定微阵列上的某个斑点的Cy3和Cy5的各自的荧光强度，其结果是，Cy5与Cy3的荧光强度比高时，表示该斑点的DNA片段(PCR产物)与Cy5标记产物、即鸟分枝杆菌来源的基因组DNA更强杂交。而且，可判断为该DNA片段(PCR产物)对鸟分枝杆菌的特异性高。
另一方面，测定某个斑点的Cy3和Cy5的各自的荧光强度的结果是，Cy5与Cy3的荧光强度比低时，表示观察到了该斑点的DNA片段(PCR产物)与Cy3标记产物、即对照用基因组DNA的交叉反应。在这种情况、和Cy3与Cy5的荧光强度相当的情况、以及Cy3和Cy5中的任一者的荧光均未被检测到的情况下，判断为该斑点的DNA片段(PCR产物)对鸟分枝杆菌的特异性低。
因此，基于例如微阵列上检测到的Cy3/Cy5的荧光强度比(Ratio)，例如通过制成散点图(Scatter plot)等，来分析结果。并且进行特异于鸟分枝杆菌的序列的筛选。
从进行了筛选的候选中，选择根据Cy3/Cy5荧光强度比的数值分析的结果得到的显著的鸟分枝杆菌特异的信号(Cy5的荧光强度强时)的斑点(克隆)。
此外，在微阵列上点加有如上所述的阳性对照和阴性对照时，测定各对照的Cy3Cy5荧光强度。并且，如果观察其荧光强度的倾向，可以更正确地选择目的斑点。
例如，从进行了筛选的候选中，选择根据Cy3/Cy5荧光强度比的数值分析的结果得到的显著的鸟分枝杆菌特异的信号(Cy5的荧光强度强时)、且比值比上述的鸟分枝杆菌的阳性对照的斑点大(Cy5的荧光强度强)的斑点(克隆)。
然后，可以利用通常本领域中使用的测序仪等仪器，按照常规方法测定获得的候选克隆的碱基序列。
作为本发明涉及的鸟分枝杆菌检测用引物，可以例举含有下述寡核苷酸的引物(以下有时记为本发明的引物)，所述寡核苷酸含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交。
另外，本发明的引物在符合PCR(包括实时PCR)等核酸扩增反应、核酸杂交等条件下，可以考虑解离温度(Tm值)等，从含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或从含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部的寡核苷酸中，选择适当区域的适当长度进行设计。
优选列举具有10～50碱基的长度的寡核苷酸，该长度被认为是为了维持作为引物序列的特异性而必需的碱基数，更优选具有10～35碱基长度的寡核苷酸，进一步优选具有18～25碱基的长度的寡核苷酸。
为了设计引物，可以使用引物设计一般使用的软件，例如引物设计用的Web tool Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)等。
可用于本发明的引物的，含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41和序列号42的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸(本发明的寡核苷酸)的具体例子，与上述本发明的寡核苷酸的说明中所述相同。
作为本发明的引物的具体例子，可以例举例如含有下述寡核苷酸的引物，所述寡核苷酸含有选自序列号6～32、序列号43～129和序列号137～205的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号6～32、序列号43～129和序列号137～205中碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交。
作为优选的引物，可以例举含有选自序列号6～23、序列号43～100、和序列号137～182的碱基序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸，或含有选自序列号6～23、序列号43～100、和序列号137～182的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸。
作为更优选的引物，可以例举含有选自序列号6、7、10～17、22、23、57～72、75～94、137～205的碱基序列的一部分或全部的引物，或含有选自序列号6、7、10～17、22、23、57～72、75～94、137～205的碱基序列的互补序列的一部分或全部的引物。
作为进一步优选的引物，可以例举含有选自序列号6、7、10～17、22、23、59～72、75～78、81～94、137～205的碱基序列的一部分或全部的引物，或含有选自序列号6、7、10～17、22、23、59～72、75～78、81～94、137～205的碱基序列的互补序列的一部分或全部的引物。
另外，作为进一步优选的引物，可以例举含有选自序列号137～205的碱基序列的一部分或全部的引物、或含有选自序列号137～205的碱基序列的互补序列的一部分或全部的引物。这其中，可例举含有选自序列号137～182的碱基序列的引物、或含有选自序列号137～182的碱基序列的互补序列的引物。
另外，含有序列号6～9所示的碱基序列的引物是基于序列号1所示的碱基序列而设计的。
含有序列号10～11所示的碱基序列的引物是基于序列号2所示的碱基序列而设计的。
含有序列号12～13所示的碱基序列的引物是基于序列号3所示的碱基序列而设计的。
含有序列号14～21所示的碱基序列的引物是基于序列号4所示的碱基序列而设计的。
含有序列号22～23所示的碱基序列的引物是基于序列号5所示的碱基序列而设计的。
含有序列号43～54所示的碱基序列的引物是基于序列号37所示的碱基序列而设计的。
含有序列号55～66所示的碱基序列的引物是基于序列号38所示的碱基序列而设计的。
含有序列号67～74所示的碱基序列的引物是基于序列号39所示的碱基序列而设计的。
含有序列号75～82所示的碱基序列的引物是基于序列号40所示的碱基序列而设计的。
含有序列号83～92所示的碱基序列的引物是基于序列号41所示的碱基序列而设计的。
含有序列号93～100所示的碱基序列的引物是基于序列号42所示的碱基序列而设计的。
含有序列号137～144所示的碱基序列的引物是基于序列号130所示的碱基序列而设计的。
含有序列号145～148所示的碱基序列的引物是基于序列号131所示的碱基序列而设计的。
含有序列号149～158所示的碱基序列的引物是基于序列号132所示的碱基序列而设计的。
含有序列号159～164所示的碱基序列的引物是基于序列号133所示的碱基序列而设计的。
含有序列号165～170所示的碱基序列的引物是基于序列号134所示的碱基序列而设计的。
含有序列号171～174所示的碱基序列的引物是基于序列号135所示的碱基序列而设计的。
含有序列号175～182所示的碱基序列的引物是基于序列号136所示的碱基序列而设计的。
另外，序列号1所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号6～9所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号6(003Fw_1)：804位～823位、
序列号7(003Rv_1)：707位～725位、
序列号8(003Fw_2)：20位～37位、
序列号9(003Rv_2)：136位～153位。
序列号2所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号10～11所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号10(007Fw_1)：3位～21位、
序列号11(007Rv_1)：122位～139位。
序列号3所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号12～13所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号12(11Fw_1)：481位～500位、
序列号13(11Rv_1)：346位～366位。
序列号4所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号14～21所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号14(12Fw_1)：12位～32位、
序列号15(12Rv_1)：143位～161位、
序列号16(12Fw_4)：126位～145位、
序列号17(12Rv_4)：287位～308位、
序列号18(12Fw_2)：448位～465位、
序列号19(12Rv_2)：559位～579位、
序列号20(12Fw_3)：293位～312位、
序列号21(12Rv_3)：452位～472位。
序列号5所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号22～23所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号22(04Fw_1)：574位～594位、
序列号23(04Rv_1)：397位～417位。
序列号37所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号43～54所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号43(RE01Fw_01)：765位～783位、
序列号44(RE01Rv_01)：891位～910位、
序列号45(RE01FW_02)：813位～830位、
序列号46(RE01Rv_02)：961位～978位、
序列号47(RE01Fw_03)：204位～221位、
序列号48(RE01Rv_03)：386位～403位、
序列号49(RE01Fw_04)：68位～87位、
序列号50(RE01Rv_04)：190位～207位、
序列号51(RE01Fw_05)：386位～403位、
序列号52(RE01Rv_05)：517位～535位、
序列号53(RE01Fw_06)：615位～635位、
序列号54(RE01Rv_06)：734位～751位。
序列号38所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号55～66所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号55(RE04Fw_01)：206位～224位、
序列号56(RE04Rv_01)：360位～378位、
序列号57(RE04Fw_02)：35位～52位、
序列号58(RE04Rv_02)：206位～224位、
序列号59(RE04Fw_03)：611位～630位、
序列号60(RE04Rv_03)：744位～762位、
序列号61(RE04Fw_04)：570位～589位、
序列号62(RE04Rv_04)：727位～746位、
序列号63(RE04Fw_05)：435位～453位、
序列号64(RE04Rv_05)：572位～593位、
序列号65(RE04Fw_06)：748位～767位、
序列号66(RE04Rv_06)：890位～909位。
序列号39所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号67～74所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号67(RE10Fw_02)：783位～800位、
序列号68(RE10Rv_02)：879位～896位、
序列号69(RE10Fw_03)：59位～77位、
序列号70(RE10Rv_03)：239位～257位、
序列号71(RE10Fw_04)：590位～607位、
序列号72(RE10Rv_04)：789位～809位、
序列号73(RE10Fw_05)：377位～396位、
序列号74(RE10Rv_05)：501位～518位。
序列号40所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号75～82所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号75(RE11Fw_01)：264位～281位、
序列号76(RE11Rv_01)：379位～397位、
序列号77(RE11Fw_02)：106位～123位、
序列号78(RE11Rv_02)：278位～296位、
序列号79(RE11Fv_03)：375位～392位、
序列号80(RE11Rv_03)：531位～548位、
序列号81(RE11Fw_04)：526位～543位、
序列号82(RE11Rv_04)：709位～726位。
序列号41所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号83～92所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号83(RE23Fw_01)：34位～53位、
序列号84(RE23Rv_01)：157位～176位、
序列号85(RE23Fw_02)：159位～178位、
序列号86(RE23Rv_02)：305位～322位、
序列号87(RE23Fw_03)：462位～481位、
序列号88(RE23Rv_03)：584位～603位、
序列号89(RE23Fw_04)：436位～453位、
序列号90(RE23Rv_04)：535位～552位、
序列号91(RE23FW_05)：279位～298位、
序列号92(RE23Rv_05)：401位～419位。
序列号42所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号93～100所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号93(RE24Fw_01)：328位～347位、
序列号94(RE24Rv_01)：414位～433位、
序列号95(RE24Fw_02)：178位～196位、
序列号96(RE24Rv_02)：328位～347位、
序列号97(RE24Fw_03)：103位～120位、
序列号98(RE24Rv_03)：274位～291位、
序列号99(RE24FW_04)：387位～406位、
序列号100(RE24Rv_04)：537位～555位。
序列号130所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号137～144所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号137(Mac_06Fw01)：88位～105位、
序列号138(Mac_06Rv01)：223位～241位、
序列号139(Mac_06Fw02)：156位～175位、
序列号140(Mac_06Rv02)：312位～331位、
序列号141(Mac_06Fw03)：460位～478位、
序列号142(Mac_06Rv03)：604位～623位、
序列号143(Mac_06Fw04)：604位～623位、
序列号144(Mac_06Rv04)：743位～760位、
序列号131所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号145～148所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号145(Mac_10Fw01)：94位～113位、
序列号146(Mac_10Rv01)：228位～245位、
序列号147(Mac_10Fw02)：280位～299位、
序列号148(Mac_10Rv02)：453位～472位、
序列号132所示的碱基序列上的设计为引物的序列号149～158所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号149(Mac_11Fw01)：71位～88位、
序列号150(Mac_11Rv01)：228位～248位、
序列号151(Mac_11Fw02)：477位～496位、
序列号152(Mac_11Rv02)：596位～615位、
序列号153(Mac_11Fw03)：536位～554位、
序列号154(Mac_11Rv03)：617位～635位、
序列号155(Mac_11Fw04)：558位～575位、
序列号156(Mac_11Rv04)：671位～688位、
序列号157(Mac_11Fw05)：299位～316位、
序列号158(Mac_11Rv05)：391位～410位、
序列号133所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号159～164所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号159(Mac_12Fw01)：271位～290位、
序列号160(Mac_12Rv01)：416位～433位、
序列号161(Mac_12Fw02)：603位～622位、
序列号162(Mac_12Rv02)：747位～765位、
序列号163(Mac_12Fw03)：58位～75位、
序列号164(Mac_12Rv03)：198位～216位、
序列号134所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号165～170所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号165(Mac_13Fw01)：108位～126位、
序列号166(Mac_13Rv01)：288位～305位、
序列号167(Mac_13Fw02)：321位～339位、
序列号168(Mac_13Rv02)：453位～472位、
序列号169(Mac_13Fw03)：576位～595位、
序列号170(Mac_13Rv03)：720位～739位、
序列号135所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号171～174所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号171(Mac_15Fw01)：233位～250位、
序列号172(Mac_15Rv01)：326位～346位、
序列号173(Mac_15Fw02)：442位～460位、
序列号174(Mac_15Rv02)：527位～546位、
序列号136所示的碱基序列上的、设计为引物的序列号175～182所示的碱基序列的存在位置分别表示如下。
序列号175(Mac_16Fw02)：848位～867位、
序列号176(Mac_16Rv02)：952位～969位、
序列号177(Mac_16Fw03)：135位～152位、
序列号178(Mac_16Rv03)：222位～240位、
序列号179(Mac_16Fw05)：544位～562位、
序列号180(Mac_16Rv05)：669位～688位、
序列号181(Mac_16Fw07)：703位～720位、
序列号182(Mac_16Rv07)：792位～812位、
其中上述的序列号后的()内表示本发明中命名的引物的名称。
获得本发明的引物的方法如上述获得本发明的核苷酸的方法中所述那样。
另外，本发明的引物也可以用标记物质标记。
作为标记本发明的引物的方法，可以例举本领域中通常进行的寡核苷酸的标记方法，根据各种标记物质可以选择适当的方法。
作为用标记物质对本发明的引物进行标记中使用的标记物质，只要是放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质、生物素等公知的标记物质，无论哪一种都可以使用。
例如，作为放射性同位素，可列举32P、33P、35S等，作为酶，可列举碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等，作为荧光物质，可列举花菁染料(CyanineDye)系的Cy3、Cy5(Amersham Biosciences公司)、Alexa555、Alexa647(Invitrogen公司)荧光素等，作为发光物质，可列举含有吖啶酯(Acridinium Ester)的化学发光试剂等。
作为用放射性同位素标记本发明的引物的方法，可以列举通过在合成引物时掺入用放射性同位素标记了的核苷酸来标记引物的方法、及在合成了引物之后用放射性同位素标记的方法等。具体地说，可以列举，一般经常使用的随机引物法、缺口平移法、通过T4多核苷酸激酶的5’-末端标记法、使用末端脱氧核苷酸转移酶的3’-末端标记法、RNA标记法等。
作为用酶标记本发明的引物的方法，可以列举，使碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶等酶分子与欲进行标记的引物直接共价结合等作为该领域的常规方法的直接标记法。
作为用荧光物质标记本发明的引物的方法，可列举例如用该领域常规方法的标记方法使经荧光素标记的核苷酸掺入引物的方法。另外，利用将具有连接臂(linker arm)的核苷酸置换成序列的寡核苷酸的方法(例如，参考Mucleic Acids Res.，1986年，第14卷，第6115页)，也可以用荧光物质标记核苷酸。这种情况下，还有利用特开昭60-500717号公报所公开的合成方法，从脱氧尿苷化学合成第5位具有连接臂的尿苷，然后将荧光物质导入上述寡核苷酸链的方法。
作为用发光物质标记以及用生物素标记本发明的引物的方法，可以例举通常在该领域进行的对核苷酸进行发光标记或生物素标记的常法方法。
作为本发明涉及的鸟分枝杆菌检测用探针，可以例举含有下述寡核苷酸(本发明的寡核苷酸)的探针(以下有时称为本发明的探针)，所述寡核苷酸含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交。
本发明的探针在符合PCR(包括实时PCR)等的核酸扩增反应、核酸杂交等条件下，可以从含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部的寡核苷酸中，考虑解离温度(Tm值)等，选择适当区域的适当长度来使用。但是，如果要使探针具有充分的特异性，则优选考虑为维持作为探针序列的特异性所必需的碱基数来进行设计。
例如，作为在核酸杂交法(例如，DNA杂交等)等中使用的探针，优选长度为10～700个碱基、优选为100～600个碱基、更优选为200～500个碱基的探针。
另外，例如作为实时PCR扩增法(例如TaqManTM法、分子信标(Molecular Beacon)法等)等中使用的探针，可以例举长度为10～50个碱基、优选为15～40个碱基、更优选为20～30个碱基的探针。
本发明的探针中可以使用的含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸(本发明的寡核苷酸)的具体例子，与上述本发明的寡核苷酸的说明中所述的相同。
作为本发明的探针的优选的具体例子，可以例举含有下述寡核苷酸的探针，所述寡核苷酸是含有选自序列号6～32、序列号43～129、和序列号137～205的碱基序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸，或者是含有选自序列号6～32、序列号43～129、和序列号137～205的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸。
作为更优选的探针，可以例举含有选自序列号6、7、10～17、22～24、26～29、32、57～72、75～94、108～115、117～126、137～205的碱基序列的一部分或全部的探针，或含有选自序列号6、7、10～17、22～24、26～29、32、57～72、75～94、108～115、117～126、137～205的碱基序列的互补序列的一部分或全部的探针。
作为更优选的探针，可以例举含有选自序列号137～205的碱基序列的一部分或全部的探针、或含有选自序列号137～205的碱基序列的互补序列的一部分或全部的探针。
另外，选自序列号24～32、序列号101～129、和序列号183～205的碱基序列或它们的互补序列，是使用本发明的引物通过PCR扩增的寡核苷酸的碱基序列。表1一并给出了正向引物和反向引物的组合，以及使用这些组合通过PCR扩增的碱基序列的序列号。例如显示，序列号24所示的碱基序列，是使用序列号6所示的碱基序列的寡核苷酸作为正向引物，序列号7所示的碱基序列的寡核苷酸作为反向引物，通过PCR扩增的寡核苷酸的碱基序列。
获得本发明的探针的方法如上述获得本发明的核苷酸的方法中所述。
本发明的探针可以用标记物质进行标记。
作为用于以标记物质标记本发明的探针的标记物质，只要是放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质、生物素等公知的标记物质，可以使用任一种。
用于用标记物质标记本发明的探针的标记物质的具体例子和标记方法，如在本发明的引物的标记方法的说明中所记载。
另外，作为在后述的通过实时PCR的检测法中使用的标记探针，可以列举用在实时PCR法中通常使用的标记物质标记本发明的探针而得的标记探针。可以列举例如，5’末端用报告荧光物质[羧基荧光素(FAM)、六氯荧光素(HEX)、四氯荧光素(TET)等]标记、3’末端用猝灭色素[例如羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等荧光物质，Black Hole Quencher色素(BHQ)、4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(DABCYL)等非荧光物质]标记的本发明的探针。
在后述的通过TaqManTM实时PCR的检测法中，也可以使用上述的标记探针。
作为本发明所涉及的在鸟分枝杆菌的检测中使用的样品(被检样品)，可以列举喀痰、血液、咽部粘液、胃液、支气管灌洗液、经支气管采集物、胸水等的穿刺液、尿、脓等各种临床样本。另外，还可以是从样本分离、培养的培养菌体，以及从这些培养菌体中分离、纯化出的核酸，或者用核酸扩增检测体系等所扩增的核酸。
为了从上述样品提取、纯化DNA，可以按照从样本提取抗酸菌(结核菌)DNA所使用的常规方法来进行。
首先，需要破坏样品中的菌体的细胞壁。作为其方法，例如在以菌体为样品的情形时，可以列举例如，用SDS等表面活性剂、硫氰酸胍(GTC)等蛋白变性剂处理菌体从而破坏结核菌的膜结构的方法，或用玻璃珠等物理性地破坏菌体的方法，等等。
在以痰为样本的情况下，优选首先作为前处理，通过美国疾病管理预防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention，简称CDC)所推荐的NALC(N-乙酰-L-半胱氨酸)-NaOH法(Kent PT，Kubica GP，PubricHealth Mycobacteriology，A Guide for the Level III Laboratory，U.S.Department of Health and Human Services，Public Health Service，Center for Disease Control，Atlanta，U.S.A.，1985年，第31-55页)来进行样本的均匀化。
在破坏了结核菌的细胞壁之后，可以通过该领域一般的DNA制备法(酚/氯仿提取、乙醇沉淀法等；Rapid and simple method for purificationof nucleic acids，J.Clin.Microbiol.，1990年3月，第28卷(3)，第495-503页，Boom R，Sol CJ，Salimans MM，Jansen CL，Wertheim-van Dillen PM，van der Noordaa J)、使用异丙醇来淀的方法等来进行DNA的提取和纯化。
在DNA的提取纯化时，由于这种用途的各种试剂盒已有市售，因此可使用所述试剂盒。例如，可以使用Qiagen公司生产的离子交换树脂类型的DNA提取纯化试剂盒Genomic-tip等进行DNA的提取、纯化。
以使用从样本分离、培养的培养菌体作为样品的情况为例来显示时，如下所述。
例如，挑取小川培养基上的菌落，悬浮在灭菌蒸馏水中，离心分离而收集菌体，然后再次悬浮在蒸馏水中。接着将菌体悬浮液进行高压灭菌器处理之后，经过菌体的粉碎处理(通过玻璃珠的物理性破碎等)，再离心分离回收上清。可以通过上述方法从所得的上清中提取纯化DNA。
作为本发明涉及的鸟分枝杆菌的检测方法，可以例举使用含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸(本发明的寡核苷酸)作为引物或/和探针的方法(使用本发明的引物或/和探针的方法)。
可以列举例如，
(A)使用本发明的寡核苷酸作为引物进行核酸扩增反应，检测获得的引物延伸产物的方法；
(B)使用经标记物质标记的本发明寡核苷酸作为标记探针的方法；等等。以下，对于各个方法进行说明。
(A)使用本发明的寡核苷酸作为引物进行核酸扩增反应，检测获得的引物延伸产物的方法
作为该方法中(A)的使用本发明的寡核苷酸作为引物来进行核酸扩增反应的方法，可以列举例如，使用本发明的引物，使用样品中的核酸作为模板，通过DNA聚合酶等来进行核酸扩增反应[例如，聚合酶链反应(PCR)法(特开昭60-281号公报)、LAMP(环介导的等温扩增(Loop-MediatedIsothermal Amplification))法(Tsugunori Notomi等，Nucleic Acid Res.，第28卷，e63，2000年)、ICANTM(嵌合引物引发的核酸等温扩增(Isothermaland Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids))法(临床病理，51卷(11)，第1061-1067页，2003年11月)、LCR(连接酶链反应)法(特开平4-211399号)、SDA(链置换扩增)法(特开平8-19394号)]，从而使引物延伸的方法。因为由此可以扩增鸟分枝杆菌的碱基序列的特定区域的序列，所以通过测定得到的引物延伸产物，可以检测鸟分枝杆菌。
在上述的进行核酸扩增反应的方法中，可以列举PCR法作为最一般的方法，作为PCR法的例子，可以使用例如实时扩增检测法(参考例如美国专利第5210015号、美国专利第5538848号的记载)。此外，作为通过实时扩增检测法进行的检测法的例子，可以列举例如实时PCR检测法。
作为实时PCR检测法的例子，可以列举TaqManTM实时PCR法(参考例如美国专利第5538848号的记载)、MGB遮蔽探针系统(MGB EclipseProbe System)法(参考例如美国专利第5,801,155号的记载)、分子信标探针技术(Molecular Beacons Probe Technology)法(参考例如美国专利第5925517号的记载)、LUX荧光引物(LUX Fluorogenic Primer)法(Invitrogen公司)、猝灭探针-PCR(Quenching probe-PCR，QP)法(参考例如美国专利第6,492,121号的记载)等。
在PCR等核酸扩增反应中使用的本发明的引物的具体例子如上所述。
另外，作为在核酸扩增反应中使用的优选的正向引物与反向引物的组合，可以列举在上述表1中显示的组合。
其中作为优选的正向引物与反向引物的组合，可列举例如记载于下表2中的组合。
表2中，例如编号1的组合表示“正向引物是含有序列号6所示的碱基序列的寡核苷酸，反向引物是含有序列号7所示的碱基序列的寡核苷酸的组合”。
表2
可以在使用上述引物的实时PCR等核酸扩增反应中使用的其它脱氧核糖核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、DNA聚合酶等试剂可以使用通常在该领域中使用的试剂，其条件、方法等除了使用本发明的引物和探针以外，可按照PCR法的一般方案进行。
检测核酸扩增反应中获得的引物延伸产物的方法可以是通常在该领域中进行的常规方法，没有限定。
可以列举如下的各种检测方法，例如，嵌入剂法、TaqManTM实时PCR法(参考例如美国专利第5538848号的记载)、MGB遮蔽探针系统(MGBEclipse Probe System)法(参考例如美国专利第5,801,155号的记载)、分子信标探针技术(Molecular Beacons Probe Technology)法(参考例如美国专利第5925517号的记载)、LUX荧光引物(LUX Fluorogenic Primer)法(Invitrogen公司)、猝灭探针-PCR(Quenching probe-PCR，QP)法(参考例如美国专利第6,492,121号的记载)，以及在进行核酸扩增反应之后，对得到的引物延伸产物进行电泳，基于其结果而进行的方法，和测定使用标记引物进行核酸扩增反应而得的引物延伸产物的标记的方法，等等。
其中，作为一般经常使用的方法，可以列举例如以下的方法。
(A-1)嵌入剂法；
(A-2)TaqManTM实时PCR法(TaqManTM探针法)；
(A-3)在进行核酸扩增反应之后，对得到的引物延伸产物进行电泳，基于其结果而进行的方法；
(A-4)使用标记引物进行核酸扩增反应，测定所得到的引物延伸产物的标记的方法。
以下，对于各个方法进行说明。
(A-1)嵌入剂法
可以利用使用公知的嵌入剂来进行实时PCR的通常的嵌入剂法。
可以列举例如，使用本发明的引物和嵌入剂，并利用通常的嵌入剂法来进行实时PCR的方法。
即，嵌入剂是与双链DNA特异性地结合而发出荧光的试剂，一照射激发光就发出荧光。因为如果用PCR来反复扩增而使DNA增加，嵌入剂就插入该DNA中，所以嵌入剂与引物延伸产物的生成量成比例地掺入DNA，因此通过检测来自嵌入剂的荧光强度，可以知道引物延伸产物的量。
但是，因为嵌入剂与所有的双链DNA结合，所以以得到的荧光强度的测定结果为基础，根据需要，制作熔解曲线，进行熔解曲线分析。即，在PCR反应之后缓缓提高PCR反应液的温度，同时测定来自嵌入剂的荧光强度。最开始因为PCR扩增产物形成双链，所以发出荧光，但因为一旦PCR反应液的温度达到某固定温度PCR扩增产物就解离成单链，所以来自嵌入剂的荧光急剧下降。这时的温度为熔解温度(Tm值)，是引物延伸产物的序列固有的值。对于熔解曲线的峰是作为目标的特异产物的峰，还是特异产物与非特异产物的峰，可以从该Tm值判定。
因为该嵌入剂法不需要在实时PCR之后进行电泳，所以在临床检查领域等中需要迅速进行判定的情况下是有效的方法。
作为在本发明中使用的嵌入剂，只要是通常在该领域中使用的嵌入剂，可以任意使用，例如有SYBRTM Green I(Molecular Probe公司商品名)、溴化乙锭、芴等。
说明本发明所涉及的“使用嵌入剂法的鸟分枝杆菌的检测方法”的例子如下。
使用本发明的引物和嵌入剂(例如SYBRTM Green I)，使用从要检测鸟分枝杆菌的样品(被检样品)中纯化出的纯化DNA样品作为模板，使用TaqDNA聚合酶等聚合酶来进行实时PCR。然后用上述的降低温度的方法，测定与引物延伸产物的扩增量相关的嵌入SYBRTM Green I的荧光强度。
接着，以引物延伸产物(双链DNA)的解离温度作为横轴，以荧光强度的1次微分(变化量)作为纵轴，制成熔解曲线。通过进行引物延伸产物的熔解曲线分析来进行峰的检测，在得到单个峰的情况下，判断被检样品为鸟分枝杆菌阳性。
或者，制备纯化DNA样品溶液的稀释系列，在每个稀释系列中，与上述同样方式进行实时PCR。
然后，在实时PCR中，对作为模板使用的纯化DNA样品溶液的每个稀释系列，分别以引物延伸产物(双链DNA)的解离温度作为横轴，以荧光强度的1次微分(变化量)作为纵轴，制成熔解曲线。然后，进行引物延伸产物的熔解曲线分析，进行检测峰的分析。对于各稀释系列的各引物延伸产物，在检测到相同的Tm值的峰的情况下，被检样品被判断为鸟分枝杆菌阳性(也就是说，存在鸟分枝杆菌或其基因。以下相同)。
另外，作为对照，通过常规方法提取并纯化鸟分枝杆菌以外的分枝杆菌属菌来源的DNA，使用该DNA作为模板，除此之外，可以按与上述相同的方法进行实时PCR，同样测定SYBRTM Green I的荧光强度，并进行熔解曲线分析。此时，由于样品中没有鸟分枝杆菌来源的序列，故而熔解曲线分析中应该不出现峰。为了更准确地判断鸟分枝杆菌的有无，优选同时进行上述对照实验。
进而，由于也可以基于利用嵌入剂法的方法获得的测定值，按照通过实时PCR进行的常规方法，制成标准曲线，因此使用该标准曲线，可以获得存在于样品中的鸟分枝杆菌的基因组DNA量(拷贝数)。
标准曲线的制作方法以及使用该标准曲线的鸟分枝杆菌的定量方法在后面叙述。
作为通过本发明涉及的使用嵌入剂的实时PCR检测法检测鸟分枝杆菌的方法的一个例子，使用上述的本发明的“引物12Fw_1”和“引物12Rv_1”，以检测鸟分枝杆菌的情况为例进行说明如下。
首先，通过公知的方法，从要检测鸟分枝杆菌的样品(被检样品)中获得纯化DNA样品。
另外，用DNA合成仪，通过亚磷酰胺法，合成序列号14所示的碱基序列的寡核苷酸(12Fw_1)和序列号15所示的碱基序列的寡核苷酸(12Rv_1)。
使用合成的12Fw_1作为正向引物，使用12Rv_1作为反向引物，进行例如如下的实时PCR。
也就是说，制备含引物12Fw_1和引物12Rv_1各50～2000nM，嵌入剂[例如SYBRTM Green I(Molecular Probe公司商品名)]原液的约5～100000倍稀释液、1.0～4.0mM MgCl2、KCl、BSA、胆酸钠、0.005～0.2％TritonX-100、各0.2mM左右的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、10～80单位/ml的聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9)，作为PCR用反应液。向该PCR用反应液中加入从要检测鸟分枝杆菌的样品(被检样品)中纯化的纯化DNA样品，制成PCR用样品。将该PCR用样品加入到96孔反应板的孔中，用实时PCR检测装置等进行实时PCR。反应重复30～50个循环，每1个循环中测定与引物延伸产物的扩增量相关的嵌入SYBRTM Green I的荧光强度。
然后，以引物延伸产物(双链DNA)的解离温度作为横轴，以荧光强度的1次微分(变化量)作为纵轴，制成熔解曲线。用该曲线进行引物延伸产物的熔解曲线分析，进行峰的检测，在获得单一峰时，被检样品被判断为鸟分枝杆菌阳性。
或者，制备纯化DNA样品溶液的稀释系列，在各稀释系列中，以与上述同样方式进行实时PCR。然后，对实时PCR中作为模板使用的纯化DNA样品溶液的各稀释系列，分别以引物延伸产物(双链DNA)的解离温度作为横轴，荧光强度的1次微分(变化量)作为纵轴，制成熔解曲线。然后，进行引物延伸产物的熔解曲线分析，进行检测峰的分析。
作为这种情形的鸟分枝杆菌的检测方法，对于熔解曲线分析中对应于各稀释系列的各引物延伸产物，在检测到相同的Tm值的峰时，被检样品被判断为鸟分枝杆菌阳性。
另外，作为对照，通过常规方法提取并纯化鸟分枝杆菌以外的分枝杆菌属菌来源的DNA，使用该DNA作为模板，除此之外，可以通过与上述同样的方法进行实时PCR，同样测定SYBRTM Green I的荧光强度，进行熔解曲线分析。此时，由于样品中没有鸟分枝杆菌来源的序列，因此熔解曲线分析中应不出现峰。为了更准确地判断有无鸟分枝杆菌，优选同时进行上述的对照实验。
进而，通过制成标准曲线，可以获得样品中的鸟分枝杆菌的基因组DNA的数量(拷贝数)。而且，由于该数量与鸟分枝杆菌的数量成比例，因此还可以得知样品(被检样品)中的鸟分枝杆菌的数量。
(A-2)TaqManTM实时PCR法(TaqManTM探针法)
TaqManTM实时PCR法是使用了将5’末端用例如FAM等荧光色素(报告分子)标记、将3’末端用例如TAMRA等猝灭色素标记得到的标记探针的实时PCR法，是能够高灵敏度且定量地检测作为目标的微量DNA的方法(参考例如美国专利第5,538,848号的记载)。
具体而言，使用本发明的引物，以及本发明的5′末端用报告荧光色素标记、3′末端用猝灭色素标记的标记探针，以样品中的核酸作为模板进行PCR，检测从该标记探针游离出来的标记物质的标记的方法。
TaqManTM实时PCR法的原理如下。
该方法使用5’末端用荧光色素(报告分子)标记、3’末端用猝灭色素标记的与目标基因的特定区域杂交的寡核苷酸探针。该探针在通常状态下报告色素的荧光被猝灭色素所抑制。在使该荧光标记探针与目标基因完全杂交的状态下，使用DNA聚合酶自其外侧起进行PCR。通过DNA聚合酶的延伸反应一旦进行，则由于DNA聚合酶的核酸外切酶活性，荧光标记探针被从5’端水解，报告色素游离，从而发出荧光。实时PCR法是实时地监测该荧光强度的方法，由此可以正确地定量模板DNA的初始量。
在本发明所涉及的TaqManTM实时PCR检测法中使用的正向引物和反向引物可以使用本发明的引物。作为优选的引物，可以列举在所述的PCR法等核酸扩增反应的中使用的引物，其优选的具体例子和优选的组合也如上所述。
作为在本发明所涉及的TaqManTM实时PCR检测法中使用的、5’末端用荧光色素(报告分子)标记、3’末端用猝灭色素标记的探针中使用的探针，可以是上述的本发明的探针。实际上，使用含有预测可以在用所选择的正向引物与反向引物的组合进行实时PCR的情况下得到的引物延伸产物的碱基序列的探针，或者进而含有从其序列设计的碱基序列的探针。
例如，在使用引物12Fw_1和引物12Rv_1进行实时PCR时使用的探针，可以例举含有预测在该实时PCR中可以被扩增的序列号28所示碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸。
作为标记5’端的报告荧光物质，可以列举羧基荧光素(FAM)、六氯荧光素(HEX)、四氯荧光素(TET)、Cy5、VIC等，其中经常使用FAM。作为标记3’末端的猝灭色素，可以列举羧基四甲基罗丹明(TAMRA)等荧光物质，Black Hole Quencher色素(如BHQ)、4-((4-(二甲基氨基)苯基)偶氮)苯甲酸(DABCYL)等非荧光物质，其中经常使用TAMRA。
在实时PCR检测体系中使用的其它脱氧核苷三磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)、DNA聚合酶等试剂，可以使用在通常的实时PCR中使用的试剂，实时PCR的方法除了使用本方法的引物和探针之外，可以按照实时PCR的一般程序进行。
作为利用本发明所涉及的TaqManTM实时PCR检测法的鸟分枝杆菌的检测方法的一个例子，以使用本发明的引物“12Fw_1”和“12Rv_1”，检测鸟分枝杆菌的情况为例进行说明，具体如下。
首先，通过公知的方法，从要检测鸟分枝杆菌的样品(被检样品)中获得纯化DNA样品。
另外，使用DNA合成仪，通过亚磷酰胺法，合成序列号14所示的碱基序列的寡核苷酸(12Fw_1)、和序列号15所示的碱基序列的寡核苷酸(12Rv_1)。
另外，从预计可以在使用12Fw_1和12Rv_1作为引物的PCR中被扩增的序列号28的碱基序列，设计用作探针的序列，合成该碱基序列的寡核苷酸。用常规方法在该寡核苷酸的5’末端结合报告色素FAM，在3’末端结合报告猝灭色素TAMRA，从而得到荧光标记探针。
使用上述制备的12Fw_1作为正向引物，12Rv_1作为反向引物，例如像下述那样进行实时PCR。
也就是说，制备含有各0.1～2μM、优选各1μM的引物12Fw_1和引物12Rv_1，100～1000nM的荧光标记探针，1.0～4.0mM MgCl2，KCl，BSA，胆酸钠，0.005～0.2％TritonX-100，各0.2mM左右的dATP、dCTP、dGTP、dTTP，10～80单位/ml的Taq DNA聚合酶的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9)，作为PCR用反应液。向20μl该PCR用反应液中添加纯化DNA样品1ng，获得了PCR用样品。然后将该PCR用样品加入到96孔反应板的孔中，使用实时PCR检测装置等进行实时PCR。反应重复30～50个循环，在每1个循环都测定报告色素的荧光强度量。
作为这种情况的鸟分枝杆菌检测方法，当测定到报告色素的荧光时，则被检样品被判断为鸟分枝杆菌阳性。
另外，因为在实时PCR法中，可以制成标准曲线，所以可以得到样品中的鸟分枝杆菌的基因组DNA的数量(拷贝数)。另外，因为该数量与鸟分枝杆菌的数量成比例，所以也可以知道样品(被检样品)中的鸟分枝杆菌的数量。
标准曲线的制作方法可以按照在实时PCR法中通常进行的常规方法。例如，使用拷贝数已知的鸟分枝杆菌的基因组DNA样品作为标准，调制稀释系列的浓度(拷贝数)的PCR用DNA样品。接着使用各稀释系列的PCR用DNA样品按照上述方法进行实时PCR，从而测定报告色素的荧光强度。对于每个各稀释系列的PCR用DNA样品，分别制成将测定的荧光强度的测定值(Rn、y轴)相对于PCR的各循环数(x轴)作图的扩增曲线。接着，选择荧光强度以指数函数扩增的Rn部分，划出阈值线(Threshold line，Th)。将Th与各PCR用DNA样品的扩增曲线交叉的点作为循环阈值(Threshold cycle，Ct)。接着将Ct值(y轴)相对于所使用的各PCR用DNA样品的拷贝数的对数值(x轴)作图，可以以对各Ct所得到的近似曲线作为标准曲线。
即使在上文所述的通过嵌入剂法来进行实时PCR的情形下，也可以同样地以所得到的测定值为基础制成标准曲线。例如，制成将来自嵌入剂的荧光量的测定值(Rn，y轴)相对于PCR的各循环数(x轴)作图的扩增曲线。接着，用与上述相同的方法得到Ct值，将Ct值(y轴)相对于在实时PCR中使用的各PCR用DNA样品的拷贝数的对数值(x轴)作图，可以以对各Ct得到的近似曲线作为标准曲线。
为了定量样品中的鸟分枝杆菌的基因组DNA的数量(拷贝数)，首先从要检测鸟分枝杆菌的样品中分离纯化DNA，然后对于所得到的DNA样品进行实时PCR，同样地制成扩增曲线。得到制成标准曲线时的Th与得到的扩增曲线交叉的Ct值。通过将该Ct值适用于标准曲线，可以得到样品中的鸟分枝杆菌的基因组DNA量(拷贝数)。
(A-3)在进行核酸扩增反应之后，对得到的引物延伸产物进行电泳，基于其结果而进行的方法
作为该方法，可以列举例如：
“鸟分枝杆菌的检测方法，其特征在于，包括下述工序，
(i)使用含有选自序列号1，序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸作为引物(本发明的引物)，以样品中的核酸作为模板进行核酸扩增反应；
(ii)对(i)所得的引物延伸产物进行电泳，基于该结果来判定有无鸟分枝杆菌。”
作为进行电泳，基于其结果来判定有无鸟分枝杆菌的方法，可以列举例如，
(A-3-1)通过确认目标大小(碱基对数)的引物延伸产物组分来判断的方法，
(A-3-2)通过使用标记探针的杂交来检测的方法，
等等。
核酸扩增反应的具体例子如上所述。
电泳法的条件、操作方法等，可以按照在该领域通常进行的常规方法。
以下，对(A-3-1)和(A-3-2)的方法进行说明。
(A-3-1)通过确认目标大小(碱基对数)的引物延伸产物组分来判断的方法
例如，首先从本发明的引物中，选择正向引物与反向引物的适当组合，使用该组合进行PCR等核酸扩增反应。接着，对得到的引物延伸产物进行电泳。预先预测可以从在核酸扩增反应中使用的正向引物与反向引物的组合扩增的引物延伸产物的大小(碱基对数)，然后可以用常规方法确认所得到的电泳组分是否相当于所预测的大小的引物延伸产物。可以列举例如，使用将得到的电泳组分用溴化乙锭等染色来将核酸种可视化这样的方法，来将该组分染色，从而确认该引物延伸产物的大小等方法。
作为通过(A-3-1)的方法的具体判定方法，可以列举下述方法，所述方法例如，使用上述表1所记载的正向引物与反向引物的组合来进行PCR，然后对得到的引物延伸产物进行电泳，在确认了预测用该引物组合可以扩增的、用表1所记载的序列号表示的碱基序列的寡核苷酸，或者确认了该碱基对数的大小的组分的情况下，判定被检样品是鸟分枝杆菌阳性。
(A-3-1)方法的具体例子汇总示于下表3中。
也就是说，例如，表3中编号1的方法是“使用含有序列号6所示的碱基序列的寡核苷酸作为正向引物，使用含有序列号7所示的碱基序列的寡核苷酸作为反向引物进行PCR后，对所得引物延伸产物进行电泳，将确认了具有119个碱基对的组分或具有序列号24所示的碱基序列的寡核苷酸的组分的被检样品判断为阳性的方法”。
表3
上述内容中优选编号1、3～6、9、17～24、26～35、39～61的方法。
这其中特别优选编号39～61的方法。
(A-3-2)通过使用标记探针的杂交来检测的方法
可以列举例如，对进行核酸扩增反应而得到的引物延伸产物进行电泳，对于得到的电泳组分，对将本发明的探针用标记物质进行标记而得的的标记探针进行杂交。在通过检测该标记探针的标记，而确认了存在与该标记探针杂交的组分的情况下，判定该被检样品是鸟分枝杆菌阳性的方法。
使用的探针和将探针进行标记的标记物质的具体例子、以及探针的标记方法如上所述。
显示其一例如下。即，可以列举，使用上述表1所记载的正向引物与反向引物的组合来进行PCR，然后对得到的引物延伸产物进行电泳。预先调制将下述碱基序列的寡核苷酸用标记物质进行标记而得的标记探针，所述碱基序列预测可以用在PCR中使用的正向引物与反向引物的组合来扩增，并含有表1所记载的序列号的碱基序列的一部分或全部。例如，进行电泳组分对该标记探针的杂交，在通过检测该标记探针的标记而确认了存在与该标记探针杂交的组分的情况下，判定被检样品是鸟分枝杆菌阳性的方法。
这些方法的优选的具体例子汇总示于下表4中。
例如，表4中，编号1的方法是“使用含有序列号6所示的碱基序列的寡核苷酸作为正向引物、使用含有序列号7所示的碱基序列的寡核苷酸作为反向引物，进行PCR后，对所得的引物延伸产物进行电泳。然后，对所得组分，与将下述寡核苷酸用标记物质进行标记而成的标记探针进行杂交，其中所述寡核苷酸含有序列号24所示碱基序列的一部分或全部的碱基序列，通过检测该标记探针的标记，从而将被确认与该标记探针杂交的组分判断为阳性的方法”。
表4
其中优选编号1、3～6、9、17～24、26～35、39～61的方法。
其中特别优选编号39～61的方法。
通过(A-3)方法进行的本发明的鸟分枝杆菌的检测方法的详细内容，可列举例如，使用12Fw_1(序列号14)作为正向引物，使用12Rv_1(序列号15)作为反向引物进行PCR和电泳后，通过确认目标碱基对数的引物延伸产物组分的方法来检测的情况(上述的(A-3-1)的编号5的方法，参照表3)为例，进行说明如下。
首先，通过公知的方法，从要检测鸟分枝杆菌的样品(被检样品)中获得纯化DNA样品。
另外，用DNA合成仪，通过亚磷酰胺法，合成12Fw_1(由序列号14所示的序列组成的寡核苷酸)和12Rv_1(由序列号15所示的碱基序列组成的寡核苷酸)。
制备含各0.1～2μM、优选各1μM的引物12Fv_1和引物12Rv_1、1.0～4.0mM MgCl2、KCl、BSA、胆酸钠、0.005～0.2％聚氧乙烯辛基苯基醚、各0.1～0.6mM左右的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和10～80单位/ml的Taq DNA聚合酶的10mM Tris-HCl(pH8.9)缓冲液，作为PCR用反应液。
使用向PCR用反应液中添加了纯化DNA样品的物质作为PCR用样品，通过DNA热循环仪进行20～40次PCR。对所得PCR后的反应液进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。然后，用溴化乙锭染色后，检测紫外线下的荧光。另外，分子量标记也与反应液同时泳动，通过比较相对迁移率，计算检测到的DNA片段的长度。在使用12Fw_1(具有序列号14所示的序列)作为正向引物、12Rv_1(具有序列号15所示的序列)作为反向引物的PCR中，预测鸟分枝杆菌的碱基序列中的150个碱基对的DNA片段(具有序列号28所示的序列)被复制(参照表3)。因此，在确认了150个碱基对大小的荧光条带时，可以将被检样品判断为鸟分枝杆菌阳性。
另外，本发明在核酸扩增工序中，还可以应用使用RNA转录产物的检测方法。可以列举例如，NASBA(基于核酸序列的扩增(nucleic acidsequence based amplification))法(日本专利第2650159号)、3SR(自主序列复制(self-sustained sequence replication))法(特公平7-114718号)、TAS(基于转录的扩增系统(transcription based amplification system))法(特表平2-500565号：国际公开WO88/10315号)、TMA(转录介导的扩增(transcription mediated amplification))法(特开平11-46778号)等，其中使用逆转录酶与RNA聚合酶的协同作用(在逆转录酶与RNA聚合酶协同作用那样的条件下进行反应)的恒温核酸扩增法适合于测定体系的自动化。
(A-4)使用标记引物进行核酸扩增反应，从而测定得到的引物延伸产物的标记的方法
作为(A-4)的方法，可以列举使用将本发明的引物用上述的方法进行标记而得的标记引物，使用被检样品中的核酸作为模板来进行PCR等核酸扩增反应，检测、测定得到的引物延伸产物的标记，在能够检测出标记的情况下，判定该被检样品为鸟分枝杆菌阳性的方法。
作为在该方法中使用的正向引物和反向引物，可以列举在上述的PCR法中使用的引物，其优选的具体例子和优选的组合也如上所述。
在上述方法的情况下，在进行了核酸扩增反应之后，除去游离的标记引物，测定引物延伸产物的标记，在能够检测出标记的情况下，可以判断被检样品为鸟分枝杆菌阳性。
作为除去游离的标记引物的方法，可以列举用使核酸沉淀的常规方法(乙醇沉淀法、使用了异丙醇的沉淀法等)使进行核酸扩增反应而得到的反应物中的引物延伸产物沉淀，然后除去含有未沉淀的游离标记引物的上清的方法等。
另外，还可以列举，将进行核酸扩增反应而得到的反应物在适当的条件下用凝胶层析进行处理，从而分离引物延伸产物与游离的标记引物的方法，以及利用电泳法分离的方法等。
(B)使用以标记物质标记的本发明的寡核苷酸作为标记探针的方法
进而，作为本发明的鸟分枝杆菌的检测方法，可以列举使用以标记物质标记的本发明的寡核苷酸作为标记探针，使该标记探针与样品中的核酸杂交，除去游离的标记探针，然后检测杂交的复合体的标记的方法。
具体地，可以例举例如下述那样的方法。
(B-1)使本发明的寡核苷酸与固相载体结合，使用该结合体作为捕获探针，与被检样品中的核酸杂交，从而使样品中的来自鸟分枝杆菌的核酸在固相上固定化的检测方法(参考例如特开昭62-265999号的记载)。这种情况下，本发明的寡核苷酸或者固相载体可以用标记物质标记。
(B-2)使用没有标记的(B-1)的捕获探针、和将本发明的探针进行标记而得标记探针，使之与被检样品中的核酸杂交，从而使固相载体上形成捕获探针、来自鸟分枝杆菌的核酸与标记探针的复合体，从而进行测定标记探针的标记的夹心法的方法(参考例如特开昭58-40099号的记载)。
(B-3)使用以生物素标记的本发明的探针，与样品中的核酸杂交，然后用亲和素结合载体来捕获样品中来自鸟分枝杆菌的核酸的方法。
此外，在本发明的鸟分枝杆菌的检测方法中使用的试剂中，可以使用通常在该领域使用的试剂类，例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂等不抑制共存试剂等的稳定性、且不抑制PCR等核酸扩增反应、杂交反应的试剂。另外，其浓度也可以从通常在该领域使用的浓度范围适当选择。
如果列举缓冲液的具体例子，那么可以列举例如，Tris缓冲液、磷酸缓冲液、巴比妥缓冲液、硼酸缓冲液、Good’s缓冲液等通常在进行PCR等核酸扩增反应、杂交反应的情况下使用的所有缓冲液，对其pH值也没有特别限制，通常优选5～9的范围。
另外，根据需要可以使用核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)，与酶相对应的底物(dNTP、rNTP等)，还有双链嵌入剂(溴化乙锭、SYBRTM Green等)，或FAM、TAMRA等的标记检测物质等。
作为本发明涉及的鸟分枝杆菌检测用试剂盒，可以例举“含有下述寡核苷酸作为引物(本发明的引物)或/和探针(本发明的探针)的鸟分枝杆菌检测用试剂盒，所述寡核苷酸含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交”。
对构成上述试剂盒的本发明的引物和本发明的探针的具体例子，如上述“本发明的引物”、“本发明的探针”的说明中所述。
本发明的引物可以是用标记物质标记的。该标记物质的具体例子如上所述。
含有本发明的引物的试剂盒中也可包括含有正向引物和反向引物的一组引物。其例子汇总示于下表5。
例如，在下表5中，编号1的试剂盒是“包括(a)含有序列号6所示碱基序列的一部分或全部、或序列号6所示的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸引物，和(b)含有序列号7所示碱基序列的一部分或全部、或含有序列号7所示的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸引物作为构成试剂的试剂盒”。
表5
更优选的引物和其组合如上述核酸扩增法的说明所述。
另外，上述试剂盒还可以含有以标记物质标记的本发明的寡核苷酸作为标记探针。
进而，还可以例举“鸟分枝杆菌检测用试剂盒，其含有下述寡核苷酸(本发明的寡核苷酸)作为探针，所述寡核苷酸含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交”。该探针也可以是经标记物质标记的探针。
构成这些试剂盒的构成试剂的优选方式和具体例子如上所述。
此外，本发明的鸟分枝杆菌检测用试剂盒中也可以含有例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂等不抑制共存试剂等的稳定性、不抑制PCR、杂交反应的试剂。另外，其浓度也可以从通常在该领域使用的浓度范围适当选择。
如果列举缓冲液的具体例子，那么可以列举例如，Tris缓冲液、磷酸缓冲液、巴比妥缓冲液、硼酸缓冲液、Good’s缓冲液等通常在进行PCR、杂交反应的情况下使用的所有缓冲液，对其pH值也没有特别限制，通常优选5～9的范围。
另外，根据需要也可以含有核酸合成酶(DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶等)，与酶相对应的底物(dNTP、rNTP等)，还有双链嵌入剂(SYBRTM Green、溴化乙锭等)，或FAM、TAMRA等标记检测物质等。
以下列举实施例，更加具体地说明本发明，但本发明并不受这些实施例的任何限制。
此外，在实施例中使用的任一种细菌都是临床分离菌株，在培养之后，全部可以根据菌落的形状、现有的各种生物化学试验等来鉴别菌种。
【实施例】
实施例1.鸟分枝杆菌基因组来源的克隆的选择1
(1)鸟分枝杆菌来源的DNA样品的制备
从Mycos Research公司(美国)纯化成高纯度的鸟分枝杆菌TMC16741株来源的基因组DNA。
使用获得的鸟分枝杆菌来源的基因组DNA样品1～10ng作为材料(模板)，使用Genomiphi V2 DNA扩增试剂盒(GE Healthcare Bioscience公司制)进行全基因组扩增反应，获得了100μg以上的扩增产物。在以下的实验中使用该扩增产物作为“鸟分枝杆菌来源的纯化基因组DNA”。并且，确认获得的鸟分枝杆菌来源的纯化基因组DNA在吸光度测定水平上纯度良好。
另外，将该鸟分枝杆菌来源的纯化基因组DNA制备成最终400ng/μl(10mM Tris-HCl缓冲液，pH8.9)，将其作为“鸟分枝杆菌来源的DNA样品”使用。
(2)全基因组鸟枪法文库的制作
以上述(1)得到的鸟分枝杆菌来源的DNA样品24μg作为材料，用以下的方法(对Science.2001年2月16日；291(5507)：1304-1351 Venter等人所述的全基因组鸟枪法进行了改变)进行全基因组鸟枪法文库的制作。
首先，利用雾化器(Invitrogene公司生产)，在终浓度20％的甘油存在下，于5kPa～9kPa压力下进行约10分钟处理，使鸟分枝杆菌来源的DNA样品片段化。通过该处理，可以有效回收500～1000bp大小的目标组分(DNA片段)。将得到的组分利用Qiagen公司生产的提取柱进行纯化。
然后，使用タカラバイオ社制造的DNA平端化试剂盒(DNA BluntingKit)，利用T4DNA聚合酶的5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切核酸酶活性，将得到的DNA片段的末端平端化。然后将该DNA片段与经平端化末端处理后的pBSII sk+载体(Stratagene公司)进行连接反应，制作在pBSII sk+载体(ampr)中整合了DNA片段的重组DNA。
使用タカラバイオ社制造的大肠杆菌JM109感受态细胞，根据该制品说明书，用上述得到的重组DNA进行大肠杆菌JM109感受态细胞的转化。将得到的转化体于含有100μg/ml的氨苄青霉素、0.2mM IPTG、40μg/mlX-Gal的LB-琼脂培养基进行培养。挑出白色菌落，获得导入了“整合了目的DNA片段的重组DNA”的转化体的文库(鸟分枝杆菌来源的基因组的全基因组鸟枪法克隆文库)。
(3)微阵列制作
通过使用上述(2)得到的转化体的文库(鸟分枝杆菌来源的基因组DNA的全基因组鸟枪法克隆文库)，用下述方法进行PCR，制备固定于载玻片上的探针材料。
首先，制备含有各1μM的引物M13 Primer M1(TakaraBio公司制)和引物M13 Primer RV(TakaraBio公司制)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1％胆酸钠、0.1％Triton X-100(TritonX-100，聚氧乙烯辛基苯基醚，Rohm&Haas公司商品名)、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP和Taq DNA聚合酶((株)Nippon Gene制)40单位/ml的10mM Tris-HCl缓冲液(pH8.9)，作为PCR用反应液。
根据常规方法从上述(2)中得到的各转化体(鸟分枝杆菌来源的基因组DNA的全基因组鸟枪法克隆)中纯化DNA。调制将该纯化的DNA(作为模板)悬浮添加到20μl PCR用反应液的溶液中，用作PCR用样品。使用该PCR样品，使用MJ Research公司的DNA热循环仪(DNA EnginePTC200)，在下述反应条件下进行30个循环的PCR。
PCR反应条件：
热变性：94℃，0.5分钟
退火：55℃，1分钟
聚合反应：75℃，0.5分钟。
将得到的PCR扩增产物纯化后，与固定缓冲液(终浓度3x SSC)混合。
调整使得点样的PCR扩增产物的终浓度为300ng/μL，使用将装置内的湿度设定为55％的点样用装置(GTMAS Stamp II；日本レ一ザ电子社制造)，在载玻片(CMT GAPS-II，Corning公司制造)上将上述得到的PCR产物进行了点样(点直径150～250μm)。将点样结束后的载玻片移入紫外交联仪(UV Stratalinker1800，Stratagene公司制造)，进行150mJ/cm2的UV照射，将PCR扩增产物(目的DNA)固定化在载玻片上，从而制作了微阵列(以鸟分枝杆菌来源的基因组DNA的全基因组鸟枪法克隆文库为材料的微阵列，合计1600个克隆)。
(4)目标基因组DNA的荧光色素标记
i)目标基因组DNA的荧光色素标记
利用BioPrime DNA labeling system(Invitrogen公司制)，进行目标基因组DNA的荧光色素标记。
首先，在上述(1)获得的鸟分枝杆菌来源的纯化基因组DNA 2μg中混合制品中的随机引物溶液20μL后，进行热变性(95℃、5分钟)处理，获得样品溶液。另外，从胞内分枝杆菌(ATCC 13950)中通过常规方法提取并纯化基因组DNA(对照用基因组DNA)，进行同样的处理，获得了样品溶液。
然后，向获得的各样品溶液中分别添加0.1M DTT 2μl、dATP/dCTP/dGTP(各5mM)的混合液2μl、2.5mM dTTP 0.8μl、5mMHa-dUTP 1.6μl、克列诺酶(40U/μL)1μl，加入去离子灭菌水使得总体积为50μL，于37℃进行3小时的延伸反应。将Microcon YM-30(Millipore公司生产)的超滤柱放置在附带的1.5ml管中，将上述得到的反应产物加到柱上，于14000转/分钟离心4分钟后，将浓缩液回收到微管中，用真空干燥离心机(CentriVap离心浓缩机；LABCONCO公司生产)完全干燥。
向干燥的上述反应产物中加10μl 50mM NaHCO3，并混合，于常温下静置2～3分钟(以下，称为“反应产物溶液”)。
另外，制备将1mg的Cy5(Amersham Bioscience有限公司)或Cy3(Amersham Bioscience有限公司)溶于105μl DMSO中的溶液(Cy-染色溶液Cy3、Cy-染色溶液Cy5)。将该Cy-染色溶液Cy510μl加到使用鸟分枝杆菌来源的基因组DNA获得的上述反应产物溶液中，同样于40℃温育60分钟(遮光)。另外，将Cy-染色溶液Cy3 10μl加入到使用对照用基因组DNA(胞内分枝杆菌来源的)获得的上述反应产物溶液中，于40℃温育60分钟(遮光)。
进而，再向温育后的各上述反应产物溶液中加入10μl的4M NH2OH(在即将使用前制备)，搅拌后进行15分钟的温育(遮光)，得到各种标记产物，即用Cy5标记鸟分枝杆菌来源的基因组DNA的标记产物、和用Cy3标记胞内分枝杆菌来源的基因组DNA的标记产物。
将Microcon YM-30(Millipore公司制)的超滤柱装到附带的1.5ml管中，将上述得到的各基因组DNA的标记产物加到柱上，于14000转/分钟离心4分钟后，将浓缩液回收到微管中，用真空干燥离心机(CentriVap离心浓缩机；LABCONCO公司生产)完全干燥。
ii)标记产物的片段化工序
对于上述(4)i)得到的干燥状态的各基因组DNA的标记产物，添加制备的40μL终浓度为0.04M Tris-醋酸(pH8.1)、0.1M醋酸钾、0.03M醋酸镁四水合物组成的溶液中，使其悬浮混合。然后于94℃加热处理15分钟，可得到100个碱基～300个碱基的各基因组DNA的标记产物的片段化生成物。
另外使用BcaBEST DNA聚合酶(タカラバイオ社制造)和rBst DNA聚合酶(EPICENTRE公司生产)研究标记效率(碱基/染料)，结果确认在Cy3标记的实验结果中，以胞内分枝杆菌来源的对照用基因组作为材料的标记产物(DNA片段)的约28碱基中掺入了1分子染料。另外，在Cy5标记的实验结果中，确认了以鸟分枝杆菌来源的基因组作为材料的标记产物(DNA片段)DNA的约36碱基中掺入了1分子染料。
将获得的各个Cy5标记产物溶液和Cy3标记产物溶液加到MicroconYM-10(Millipore公司生产)的超滤柱中，于14000转/分钟离心4分钟后，将浓缩液回收到同一微管中，用真空干燥离心机(CentriVap离心浓缩机；LABCONCO公司生产)使其完全干燥。然后向该微管中加以下试剂，使其悬浮混合，使标记产物的干燥物溶解。通过以上操作，获得了鸟分枝杆菌来源的基因组DNACy5标记产物的片段化生成物与胞内分枝杆菌来源的对照用基因组DNACy3标记产物的片段化生成物的Cy3Cy5标记产物混合溶液。
ArrayHyb杂交缓冲液(SIGMA公司制)：40μL
鲑鱼精DNA(10mg/mL)：0.5μL
甲酰胺：5μL
总共40～50μL
将获得的Cy3Cy5标记产物混合溶液于95℃温育5分钟，然后保持在70℃直到杂交。
(5)微阵列杂交
将上述(4)ii)制备的Cy3Cy5标记产物混合溶液都加在上述(3)的工序中获得的鸟分枝杆菌来源的基因组DNA的全基因组鸟枪法克隆文库的微阵列上，不带入气泡地盖上盖玻片。将它装到杂交盒中，置于用蒸馏水弄湿的无尘纸(kimtowel)上的Tupper中密闭，遮光下于65℃反应8小时以上，进行杂交。杂交后，通过于室温将微阵列连同盖玻片一起浸入到2×SSC-0.1％SDS溶液中，于溶液中轻轻地摇动微阵列，使盖玻片脱离。然后用1×SSC、0.03％SDS溶液(60℃)清洗10分钟，用0.2×SSC溶液(42℃)清洗10分钟，用0.05×SSC溶液(室温)清洗10分钟后，将微阵列迅速移到干的新管架上，立刻于800转/分钟离心5分钟使其干燥。
(6)荧光强度的测定：从信号检测至量化
使用荧光解读扫描仪GenePix 4000B(Axon Instruments Inc.制)，测定上述(5)中获得的经微阵列杂交处理的微阵列上的荧光强度。此时，为了分析Cy3标记产物和Cy5标记产物的竞争杂交的结果，检测2信道，即2ch(Cy3、Cy5)中的荧光。
荧光信号(荧光检测数据)的量化使用日立软件公司生产的DNASISTM-Array(DNA芯片表达图像分析软件)，按照软件的操作步骤，可进行斑点自动识别、背景计算、荧光强度比的标准化。另外，确定置信临界线，通过对该临界线以下区域的数据不处理，求出归一化的可置信的荧光强度(比)。
进而，基于微阵列上检测到的Cy3/Cy5的荧光强度比(Ratio)，按照常规方法，进行散点图分析。
也就是说，在某个微阵列上的斑点的Cy5相对于Cy3的荧光强度比高时，表示该斑点的DNA片段(PCR产物)与Cy5标记产物、即鸟分枝杆菌来源的基因组DNA更强杂交。另一方面，某个斑点的Cy5相对于Cy3的荧光强度比低时，表示该斑点的DNA片段对鸟分枝杆菌来源的基因组DNA的特异性低，观察到与Cy3标记产物、即胞内分枝杆菌来源的对照用基因组DNA的交叉反应(与胞内分枝杆菌来源的对照用基因组DNA杂交)。
通过该方法，计算微阵列的所有斑点的荧光强度比。然后，选择出荧光强度高，且Cy5对Cy3的荧光强度比高的斑点。
其结果是，选择了与鸟分枝杆菌来源的基因组DNA更强杂交的24个克隆作为候选克隆。
(7)候选克隆的碱基序列确定
然后，对上述(6)中选择的24个候选克隆，用下面的方法确定碱基序列。
也就是说，使用Big Dye Terminator试剂盒(Applied Biosystems公司生产)，根据制品说明书，按照以下的步骤进行序列分析。
候选DNA(候选克隆)：2μL(100ng)
M13 Primer M1：1μL(5pmol)
premix：8μL
在上述的混合物中加入去离子灭菌水使总体积达到20μL，使用MJResearch公司的DNA热循环仪(DNA Engine PTC200)于下面的反应条件下进行30个循环的PCR。
96℃2分钟→(96℃10秒→50℃5秒→60℃4分钟)×25→4℃
将得到的PCR产物经QIAGEN公司制的凝胶过滤柱纯化后，使用MJ Research公司制的测序仪(BaseStation)，按照仪器附带的操作说明书完成所有候选序列的序列(碱基序列)解读。
将得到的结果在数据库(NCBI BLAST和CHEMICAL ABSTRACT)中进行检索，结果可以推定在数据库上，候选的24个克隆的碱基序列都是未登录的新的序列。
实施例2.候选克隆13的鸟分枝杆菌特异性评价
(1)本发明的引物的合成
首先，基于上述的实施例1中确定的24个候选克隆中的候选克隆13的序列(碱基序列)分析结果，根据候选序列13，使用引物设计用的Webtool Primer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)设计PCR用的引物序列即“5’-AAGGCTCATGGCTACCAAGTC-3’”(序列号14。以下称为12Fw_1)、和“5’-TGGCCGAGTTCGTGATTCT-3’”(序列号15。以下称为12Rv_1)。
另外，根据序列的分析结果获得的候选克隆13的碱基序列为序列号4所示的序列。而且，将该克隆ID编号定为R11_2d(发明人命名。以下相同)。
然后，使用ABI公司DNA合成仪392型，用亚磷酰胺法合成设计的寡核苷酸。合成根据ABI公司手册进行。通过将寡核苷酸的氨水溶液于55℃加热过夜来进行各种寡核苷酸的去保护。
然后通过使用Pharmacia公司制FPLC进行阴离子交换柱层析来纯化合成的寡核苷酸。将该合成的寡核苷酸作为引物使用。
(2)DNA样品的制备
以下所示的各细菌的DNA样品分别用下述方法制备。
a：大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC11775)
b：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis；人型结核菌)(TMC102[H37Rv])
c：堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)(ATCC12478)
d：海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)(ATCC927)
e：猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)(ATCC25275)
f：瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)(ATCC19981)
g：戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)(ATCC14470)
h：苏尔加分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)(ATCC35799)
i：鸟分枝杆菌(TNC16741)
j：胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)(ATCC13950)
k：胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)(ATCC15754)
l：蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)(ATCC19250)
m：无色分枝杆菌(Mycobacterium nonchromogenicum)(ATCC19530)
n：地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)(ATCC15755)
o：次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)(ATCC23292)
p：偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)(ATCC6841)
q：龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)(ATCC35752)
r：脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)(ATCC19977)
s：外来分枝杆菌(Mycobacterium peregrinum)(ATCC14467)
首先，从Mycos Research，LLC获得结核分枝杆菌和鸟分枝杆菌的纯化基因组DNA，将其作为纯化DNA使用。
对于其他的细菌，从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得菌株，用下述方法提取并纯化DNA。细菌均为临床分离株，培养后，已经通过菌落的形状和现有的各种生物化学的试验等被鉴别。
即，对于分枝杆菌属细菌，首先，将小川培养基上的菌落悬浮于纯化水中，高压灭菌器处理(120℃、2大气压、20分钟)。然后经菌体的粉碎处理(通过直径2mm玻璃珠物理破碎)，离心分离，获得上清。使用Qiagen公司制的离子交换树脂型DNA提取纯化试剂盒Genomic-tip从得到的上清进行DNA的提取、纯化。
另外，对于大肠杆菌，根据大肠杆菌的DNA提取方法的常规方法，提取、纯化DNA。
将得到的各纯化DNA制备成最终1ng/μl(10mM Tris-HCl缓冲液、pH8.9)，作为DNA样品。
(3)实时PCR
使用上述(1)中设计并合成的12Fw_1作为正向引物，12Rv_1作为反向引物，进行下述PCR。
i)PCR用反应液的制备
制备含有上述(1)获得的引物12Fw_1和12Rv_1各300nM、SYBRTMGreen I(Molecular Probe公司商品名)原液的30倍稀释(最终浓度为原液的30000倍稀释)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1％胆酸钠、0.1％TritonX-100、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、和Taq DNA聚合酶(Nippon Gene制)40单位/ml的10mMTris-HCl(pH8.9)，作为PCR用反应液。
ii)实时PCR
使用上述(2)中制备的各分枝杆菌属细菌来源的或大肠杆菌来源的DNA样品作为PCR中扩增目标的模板DNA，如下所述，通过嵌入法进行实时PCR，进行荧光的定量监测。
首先，在上述(3)i)中调制的PCR用反应液20μl中添加上述(2)制备的DNA样品1μL(1ng)，作为PCR用样品。
将该PCR用样品加入96孔反应板(MicroAmp Optical 96-WellReaction Plate，Applied Bioscience日本公司制)的孔中，用TaqManTMPCR专用热循环仪·检测器(ABI 7500，Applied Bioscience日本公司制)进行实时PCR。即，95℃保温10分钟后，将95℃15秒、60℃1分钟的反应重复40个循环，测定与引物延伸产物的扩增量相关的嵌入SYBRTMGreen I的荧光强度。
另外，通过使用正向引物12_Fw1和反向引物12_Rv1的上述实时PCR，如果作为模板使用的DNA样品中存在候选克隆13的碱基序列，则预测鸟分枝杆菌基因组DNA中存在的候选克隆13的碱基序列中的序列号28所示的序列(150个碱基对)的DNA片段被复制，荧光被检测到。
(4)熔解曲线分析
对于对各DNA样品分别扩增了的产物，制成以引物延伸产物(双链DNA)的解离温度作为横轴，以荧光强度的1次微分(变化量)作为纵轴的熔解曲线，进行峰的检测。
(5)结果
就各DNA样品而言，所获得的熔解曲线分析的结果汇总于1个图中，示于图1。
正如根据图1的结果所明确的，使用本发明的引物12_Fw1和引物12_Rv1，进行在SYBR Green I存在下扩增的核酸的熔解曲线分析，其结果是只在使用鸟分枝杆菌来源的DNA样品作为模板时，可以确认核酸扩增的结果产生了荧光(图1：鸟分枝杆菌)，可判断为阳性。
与之相对，正如根据图1所明确的，使用鸟分枝杆菌以外的分枝杆菌属细菌和其它属的细菌大肠杆菌来源的DNA作为模板，使用相同引物的组合同样进行实时PCR时，无法确认相应的荧光(图1：其它种)，均可判断为阴性。
进而，如图1所明确的，使用鸟分枝杆菌来源的DNA样品作为模板时的熔解曲线分析的结果是获得了单一的明确的峰，由此判断进行的检测法是一种对鸟分枝杆菌特异性极高的检测方法。
根据以上内容，清楚了通过在PCR中使用本发明的寡核苷酸作为引物，可以特异性检测鸟分枝杆菌。而且，清楚了由于通过PCR等核酸扩增进行的检测可以期待高灵敏度，因此不需要分离细菌，就可以将临床材料直接用于检测，所以对于用以往的在细菌培养之后进行检测的方法要经培养数周的鸟分枝杆菌的检测，最长1天以内即可完成检测。
实施例3.其它候选克隆的鸟分枝杆菌特异性评价1
(1)本发明的引物的合成
基于实施例1中确定的候选的24个克隆中候选克隆08的序列(碱基序列)的分析结果，由该候选序列08，用引物设计用Web toolPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)，设计出用于PCR的引物序列，即“5’-cattgtgcgctgcttatgac-3’”(序列号6。以下称为003Fw_1)和“5’-gaagtgaatcggccttgct-3’”(序列号7。以下称为003Rv_1)。
另外，根据序列分析结果获得的候选克隆08的碱基序列用序列号1表示。而且，其克隆ID编号为R07_12q。
然后，用与实施例2(1)相同的仪器，用同样的方法合成并纯化所设计的寡核苷酸。使用该合成寡核苷酸作为本发明的引物。
用同样的方法，以其它候选克隆的碱基序列为基础，设计下述引物。
(i)以候选序列09(序列号2、克隆ID编号R07_7a)为基础，设计“5’-tgcaggtcgtgtagtcctc-3’”(序列号10、以下称为“007Fw_1”)和“5’-aaggtcgagttgcgcttg-3’”(序列号11、以下称为“007Rv_1”)。
(ii)以候选序列12(序列号3、克隆ID编号R11_12b)为基础，设计“5’-accagttgatgttgccttcc-3’”(序列号12、以下称为“11Fw_1”)和“5’-tctcgatcttcaccgtcagtt-3’”(序列号13、以下称为“11Rv_1”)。
(iii)以候选序列13(序列号4、克隆ID编号R11_2d)为基础，设计“5’-acctcaacccaggctacaga-3’”(序列号16、以下称为“12Fw_4”)和“5’-gaataagggaaagtgcatacga-3’”(序列号17、以下称为“12Rv_4”)。
(iv)以候选序列22(序列号5、克隆ID编号R16_6h)为基础，设计“5’-agggcgaacaaaacgatctac-3’”(序列号22、以下称为“04Fw_1”)和“5’-cccaaaacaacttctgcctct-3’”(序列号23、以下称为“04Rv_1”)。
然后，用与实施例2(1)同样的方法合成并纯化所设计的各寡核苷酸。使用该合成的寡核苷酸作为本发明的引物。
(2)DNA样品的制备
使用与实施例2(2)中使用的相同细菌，通过与实施例2(2)同样的方法制备DNA样品。
(3)实时PCR
上述(1)中设计、合成的引物除了采用下表6的组合以外，其余用与实施例2(3)同样的方法进行实时PCR。
表6
(4)熔解曲线分析
用与实施例2(4)同样的方法，对各DNA样品分别扩增的产物，制成以引物延伸产物(双链DNA)的解离温度作为横轴，以荧光强度的1次微分(变化量)作为纵轴的熔解曲线，进行峰的检测。
(5)结果
与实施例2一样，使用本发明的引物，进行了在SYBR Green I存在下扩增出的核酸的熔解曲线分析，其结果是，无论在使用表6记载的哪一种引物组合时，都只在使用鸟分枝杆菌来源的DNA样品作为模板进行实时PCR的情形下，可以确认核酸扩增的结果所产生的荧光，可判断为阳性。
与之相对，使用鸟分枝杆菌以外的分枝杆菌属细菌和其它属的细菌大肠杆菌来源的DNA作为模板，使用表2记载的哪一个相同引物组合进行相同的实时PCR时，都无法确认相应的荧光，可全部判断为阴性。
进而，使用鸟分枝杆菌来源的DNA样品作为模板时的熔解曲线分析的结果是，与实施例2的情况一样，获得了单一的明确的峰，由此清楚了进行的检测法是对鸟分枝杆菌的特异性极高的检测方法。
根据以上内容，清楚了通过在PCR中使用本发明的寡核苷酸作为引物，可以特异性检测鸟分枝杆菌。而且，清楚了由于通过PCR等核酸扩增进行的检测可以期待高灵敏度，因此不需要分离细菌，就可以将临床材料直接用于检测，所以对于用以往的在细菌培养之后进行检测的方法要经培养数周的鸟分枝杆菌的检测，最长1天以内即可完成检测。
实施例4.其它候选克隆的鸟分枝杆菌特异性评价2
(1)本发明的引物的合成
基于实施例1中确定的候选的24个克隆中候选克隆10的序列(碱基序列)的分析结果，由其候选序列10，用引物设计用Web toolPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)，设计出用于PCR扩增检测的引物序列、即“5’-caccggccaatccctaac-3’”(序列号67。以下称为RE10Fw_02)和“5’-agcgcgatgcgtagttcc-3’”(序列号68。以下称为RE10Rv_02)。
另外，根据序列分析结果获得的候选克隆10的碱基序列用序列号39表示。
然后，用与实施例2(1)相同的仪器，用同样的方法合成并纯化所设计的寡核苷酸。使用该合成的寡核苷酸作为本发明的引物。
用同样的方法，以其它候选克隆的碱基序列为基础，设计下述引物。
各候选序列的名称(编号)、该候选序列的碱基序列的序列号、基于该候选序列设计的引物的名称(发明人命名。以下相同。)和其碱基序列的序列号、在随后进行的PCR中使用的正向引物和反向引物的组合一并示于表7中。而且，将各候选序列的克隆ID编号示于候选序列名称下的()内。
表7
然后用与实施例2(1)同样的方法合成并纯化设计的各寡核苷酸。将该合成的寡核苷酸作为本发明的引物使用。
(2)DNA样品的制备
使用与实施例2(2)中使用的相同细菌，用同样的方法制备DNA样品。
(3)实时PCR
除按上述表7的组合使用上述(1)中制备的引物以外，其余用与实施例2(3)同样的方法进行实时PCR。
(4)熔解曲线分析
用与实施例2(4)同样的方法，对各DNA样品分别扩增的产物，制成以引物延伸产物(双链DNA)的解离温度作为横轴，以荧光强度的1次微分(变化量)作为纵轴的熔解曲线，进行峰的检测。
(5)结果
与实施例2同样地，使用本发明的引物，进行了在SYBR Green I存在下扩增出的核酸的熔解曲线分析，其结果是无论在使用表7记载的哪一种引物组合时，都只在使用鸟分枝杆菌来源的DNA样品作为模板进行实时PCR时，可以确认核酸扩增的结果所产生的荧光信号，可判断为阳性。
尤其是，使用下表8的引物组合的实时PCR获得了对鸟分枝杆菌的特异性高这样的结果。
表8
另外，鸟分枝杆菌104(Kathleen L.Horan等人，J.Clin.Microbiol.，44卷，3期，783-789页，2006)的全基因组序列于2006年12月12日公开于大学共同利用机关法人情报·システム研究机构国立遗传学研究所日本DNA Data Bank的DNA Data Bank of Japan(DDBJ)的网页上。
于是，将实施例4中使用的引物和实施例4中获得的延伸产物的碱基序列与该鸟分枝杆菌104的全基因组序列相比较，清楚了尤其是下表9中记载的引物对的延伸产物中存在与鸟分枝杆菌104的全基因组序列匹配的部位。由此提示，如果利用本发明中涉及的候选序列作为目标，则可进行鸟分枝杆菌种的广泛检测。
表9
根据以上内容，清楚了通过在PCR中使用本发明的寡核苷酸作为引物，可以特异性检测鸟分枝杆菌。而且，清楚了由于通过PCR等核酸扩增进行的检测可以期待高灵敏度，因此不需要分离细菌，就可以将临床材料直接用于检测，所以对于用以往的在细菌培养之后进行检测的方法要经培养数周的鸟分枝杆菌的检测，最长1天以内即可完成检测。
实施例5.最小检测灵敏度试验1
利用实时检测法，检测以候选序列13作为目标的情形的检测灵敏度。
(1)本发明的引物的合成
使用与实施例2(1)相同的仪器，通过同样的操作合成12Fw_1和12Rv_1的寡核苷酸。将其作为引物使用。
(2)DNA样品的制备
从Mycos Research公司(美国)购买高度纯化的鸟分枝杆菌来源的基因组DNA。将其溶解于10mM Tris-HCl缓冲液中，测定吸光度，测定样品中的DNA量。通过将获得的DNA量与以浓度已知的鸟分枝杆菌的基因组DNA作为样品以同样方式测定吸光度获得的测定值进行比较，确定样品中的基因组DNA量(基因组拷贝数)。
然后使用pH8.9的10mM Tris-HCl缓冲液，制备将DNA样品稀释为105，104，103，102，10，5，2.5个拷贝/μL的稀释系列样品，作为PCR用DNA样品。
(3)实时PCR
i)PCR用反应液的制备
使用含有上述(1)中获得的引物12_Fw1和引物12_Rv1各300nM、SYBRTM Green I(Molecular Probe公司商品名)原液的30倍稀释(最终浓度为原液的30000倍稀释)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1％胆酸钠、0.1％TritonX-100、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、和Taq DNA聚合酶(Nippon Gene制)40单位/ml的10mMTris-HCl(pH8.9)，作为PCR用反应液。
ii)实时PCR
使用上述(2)中制备的鸟分枝杆菌来源的PCR用DNA样品作为PCR中成为扩增目标的模板DNA，如下所述，通过嵌入法进行实时PCR，进行荧光的定量监测。
首先，在上述(3)i)中调制的PCR用反应液20μl中添加上述(2)制备的PCR用DNA样品1μL(1ng)，作为PCR用样品。
将该PCR用样品加入96孔反应板(MicroAmp Optical 96-WellReaction Plate，Applied Bioscience日本公司制)的孔中，用TaqManTMPCR专用热循环仪·检测器(ABI 7500，Applied Bioscience日本公司制)进行实时PCR。即，于95℃保温10分钟后，将95℃15秒、60℃1分钟的反应重复40循环，测定与引物延伸产物的扩增量相关的嵌入SYBRTMGreen I的荧光强度。
另外，对提供给测定的每块96孔反应板，利用测定中所使用的热循环仪的将相对荧光强度比数值化的功能，求出荧光强度。
(4)结果
由得到的实验数据，根据实时PCR法中运用的常规方法做成标准曲线。
也就是说，对各浓度的每份PCR用DNA样品，制成将SYBRTM GreenI的荧光强度(Rn、y轴)相对于PCR的循环数(x轴)作图的扩增曲线。然后，选择荧光强度呈指数函数扩增的Rn部分，引入阈值线(Thresholdline，Th)。将Th与各个PCR用DNA样品的荧光强度交叉点作为循环阈值(Threshold cycle；Ct)值。然后将Ct值(y轴)对所用的各PCR用DNA样品的基因组拷贝数(x轴，对数值)作图，可将对于各Ct得到的近似曲线作为标准曲线。得到的标准曲线示于图2。
y＝-3.173x+33.00
R2＝0.996
根据以上结果，可判定出首先由于通过实时PCR检测到荧光，因此如果通过使用本发明中涉及的寡核苷酸作为引物进行实时PCR，就可以检测鸟分枝杆菌。
另外，根据可以制成标准曲线，判断出通过使用本发明的引物和探针的实时PCR法，可能进行鸟分枝杆菌的定量。进而，由图2可知通过使用本发明的引物和探针的实时PCR法，即使作为初始量存在2.5个拷贝的鸟分枝杆菌的基因组DNA的条件下，鸟分枝杆菌的检测也是可能的。
进而，因为在使用实时PCR法的情况下，实时地监测其荧光强度，所以可以正确地定量模板DNA的初始量，可有效进行鸟分枝杆菌的检测。
实施例6.
利用实时PCR检测法，进行以新的候选序列13(候选克隆13的碱基序列，由序列号4所示的碱基序列组成)作为目标的情形时鸟分枝杆菌的检测。
(1)本发明的鸟分枝杆菌检测用引物的合成
使用与实施例2(1)相同的仪器，通过同样的操作合成并纯化12Fw_1(序列号14)和12Rv_1(序列号15)的寡核苷酸。
(2)PCR用DNA样品的制备
使用实施例2(2)中由鸟分枝杆菌菌体制备的DNA样品。首先，通过对该DNA样品测定吸光度而测定样品中的DNA量。通过将获得的DNA量与以浓度已知的鸟分枝杆菌的基因组DNA作为样品以同样方式测定吸光度获得的测定值进行比较，确定样品中的基因组DNA量(基因组拷贝数)。获得了108个拷贝/μl的基因组DNA。
然后使用pH8.9的10mM Tris-HCl缓冲液，制备将DNA样品稀释成105，104，103，102，10，0个拷贝/μL的稀释系列样品，作为PCR用DNA样品。
(3)实时PCR
i)PCR用反应液的制备
使用含有上述(1)中获得的引物12_Fw1和引物12_Rv1各300nM、SYBR Green I(Molecular Probe公司)原液的30倍稀释(x0.3浓缩、最终浓度为原液的30000倍稀释)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1％胆酸钠、0.1％TritonX-100、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、和Taq DNA聚合酶(Nippon Gene制)40单位/ml的10mMTris-HCl(pH8.9)，作为PCR用反应液。
ii)实时PCR
向上述(3)i)中获得的PCR用反应液20μl中添加上述(2)中制备的PCR用DNA样品1μL，作为PCR用样品。
将该PCR用样品加入到96孔反应板(MicroAmp Optical 96-WellReaction Plate，Applied Bioscience日本公司制)的孔中，用Taq ManTMPCR专用热循环仪·检测器(ABI7500、Applied Bioscience日本公司制)进行实时PCR。即，于95℃保温10分钟后，将95℃15秒、60℃1分钟的反应重复40个循环，测定与引物延伸产物的扩增量相关的嵌入SYBRGreen I的荧光强度。
另外，对提供给测定的每块96孔反应板，利用测定中所使用的热循环仪的将相对荧光强度比数值化的功能，求出荧光强度。
由得到的实验数据，根据实时PCR法中运用的常规方法，对各PCR用的每个DNA样品，用与实施例5(4)同样的方法，制作将报告色素的发光强度(Rn、y轴)对PCR的循环数(x轴)作图的扩增曲线。
结果用实线示于图3。
图3中，(1)～(6)分别表示以下情况。
(1)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为105个拷贝，进行以新的候选序列13作为目标的实时PCR的情况。
(2)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为104个拷贝，进行以新的候选序列13作为目标的实时PCR的情况。
(3)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为103个拷贝，进行以新的候选序列13作为目标的实时PCR的情况。
(4)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为102个拷贝，进行以新的候选序列13作为目标的实时PCR的情况。
(5)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为10个拷贝，进行以新的候选序列13作为目标的实时PCR的情况。
(6)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为0个拷贝，进行以新的候选序列13作为目标的实时PCR的情况。
比较例1.
使用公知的引物序列，进行以鸟分枝杆菌的19千道尔顿蛋白质基因区域作为目标时的鸟分枝杆菌的检测。
(1)公知的鸟分枝杆菌检测用引物的制备
基于特开平11-69999号(专利文献1、EP0887425)中公开的公知的鸟分枝杆菌检测用引物MAV19K_F1(序列“5’-cggctgttcgagtggcaacaagtc-3’”、序列号35)，设计引物序列“5’-ctgttcgagtggcaacaagtc-3’”(以下称为MAV19K_F1s。序列号33)，基于MAV19K_R1(序列“5’-ccgtcgatgatgaccttggtccc-3’”，序列号36)设计“5’-gtcgatgatgaccttggtcc-3’”(以下称为MAV19K_R1s。序列号34)。
这里，特开平11-69999号中公开的公知的鸟分枝杆菌检测用引物MAV19K_F1和MAV19K_R1不直接用于以下的PCR中的理由如下。
即，实时PCR中使用的引物并不优选碱基序列过长的引物。但是，特开平11-69999号申请之时，并没有建立实时PCR的技术，因此我们认为特开平11-69999号中公开的引物MAV19K_F1和MAV19K_R1在用于实时PCR时稍长，而且，将该碱基序列原样使用于实时PCR时，引物之间发生退火而形成引物二聚物，其结果是发生引起PCR扩增效率降低等问题的可能性高。
因此，为了获得用于在实时PCR中使用的合适长度的引物，本发明人设计了削除特开平11-69999号中公开的引物MAV19K_F1的碱基序列的5’侧的3个碱基“cgg”的序列MAV19K_F1s和削除MAV19K_R1的5’侧的2个碱基“cc”的序列MAV19K_R1s。
使用与实施例2(1)相同的仪器，通过同样的操作合成并纯化所设计的MAV19K_F1s(序列号33)和MAV19K_R1s(序列号34)的寡核苷酸。
(2)PCR用DNA样品的制备
使用与实施例6中制备的样品同样的样品。
(3)实时PCR
除了使用上述(1)中制备的MAV19K_F1s作为正向引物，使用MAV19K_R1s作为反向引物之外，用与实施例6(3)同样の方法，进行实时PCR。
由得到的实验数据，根据实时PCR法中运用的常规方法，对各PCR用DNA样品，用实施例5(4)同样的方法，制成将报告色素的发光强度(Rn、y轴)相对于PCR循环数(x轴)作图的扩增曲线。
结果用波浪线示于图3。
图3中，(7)～(12)分别表示以下情况。
(7)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为105个拷贝，进行以鸟分枝杆菌的19千道尔顿蛋白质基因区域作为目标的实时PCR的情况。
(8)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为104个拷贝，进行以鸟分枝杆菌的19千道尔顿蛋白质基因区域作为目标的实时PCR的情况。
(9)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为103个拷贝，进行以鸟分枝杆菌的19千道尔顿蛋白质基因区域作为目标的实时PCR的情况。
(10)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为102个拷贝，进行以鸟分枝杆菌的19千道尔顿蛋白质基因区域作为目标的实时PCR的情况。
(11)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为10个拷贝，进行以鸟分枝杆菌的19千道尔顿蛋白质基因区域作为目标的实时PCR的情况。
(12)PCR用DNA样品中的初始DNA的浓度为0个拷贝，进行以鸟分枝杆菌的19千道尔顿蛋白质基因区域作为目标的实时PCR的情况。
(4)结果
根据以上结果，在使用本发明的引物12Fw_1和12Rv_1，以新的候选序列13作为目标进行鸟分枝杆菌的检测的情况(实施例6)，与使用特开平11-69999号中公开的公知引物、以具有公知的鸟分枝杆菌所具有的序列作为目标的情况下(比较例1)，将通过实时PCR进行的鸟分枝杆菌检测法进行比较。
根据图3的结果，清楚地了解到，在以任意一种DNA样品(105，104，103，102，10，0个拷贝/μL的稀释系列)作为对象时，实施例6中获得的扩增曲线的上升与比较例1中获得的扩增曲线的上升相比较，早4个循环左右。由此，可以考察实施例6的方法为比比较例1的方法高约10～20倍左右扩增效率的检测法。
根据以上内容，清楚了使用本发明的引物、以本发明的新的候选序列13作为目标的检测方法，与使用公知的特开平11-69999号中记载的引物、以公知的序列作为目标时相比较，是一种核酸扩增效率特别优异的检测法。
实施例7.鸟分枝杆菌基因组来源的克隆的选择2
(1)鸟分枝杆菌来源的DNA样品的制备
首先，将鸟分枝杆菌的标准株鸟分枝杆菌IID 585(由日本细菌学会发放。来自国立大学法人东京大学医科学研究所感染症国际中心病原微生物资源室)悬浮于纯化水中，高压灭菌器处理(120℃·2气压、20分钟)。然后经菌体的粉碎处理(通过直径2mm玻璃珠物理破碎)，离心分离，获得上清。使用Qiagen公司制的离子交换树脂型DNA提取纯化试剂盒Genomic-tip从得到的上清进行DNA的提取、纯化，获得鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium IID 585)来源的纯化基因组DNA。
将获得的鸟分枝杆菌来源的纯化基因组DNA调制成最终400ng/μl(10mM Tris-HCl缓冲液、pH8.9)，将其作为“鸟分枝杆菌来源的DNA样品”使用。
(2)全基因组鸟枪法文库的制作和微阵列的制作
以上述(1)得到的鸟分枝杆菌来源的DNA样品24μg作为材料，用与上述实施例1(2)～(3)相同的试剂，用同样的方法制作全基因组鸟枪法文库、微阵列(鸟分枝杆菌来源的基因组的全基因组鸟枪法克隆文库的微阵列，总计1000个克隆)。
(3)目标基因组DNA的荧光色素标记
i)目标基因组DNA的荧光色素标记
利用BioPrime DNA labeling system(Invitrogen公司制)，进行目标基因组DNA的荧光色素标记。
首先，在上述(1)获得的鸟分枝杆菌来源的纯化基因组DNA 2μg中混合制品中的随机引物溶液20μL后，进行热变性(95℃、5分钟)处理，获得样品溶液。另外，从胞内分枝杆菌(ATCC 13950)中通过常规方法提取并纯化基因组DNA(对照用基因组DNA)，进行同样的处理，获得了样品溶液。
然后，在获得的各样品溶液中各添加0.1M DTT 2μl、dATP/dCTP/dGTP(各5mM)的混合液2μl、2.5mM dTTP 0.8μl、5mMHa-dUTP 1.6μl、克列诺酶(40U/μL)1μl，加入去离子灭菌水使得总体积为50μL，于37℃进行3小时的延伸反应。将Microcon YM-30(Millipore公司生产)的超滤柱装到附带的1.5ml管中，将上述得到的反应产物加到柱上，于14000转/分钟离心4分钟后，将浓缩液回收到微管中，用真空干燥离心机(CentriVap离心浓缩机；LABCONCO公司生产)完全干燥。
向得到的干燥反应产物中加10μl 50mM NaHCO3，并混合，于常温下静置2～3分钟(以下，称为“反应产物溶液”。)。
另外，制备将1mg的Alexa647(Invitrogen公司制)或Alexa555(Invitrogen公司制)溶于105μl DMSO的溶液(染色溶液Alexa647、染色溶液Alexa555)。将该染色溶液Alexa647 10μl加到使用鸟分枝杆菌来源的基因组DNA获得的上述反应产物溶液中，于40℃温育60分钟(遮光)。另外，将染色溶液Alexa555 10μl加入到用对照用基因组DNA(胞内分枝杆菌来源的)获得的上述反应产物溶液中，同样于40℃温育60分钟(遮光)。
进而，再向温育后的各上述反应产物溶液中加入10μl的4M NH2OH(在即将使用前制备)，搅拌后进行15分钟的温育(遮光)，得到各种标记产物、即用Alexa647标记的鸟分枝杆菌来源的基因组DNA的标记产物，和用Alexa555标记的胞内分枝杆菌来源的基因组DNA的标记产物。
将Microcon YM-30(Millipore公司制)的超滤柱装到附带的1.5ml管中，将上述得到的各基因组DNA的标记产物加到柱上，于14000转/分钟离心4分钟后，将浓缩液回收到微管中，用真空干燥离心机(CentriVap离心浓缩机；LABCONCO公司生产)完全干燥。
ii)标记产物的片段化工序
对于上述(3)i)中获得的干燥状态的各基因组DNA的标记产物，添加制备的40μL终浓度为0.04M Tris-醋酸(pH8.1)、0.1M醋酸钾、0.03M醋酸镁四水合物组成的溶液，使其悬浮混合。然后于94℃加热处理15分钟，可得到100个碱基～300个碱基的各基因组DNA的标记产物的片段化生成物。
另外，使用间接标记法研究标记效率(碱基/染料)的结果是，确认了对于Alexa647是约100～200碱基中整合了1分子染料。而且，确认了对于Alexa555是约150碱基中整合了1分子染料。
将获得的各Alexa647标记产物溶液和Alexa555标记产物溶液加到Microcon YM-10(Millipore公司生产)的超滤柱中，于14000转/分钟离心4分钟后，将浓缩液回收到同一微管中，用真空干燥离心机(CentriVap离心浓缩机；LABCONCO公司生产)使其完全干燥。然后向该微管中加以下试剂，使悬浮混合，使标记产物的干燥物溶解。通过以上操作，获得了鸟分枝杆菌来源的基因组DNA Alexa647标记产物的片段化生成物和胞内分枝杆菌来源的对照用基因组DNA Alexa555标记产物的片段化生成物的Alexa555Alexa647标记产物混合溶液。
ArrayHyb杂交缓冲液(SIGMA公司制)：40μL
鲑鱼精DNA(10mg/mL)：0.5μL
甲酰胺：5μL
总共40～50μL
将获得的Alexa555Alexa647标记产物混合溶液于95℃温育5分钟，保存在70℃直至杂交。
(4)微阵列杂交
除使用上述(3)的工序获得的Alexa555Alexa647标记产物混合溶液以外，用与上述实施例1(5)同样的方法，进行Alexa555标记产物和Alexa647标记产物与上述(2)中获得的鸟分枝杆菌来源的基因组DNA的全基因组鸟枪法克隆文库的微阵列的竞争杂交。
(5)荧光强度的测定：从信号检测至量化
使用荧光解读扫描仪GenePix 4000B(Axon Instruments Inc.制)，测定上述(4)中获得的经微阵列杂交处理的微阵列上的荧光强度。此时，为了分析Alexa555标记产物和Alexa647标记产物的竞争杂交的结果，检测2信道，即2ch(Alexa555、Alexa647)的荧光。
另外，使用上述实施例1(6)同样的装置，对获得的荧光信号(荧光检测数据)进行量化。
再基于微阵列上检测到的Alexa555/Alexa647的荧光强度比(Ratio)，按照常规方法，进行散点图分析。
此时，也就是说，在微阵列上的某个斑点的Alexa647相对于Alexa555的荧光强度比高时，表示该斑点的DNA片段(PCR产物)与Alexa647标记产物、即鸟分枝杆菌来源的基因组DNA更强杂交。另一方面，某个斑点的Alexa647相对于Alexa555的荧光强度比低时，表示该点的DNA片段对鸟分枝杆菌来源的基因组DNA的特异性低，观察到与Alexa555标记产物、即胞内分枝杆菌来源的对照用基因组DNA的交叉反应(与胞内分枝杆菌来源的对照用基因组DNA杂交)。
通过该方法，计算微阵列的所有斑点的荧光强度比。然后，选择出荧光强度高，且Alexa647相对于Alexa555的荧光强度比高的斑点。
(6)使用其它鸟分枝杆菌株的二次检测
用记载于下表10中的各种鸟分枝杆菌菌株(由日本细菌学会发放)，用与上述(1)同样的方法，由各菌株制备“鸟分枝杆菌来源的DNA样品”。
表10
| 种 | 菌株 | 来源 |
| 鸟分枝杆菌 | TMC16741 | MYCOS Research公司 |
| 鸟分枝杆菌 | IID 585(型) | 东京大学医科学研究所 |
| 鸟分枝杆菌 | RIMD 1312004 | 大阪大学微生物病研究所 |
| 鸟分枝杆菌 | GTC M3234 | 岐阜大医学部 |
| 鸟分枝杆菌 | GTC M1989-6 | 岐阜大医学部 |
| 鸟分枝杆菌 | GTC 01937 | (财)化学及血清疗法研究所 |
| 鸟分枝杆菌 | GTC M3276 | 岐阜大医学部 |
| 鸟分枝杆菌 | GTC M91-126 | 岐阜大医学部 |
| 鸟分枝杆菌 | GTC M91-130 | 岐阜大医学部 |
| 鸟分枝杆菌 | GTC M1988-37 | 岐阜大医学部 |
然后，用与上述(3)i)～ii)同样的方法，获得用Alexa647标记的各鸟分枝杆菌菌株来源的基因组DNA的标记产物，获得其片段化产物。
另外，用与上述(3)i)～ii)同样的方法，获得用Alexa555标记的各胞内分枝杆菌菌株来源的基因组DNA的标记产物，获得其片段化产物。
然后，通过与上述(3)i)～ii)同样的方法，获得各鸟分枝杆菌菌株来源的基因组DNA Alexa647标记产物的片段化生成物和胞内分枝杆菌来源的对照用基因组Alexa555标记产物的片段化生成物的Alexa555Alexa647标记产物混合溶液。
使用获得的各Alexa555Alexa647标记产物混合溶液，按上述(4)～(5)同样的方法进行Alexa647标记产物和Alexa555标记产物与实施例7(2)中获得的鸟分枝杆菌来源的基因组的全基因组鸟枪法克隆的微阵列的竞争杂交、和荧光强度的测定。
进而，用与上述(5)同样的方法，基于微阵列上检测到的Alexa555/Alexa647的荧光强度比(Ratio)，按照常规方法，进行散点图分析。
基于所得分析结果，用与上述(5)同样的方法，计算微阵列所有斑点的荧光强度比，选择出荧光强度高，且Alexa647相对于Alexa555的荧光强度比高的斑点。
(7)候选克隆的选择
基于以上结果，作为在选择作为共有序列的候选方面的一个标准，从鸟分枝杆菌来源的基因组DNA的全基因组鸟枪法克隆的微阵列上，选择通过上述(6)的检测与这些鸟分枝杆菌菌株杂交、且通过上述(5)的检测与胞内分枝杆菌不杂交的斑点。其结果是选择了7个斑点(候选克隆)。
(8)候选克隆的碱基序列确定
然后，对上述(7)中选择的7个候选克隆，用与实施例1(7)相同的方法进行序列分析，进行各个克隆的碱基序列测定。
确定的各候选克隆的候选序列的名称、克隆ID编号、克隆的大小(碱基数)和碱基序列的序列号汇总示于下表11中。
表11
实施例8.候选序列D的鸟分枝杆菌株间保守性评价1
(1)本发明的引物的合成
基于实施例7(8)中确定的候选克隆中候选克隆D的序列(碱基序列)的各分析结果，根据该候选序列D，使用引物设计用Web toolPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)设计出用于PCR的引物序列、即“5′-AGTGGGCAACAATCCAAGAG-3′”(序列号159、以下称为“Mac_12Fw01”。)、和“5′-CCCGACACAACGAGGTTT-3′”(序列号160，以下称为“Mac_12Rv01”)。
然后，使用ABI公司DNA合成仪392型，用亚磷酰胺法合成设计的寡核苷酸。合成方法根据ABI公司手册。通过将寡核苷酸的氨水溶液于55℃加热过夜实施各种寡核苷酸的去保护。
然后通过使用Pharmacia公司制FPLC进行阴离子交换柱层析，纯化合成的寡核苷酸。使用该合成寡核苷酸作为本发明的引物。
(2)鸟分枝杆菌菌株来源的DNA样品的制备
按照实施例2(2)的分枝杆菌属细菌的制备方法，处理上述表10中记载的鸟分枝杆菌菌株，进行DNA的提取和纯化。将得到的各纯化DNA制备成最终1ng/μl(10mM Tris-HCl缓冲液、pH8.9)，作为各鸟分枝杆菌菌株来源的DNA样品。
(3)实时PCR
使用上述(1)中设计并合成的Mac_12Fw01作为正向引物，Mac_12Rv01作为反向引物，进行下述PCR。
i)PCR用反应液的制备
制备含上述(1)中获得的引物Mac_12Fw01和Mac_12Rv01各300nM、SYBRTM Green I(Molecular Probe公司商品名)原液的30倍稀释(最终浓度为原液的30000倍稀释)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1％胆酸钠、0.1％TritonX-100、dATP、各0.2mM的dCTP、dGTP、dTTP、和Taq DNA聚合酶(Nippon Gene制)40单位/ml的10mMTris-HCl(pH8.9)，作为PCR用反应液。
ii)实时PCR
使用上述(2)中制备的各鸟分枝杆菌菌株来源的DNA样品作为PCR中扩增目标的模板DNA，如下所述，通过嵌入法进行实时PCR，进行荧光的定量监测。
首先，在上述(3)i)中调制的PCR用反应液20μl中添加上述(2)制备的DNA样品1μL(1ng)，作为PCR用样品。
将该PCR用样品加入96孔反应板(MicroAmp Optical 96-WellReaction Plate，Applied Bioscience日本公司制)的孔中，用TaqManTMPCR专用热循环仪·检测器(ABI 7500，Applied Bioscience日本公司制)进行实时PCR。即，于95℃保温10分钟后，将95℃15秒、60℃1分钟的反应重复40个循环，测定与引物延伸产物的扩增量相关的嵌入SYBRTMGreen I的荧光强度。
而且，通过使用正向引物Mac_12Fw01和反向引物Mac_12Rv01的上述的实时PCR，如果作为模板使用的各鸟分枝杆菌株的基因组DNA中存在候选克隆D的碱基序列，则预测候选克隆D的碱基序列中的序列号194所示的序列(193个碱基)的DNA片段被复制，荧光被检测到。
(4)熔解曲线分析
对于对各DNA样品分别扩增了的产物，制成以引物延伸产物(双链DNA)的解离温度作为横轴，以荧光强度的1次微分(变化量)作为纵轴的熔解曲线，进行峰的检测。
(5)结果
就各DNA样品而言，所获得的熔解曲线分析的结果汇总于1个图中，示于图4。
如根据图4结果所清楚的，使用本发明的引物Mac_12Fw01和引物Mac_12Rv01，使用自10种鸟分枝杆菌株获得的各DNA样品作为模板进行实时PCR，将在SYBR Green I存在下扩增的核酸进行熔解曲线分析，其结果是在任意一种情况下都可以确认核酸扩增的结果产生了荧光信号(图4：鸟分枝杆菌)。而且，获得的信号的峰均为单一峰。而且峰的位置几乎重叠。
另外，使用与上述(1)～(4)同样的方法，以从鸟分枝杆菌以外的分枝杆菌属菌(M.chimaera和M.velatum)获得的DNA样品作为模板，使用相同引物进行PCR。此时，无法确认核酸扩增的结果产生的荧光信号(图4：其它种)。
根据以上内容，清楚了如果使用本发明的引物Mac_12Fw01和引物Mac_12Rv01进行PCR，则只要存在上述10种鸟分枝杆菌株中的任意一种就可以检测，并可以进行对鸟分枝杆菌属特异性的检测。而且，由此还提示作为目标的候选序列D为鸟分枝杆菌的共有序列的可能性高。
实施例9.其它候选克隆的鸟分枝杆菌株间碱基序列的保守性评价
基于实施例7(8)中确定的候选克隆A～G的序列(碱基序列)的分析结果，根据各候选克隆的候选序列A～G，使用引物设计用的Web toolPrimer3(Whitehead Institute for Biomedical Research.)分别设计PCR扩增用的引物序列。
候选序列的名称和该候选序列的碱基序列的序列号、以该候选序列为基础设计的引物的名称(发明者命名)和其碱基序列、以及在随后进行的PCR中使用的正向引物和反向引物的组合汇总于表12中。
表12
然后用与实施例8(1)同样的方法合成并纯化设计的各寡核苷酸。将该合成的寡核苷酸作为本发明的引物使用，用表12记载的正向引物和反向引物的组合，通过与实施例8(2)～(4)同样的方法，进行DNA样品的制备、实时PCR、熔解曲线分析。
其结果是，使用任一引物组合进行实时PCR时都获得了与实施例8的图4同样的熔解曲线。也就是说，使用表12记载的引物组合，使用自10种鸟分枝杆菌株获得的各个DNA样品作为模板进行实时PCR。进行SYBR Green I存在下扩增的核酸的熔解曲线分析。其结果是，在任一情况下都能确认核酸扩增的结果所产生的荧光信号。所得到信号的峰均为单一峰。而且峰的位置几乎重叠。
另外，与实施例8一样，使用由鸟分枝杆菌以外的分枝杆菌属菌(M.chimaera和M.velatum)获得的DNA样品作为模板，使用相同引物进行PCR。此时，无法确认核酸扩增的结果产生的荧光信号。
根据以上内容，清楚了如果使用表12中记载的本发明的引物进行PCR，则只要存在上述10种鸟分枝杆菌株中的任意一种就可以检测，并可以进行对鸟分枝杆菌属特异性的检测。
也就是说，如果使用本发明的引物，就可以在一次测定中将多个血液型的鸟分枝杆菌与其它分枝杆菌属细菌区分，进行检测。
而且，由此还提示作为目标的候选序列A～G均为鸟分枝杆菌的共有序列的可能性高。
实施例10.候选克隆D的鸟分枝杆菌特异性评价
(1)引物的合成
使用与实施例8(1)相同的仪器，通过同样的操作，合成并纯化Mac_12Fw01和Mac_12Rv01的寡核苷酸。
(2)DNA样品的制备
使用下文所示的与实施例2使用的相同细菌，获得了通过与实施例2(2)相同的方法制备的DNA样品。
a：大肠杆菌(Escherichia coli)(ATCC11775)
b：结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis；人型结核菌)(TMC102[H37Rv])
c：堪萨斯分枝杆菌(Mycobacterium kansasii)(ATCC12478)
d：海分枝杆菌(Mycobacterium marinum)(ATCC927)
e：猿分枝杆菌(Mycobacterium simiae)(ATCC25275)
f：瘰疬分枝杆菌(Mycobacterium scrofulaceum)(ATCC19981)
g：戈氏分枝杆菌(Mycobacterium gordonae)(ATCC14470)
h：苏尔加分枝杆菌(Mycobacterium szulgai)(ATCC35799)
i：鸟分枝杆菌(IIID585)
j：胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)(ATCC13950)
k：胃分枝杆菌(Mycobacterium gastri)(ATCC15754)
l：蟾分枝杆菌(Mycobacterium xenopi)(ATCC19250)
m：无色分枝杆菌(Mycobacterium nonchromogenicum)(ATCC19530)
n：地分枝杆菌(Mycobacterium terrae)(ATCC15755)
o：次要分枝杆菌(Mycobacterium triviale)(ATCC23292)
p：偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)(ATCC6841)
q：龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)(ATCC35752)
r：脓肿分枝杆菌(Mycobacterium abscessus)(ATCC19977)
s：外来分枝杆菌(Mycobacterium peregrinum)(ATCC14467)
(3)实时PCR
除了用上述(1)中设计、合成的引物Mac_12Fw01和Mac_12Rv01以外，用与实施例2(3)同样的方法进行实时PCR。
(4)熔解曲线分析
用与实施例2(4)同样的方法，对各DNA样品分别扩增的产物，制成以引物延伸产物(双链DNA)的解离温度作为横轴，以荧光强度的1次微分(变化量)作为纵轴的熔解曲线，进行峰的检测。
(5)结果
对各DNA样品获得的熔解曲线分析的结果汇总于一张图中，示于图5。
如根据图5的结果所清楚的，使用本发明的引物Mac_12Fw01和Mac_12Rv01，进行在SYBR Green I存在下扩增的核酸的熔解曲线分析，其结果是只在使用鸟分枝杆菌来源的DNA样品作为模板进行实时PCR时，可以确认核酸扩增的结果产生了荧光信号(图5：鸟分枝杆菌)，可判断为阳性。
与之相对，如根据图5所清楚的，使用鸟分枝杆菌以外的分枝杆菌属细菌和其它属的细菌大肠杆菌来源的DNA作为模板，使用相同的引物组合同样进行实时PCR时，无法确认相应的荧光信号(图5：其它种)，均可判断为阴性。
进而，如图5所清楚的，使用鸟分枝杆菌来源的DNA样品作为模板时的熔解曲线分析的结果是获得了单一的明确的峰，由此判断进行的检测法是一种对鸟分枝杆菌特异性极高的检测方法。
根据以上内容，清楚了通过在PCR中使用本发明的寡核苷酸作为引物，可以特异地检测鸟分枝杆菌。而且，清楚了由于通过PCR等核酸扩增进行的检测可以期待高灵敏度，因此不需要分离细菌，就可以将临床材料直接用于检测，所以对于用以往的在细菌培养之后进行检测的方法要经培养数周的鸟分枝杆菌的检测，最长1天以内即可完成检测。
实施例11.其它候选克隆的鸟分枝杆菌特异性评价2
(1)本发明的引物的合成
使用与实施例8(1)相同的仪器，通过同样的操作，合成并纯化上述表12中记载的Mac_12Fw01和Mac_12Rv01以外的寡核苷酸。
使用该合成的寡核苷酸作为引物。
(2)DNA样品的制备
使用与实施例10中使用的相同细菌，用与实施例2(2)同样的方法制备DNA样品。
(3)实时PCR
除了按上述表12的组合用上述(1)中设计、合成的引物以外，用与实施例2(3)同样的方法进行实时PCR。
(4)熔解曲线分析
用与实施例2(4)同样的方法，对各DNA样品分别扩增的产物，制成以引物延伸产物(双链DNA)的解离温度作为横轴，以荧光强度的1次微分(变化量)作为纵轴的熔解曲线，进行峰的检测。
(5)结果
与实施例10的结果同样，使用本发明的引物，进行SYBR Green I存在下扩增的核酸的熔解曲线分析，其结果是，在使用表12记载的任意引物组合时，只有在使用鸟分枝杆菌来源的DNA样品作为模板进行实时PCR时，可以确认核酸扩增的结果产生的荧光信号，可判断为阳性。
与之相对，使用鸟分枝杆菌以外的分枝杆菌属细菌和其它属的细菌大肠杆菌来源的DNA作为模板，使用表12记载的任意相同引物组合进行同样的实时PCR时，均无法确认相应的荧光信号，均可判断为阴性。
进而，使用鸟分枝杆菌来源的DNA样品作为模板时的熔解曲线分析的结果是与实施例10的情况一样，获得了单一的明确的峰，由此判断进行的检测法是一种对鸟分枝杆菌特异性极高的检测方法。
根据以上内容，清楚了通过在PCR中使用本发明的寡核苷酸作为引物，可以特异性检测鸟分枝杆菌。而且，清楚了由于通过PCR等核酸扩增进行的检测可以期待高灵敏度，因此不需要分离细菌，就可以将临床材料直接用于检测，所以对于用以往的在细菌培养之后进行检测的方法要经培养数周的鸟分枝杆菌的检测，最长1天以内即可完成检测。
实施例12.最小检测灵敏度试验2
利用实时PCR检测法，进行以候选序列D作为目标时的检测灵敏度的检测。
(1)本发明的鸟分枝杆菌检测用引物的制备
使用与实施例2(1)相同的仪器，通过同样的操作，合成并纯化Mac_12Fw01和Mac_12Rv01的寡核苷酸。将其作为引物使用。
(2)DNA样品的制备
使用实施例7(1)中从鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium IID 585)中制备的DNA样品。
通过测定该DNA样品的吸光度而测定样品中的DNA量。通过将获得的DNA量与以浓度已知的鸟分枝杆菌的基因组DNA作为样品以同样方式测定吸光度获得的测定值和量进行比较、确定样品中的基因组DNA量(基因组拷贝数)。获得了108个拷贝/μl的基因组DNA。
然后使用pH8.9的10mM Tris-HCl缓冲液，制备将DNA样品稀释为105，104，103，102，10，5个拷贝/μL的稀释系列，作为PCR用DNA样品。
(3)实时PCR
i)PCR用反应液的制备
制备含有上述(1)中获得的引物Mac_12Fw1和引物Mac_12Rv1各300nM、SYBR Green I(Molecular Probe公司)原液的30倍稀释(最终浓度为原液的30000倍稀释)、1.5mM MgCl2、80mM KCl、500μg/ml BSA、0.1％胆酸钠、0.1％TritonX-100、各0.2mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP、和Taq DNA聚合酶(Nippon Gene制)40单位/ml的10mMTris-HCl(pH8.9)，作为PCR用反应液。
ii)实时PCR
向上述(3)i)中制备的PCR用反应液20μl中添加上述(2)中制备的PCR用DNA样品1μL，作为PCR用样品。
将该PCR用样品加入到96孔反应板(MicroAmp Optical 96-WellReaction Plate，Applied Bioscience日本公司制)的孔中，用Taq ManTMPCR专用热循环仪·检测器(ABI7500，Applied Bioscience日本公司制)进行实时PCR。即，于95℃保温10分钟后，将95℃15秒、60℃1分钟的反应重复40个循环，测定与引物延伸产物的扩增量相关的嵌入SYBRGreen I的荧光强度。
另外，对提供给测定的每块96孔反应板，利用测定中所使用的热循环仪的将相对荧光强度比数值化的功能，求出荧光强度。
(4)结果
由得到的实验数据，根据实时PCR法中运用的常规方法，对每份各PCR用DNA样品，用与实施例5(4)同样的方法，制成将报告色素的发光量(Rn、y轴)相对于PCR的循环数(x轴)作图的扩增曲线。获得的标准曲线示于图6。
然后，根据获得的扩增曲线，通过下述方法，制成标准曲线。
也就是说，选择获得的扩增曲线(图6)的荧光强度呈指数函数扩增的Rn部分，引入阈值线(Threshold line；Th)。将Th和各个PCR用DNA样品的荧光强度交叉点作为循环阈值(Threshold cycle；Ct)值。然后将Ct值(y轴)对所用的各PCR用DNA样品的基因组拷贝数(x轴，对数值)作图，可将对于各Ct得到的近似曲线作为标准曲线。得到的标准曲线示于图7。
y＝-3.272x+34.00
R2＝0.994
根据以上结果，可判定出首先由于通过实时PCR检测到荧光，因此通过使用本发明中涉及的寡核苷酸作为引物，如果进行实时PCR就可以检测鸟分枝杆菌。
另外，根据可以制成标准曲线，判断出通过使用本发明的引物和探针的实时PCR法，可能进行鸟分枝杆菌的定量。进而，由图*可知通过使用本发明的引物和探针的实时PCR法，即使作为初始量存在5个拷贝鸟分枝杆菌的基因组DNA的条件下，鸟分枝杆菌的检测也是可能的。
另外，通过本方法进行的PCR的扩增效率计算上达到102.2％，能够确认为高反应性。
进而，使用上述表12中记载的其它的引物组合进行同样的实验，其结果是可以获得几乎相同的结果。根据以上内容，清楚了通过以候选序列A～G作为目标进行实时PCR，可以进行鸟分枝杆菌株的检测和定量。
产业上的可利用性
通过使用本发明的引物或/和探针的鸟分枝杆菌的检测方法，可以远远比现有的通过菌的培养检查等来鉴定菌种的方法迅速且高精确度地进行鸟分枝杆菌的检测。另外，通过用本发明的检测方法进行鸟分枝杆菌的检测，与现有的通过使用引物或/和探针的PCR法的诊断方法比较，可以排除诊断上的假阳性，能更高精确度地进行鸟分枝杆菌的检测和诊断。进而，通过使用本发明的检测方法，发挥也能够进行鸟分枝杆菌菌体的定量这样的效果。
而且，根据本发明的检测方法，可起到能够在一次测定中检测多个血清型的鸟分枝杆菌，可以进行迅速且简便的鸟分枝杆菌的检测、诊断这样的效果。
序列表
<110>和光纯药工业株式会社
<120>鸟分枝杆菌检测用引物和探针、以及使用它们检测鸟分枝杆菌的方法
<130>F1724WAKOPCT
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<151>2006-12-18
<150>JP2006-356189
<151>2006-12-28
<160>205
<170>PatentIn版本3.1
<210>1
<211>981
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)
<400>1
cggttacgtt tgaccggggc atgcccgtca acagcacgtt cggccttggc cacctgctca 60
tcgatccccc gcagcgtgcg ccgggcccgg tcatggcggt actggtagtg gatgatccgg 120
tccgggatgc cgcgggtttt ctcgccgctg gttgatggcc agggctgggt gagcaccagg 180
ccgtcgggga tcgcctcatc ggagtgcttg tcgcgccact cgcgcaccac atcaggtaaa 240
aacggaatcc tcgcgccgag aatgtaggac agccctgccg cgtgcagggc gacctggttg 300
gcttccgaga tcatcccggc atcagcgacg accgtgacgt cggtgagttg gtgagcggcc 360
ttgaacgcgt tgatcaccgg cagcatggtc gcggtctctg ccttattgcc ctcaaaggcc 420
gccaccgtca acgggaaccc gccagcatcg gtcaacaacc ccagggtgat ctgcgggtcc 480
aaccgtcttt ccttggagaa tccgggctcc cggaacccat caccagcatc ggtctcgaag 540
tgcagcgtcg acacgtcata gagcaccaga ctggccggac ccaattgcgc gtgggcagcg 600
catgcggtcg aaagcgcttg ccggaaagcg ggtttggcga acaccggcag acggcggttc 660
agcgtcggat acgacaccgg gacgacccca gtctcctcga cgacccgaag tgaatcggcc 720
ttgctggtcg gttcgatgat ccgggccaac accaactgac gaaacgcctc atccccatcg 780
gcgacgttgg cgaacccgac cttgtcataa gcagcgcaca atgcttccca cagcagcgcc 840
gacttcgagg acgtgatcgg caacggctcg gccgccgaac gttcggccaa gccaaggtcg 900
agttgcgctt ggccggcggc cagtcgctgc gccgcggcag ccttcaaagc ggccaccccg 960
gcctcgtcat gcgccgaacc c 981
<210>2
<211>326
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>2
tgtgcaggtc gtgtagtcct cgcggcgcgg gtcacgccgg atcgagcatc tgggttcggc 60
gcatgacgag gccggggtgg ccgctttgaa ggctgccgcg gcgcagcgac tggccgccgg 120
ccaagcgcaa ctcgaccttg gcttggccga acgttcggcg gccgagccgt tgccgatcac 180
gtcctcgaag tcggcgctgc tgtgggaagc attgtgcgct gcttatgaac aaggtcgggt 240
tcgccaacgt cgccgatggg gatgaggcgt ttcgtcagtt ggtgttggcc cggatcatcg 300
aaccgaccag caaggccgat tcactt 326
<210>3
<211>503
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>3
cttgggttac cgtgagcttg tcgtccatct gcgcgacatc acggagtcgc cggtaggcga 60
agtcgccgct gaacgcctgg ctgaaaccgt tccccaacag aagcgagatt tttccagcgc 120
cgttcttcgc atcagccaga gcttcggaaa atgttgagat cacgacggac atgtgagcac 180
tctacggagc ggtccgggaa gaattcccag cctcacgggg ccgaacatcc ggtgcgggaa 240
ctcaggtctc ctcgaaccca gattgatcga acttcaacgt cttcgcattc tccgacacgg 300
tccggacctt gccctcgtcg aaacctgttg cgtcggtggc ttcgatctcg atcttcaccg 360
tcagttcgat gccctggtcc cgtaggttgg cgatgacttc gtcggcgatg ttcttgaagt 420
ccagcgcgat cttgtccgag ctgagcgtct tcaccccgta gaagcgggtc ttggctgggg 480
ggaaggcaac atcaactggt ggc 503
<210>4
<211>587
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>4
tccgctatct aaaggctcat ggctaccaag tcgtcgacgg ctatacccta gttccaccca 60
agatcggagg ttagcgcggg tgaaagcgct ccttgaattt atcgttcaat actgcggctt 120
cctctacctc aacccaggct acagaatcac gaactcggcc acccgaggct tggccgacat 180
cgacgcatcg attacgttca ccggcgcgga gatcgtgtgg cagatcatta atgatcgcgg 240
gctcatctac tttgctgcgg cgccgtcaca aggtgtgtct gacgattcgt atgcactttc 300
ccttattcgt caatatttgg aaggcggcga ggatgtcggt gctggccccg cgatcgacga 360
ggcgagctgg ttgagcgcaa acttgagccg ggtcgagcgg ctatttaccg atgaatcgaa 420
cgctgcgcgc gtctgcgacg aacttgccga tctacgacgc tccaattcat tcaaaaaatg 480
gggatggccc aaaccggagg aaaccgacta gcggcaaatc ctagaccagg agagtccgcg 540
gccgataatg cagacccgac ttttatcagg ctagtgcgca cgtagga 587
<210>5
<211>622
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>5
ccggcggcgt gaaccagacg gccctaggat cagctggcgt caggaggtcg aacgcggccg 60
aagccgctcg ccgagtgccc ggtgaaccag gggtgtggat ctttctgttc ggcgacatgg 120
cggtattcgg agtgttcttc gccaccttca tgtatcagcg ttcgttggca ccgaagctgt 180
tcgacgactc gcgtcacacc aggagcatcg gcatcgggct aaacaacacg ctggtcctgc 240
tgaccagctc attgttcgtg gtgaccgcga tgcgggcgat tcgctcgtcg caacgcggcc 300
cagcgcaact cgcaggtgcg ctgatctgcg gcctcgcgtt cgtcggactc aaggccgtcg 360
agtacgccgc caaggtgtcc cagggccacg tccccaccca aaacaacttc tgcctctact 420
acttcatcct caccgggctg cacctgttcc atgtgctgat cggggtcgcg gtgctcatcc 480
tgctgttctt tcagggtcga cgcaccgaac tgagccccac ccgaacgggc ctcgtcgaag 540
gtggcgcatg tttccggcac ctcgtcgacc tatgtagatc gttttgttcg cccttctcta 600
cctggtgagc tgagtgatgc cc 622
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>6
cattgtgcgc tgcttatgac 20
<210>7
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>7
gaagtgaatc ggccttgct 19
<210>8
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>8
catgcccgtc aacagcac 18
<210>9
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>9
aaccagcggc gagaaaac 18
<210>10
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>10
tgcaggtcgt gtagtcctc 19
<210>11
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>11
aaggtcgagt tgcgcttg 18
<210>12
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>12
accagttgat gttgccttcc 20
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>13
tctcgatctt caccgtcagt t 21
<210>14
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>14
aaggctcatg gctaccaagt c 21
<210>15
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>15
tggccgagtt cgtgattct 19
<210>16
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>16
acctcaaccc aggctacaga 20
<210>17
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>17
gaataaggga aagtgcatac ga 22
<210>18
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>18
cgatctacga cgctccaa 18
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>19
gcgcactagc ctgataaaag t 21
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>20
gcactttccc ttattcgtca 20
<210>21
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>21
gaatgaattg gagcgtcgta g 21
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>22
agggcgaaca aaacgatcta c 21
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>23
cccaaaacaa cttctgcctc t 21
<210>24
<211>119
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>24
cattgtgcgc tgcttatgac aaggtcgggt tcgccaacgt cgccgatggg gatgaggcgt 60
tttcgttcag ttggtgttgg cccggatcat cgaaccgacc agcaaggccg attcacttc 119
<210>25
<211>134
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>25
catgcccgtc aacagcacgt tcggccttgg ccacctgctc atcgatcccc cgcagcgtgc 60
gccgggcccg gtcatggcgg tactggtagt ggatgatccg gtccgggatg ccgcgggttt 120
tctcgccgct ggtt 134
<210>26
<211>137
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>26
tgcaggtcgt gtagtcctcg cggcgcgggt cacgccggat cgagcatctg ggttcggcgc 60
atgacgaggc cggggtggcc gctttgaagg ctgccgcggc gcagcgactg gccgccggcc 120
aagcgcaact cgacctt 137
<210>27
<211>155
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>27
accagttgat gttgccttcc ccccagccaa gacccgcttc tacggggtga agacgctcag 60
ctcggacaag atcgcgctgg acttcaagaa catcgccgac gaagtcatcg ccaacctacg 120
ggaccagggc atcgaactga cggtgaagat cgaga 155
<210>28
<211>150
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>28
aaggctcatg gctaccaagt cgtcgacggc tataccctag ttccacccaa gatcggaggt 60
tagcgcgggt gaaagcgctc cttgaattta tcgttcaata ctgcggcttc ctctacctca 120
acccaggcta cagaatcacg aactcggcca 150
<210>29
<211>184
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>29
acctcaaccc aggctacaga atcacgaact cggccacccg aggcttggcc gacatcgacg 60
catcgattac gttcaccggc gcggcgatcg tgtggcagat cattaatgaa tcgcgggctc 120
atctactttg ctgcggcgcc gtcacaaggt gtgtctgacg attcgtatgc actttccctt 180
attc 184
<210>30
<211>132
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>30
cgatctacga cgctccaatt cattcaaaaa atggggatgg cccaaaccgg aggaaaccga 60
ctagcggcaa atcctagacc aggagagtcc gcggccgata atgcagaccc gacttttatc 120
aggctagtgc gc 132
<210>31
<211>182
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>31
gcactttccc ttattcgtca atatttggaa ggcggcgagg atgtcggtgc tggccccgcg 60
gatcggacga ggcgagctgg ttgagcgcaa acttgagccg ggtcgagcgg ctatttaccg 120
atgaatcgaa cgctgcgcgc gtctgcgacg aacttgccga tctacgacgc tccaattcat 180
tc 182
<210>32
<211>199
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>32
agggcgaaca aaacgatcta caataggtcg acgaggtgcc ggaaacatgc gccaccttcg 60
acgaggcccg ttcgggtggg gctcagttcg gtgcgtcgac cctgaaagaa cagcaggatg 120
agcaccgcga ccccgatcag cacatggaac aggtgcagcc cggtgaggat gaagtagtag 180
aggcagaagt tgttttggg 199
<210>33
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>33
ctgttcgagt ggcaacaagt c 21
<210>34
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>34
gtcgatgatg accttggtcc 20
<210>35
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>35
cggctgttcg agtggcaaca agtc 24
<210>36
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>36
ccgtcgatga tgaccttggt ccc 23
<210>37
<211>1020
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>37
ccacgcccga cggccaggct gatcccgatc accagcagcg gcagcagcgc ggtgaacacc 60
gaccggtaca cgatcagcag gatcagcgcg atcagcccgg cggtggcgat cgagatgaac 120
accaggtcgt gctcggctga ggcgatctga tcggcgaacg tggccggtgg ccctgtcaca 180
taggccgtgg tggacgtgtt ggcgaatgcc gtgtcggtga gatcgcgcac ggcttgcacg 240
gattcggccg cggtgggatc accgagcgtg ccggccaccc cgaccggcag ataccaggcc 300
ttgccgtcac cgctgaccgc ctgggttctg gtgaccgggt cggccagcag atcctggacc 360
agcaggacat ggtcgtgatc ggcgcgcaac cgccctacca gatcctgata gcgcagctga 420
ttatcggggg tcagaccggc cgggtcttgc atcgcgacga acagcatcgt cttggacccc 480
tgctcaccga acgcctcact catgcggtcc acggtctgaa acgagggcac atcacgcggg 540
atcagatcga ccgattgttg gcgcaccacc gtctccaact gcgggaacag cagcgccagc 600
accaccgcgg ccgcgatcca tccaccgatc actaatgcct tgtggcccac cgtgaacgcc 660
gcgagccgac ccagccgggc gctgtattcc gaagatccgg acagatcgac gccgcgccgg 720
ccacgggaag gcccagcatc tccggttcga tcgcccatcc ccacgcctcc caagaaacga 780
aactatcggt atcgctacga tactaatagt cccacacgag gatcggaagg gccgcgccga 840
cctttcgggc catggttggg gctgggcgcg gtgggggtga attaacttgc ggtgtcctca 900
gattcgtcgt cgggcaggtc gtggcgcacc acccgcaccc gcccgcgggg caggcatgcc 960
atgtagccgt ggcgtttgcc gtagagctcc caggaggtcg cggcctcctg gggggcgaca 1020
<210>38
<211>959
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>38
accatggcca gaaaggccag ggccacggtg ccggccgagg ccaggatgac tcggccgatg 60
ctggcggtgg ccgcgatgac cgcctgctcg gcgggcacct gggcgcggcg ttgttcgtgg 120
tagcggctga tcagaaacac ggtgtagtcg gtgccggcgt gtggggcgag cagctcgact 180
gaggtgcggc agcgggcgat gacggcttca ccgatccctt cctccacgcc gcgcaggatc 240
atggtggcgg tgtcggggtc gccgacgagg aatcgcaccg ccacgccgcg ggcggcggcg 300
tcgagcaggg tgtcgaggaa tccgtcgagg gtgtcgaaca ggaacgtggc ggccagcacg 360
aggatgtcga tgctggtggt ggcgtcggcg aaatgctgct gccacgcgct gatcggtagc 420
tgggtgcggc tggcatacag ggtcgcggtg aacgggccac ttggtgacat ggtcgccaat 480
gcgctcgcca tagtaggcga gtactgattg ggccacagat cgtgcggcgt gcagcccagc 540
agcgtggctg cgcgccgcgc gttgtcctcg cggatgttgt agttggtgtt ggacagccag 600
cggcgcaccg tcttgacatc cacgctcatc gcggtggcaa agcgctgcgg ggacagtccc 660
ttggcctgca gccgctgcat gaggcgattg ttggggatcg cggccgcctt gccgtcgtga 720
tcgtccatcg tctcagcgca catctttccg tgtcgtctcc gtgtatcgcc agcgcgtggc 780
gtctagtttg ccatgcgcgt ggtgccaccc cgcggcggtg atgcccacgt gatgtccacg 840
ggtatgtccc ggtggtgtcc ggaatgtcgc cggcgatgtc ggcaatgccg ctagatgtcc 900
ctggctacgt cggtggtgtc cacgtgaact gagttcagcg ccgcaagggc gcatacggt 959
<210>39
<211>896
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>39
cgtgggcatc accgccgcgg cattcggtgc agttgctggc gttggatgac actggcggcg 60
aagtgctcaa tgtgacggtg gccggtgacc cgaacgtcgg ggtcacccaa ccggtctcgg 120
tgaccagcct ggtggccatc ccgtgggcgc aaggcgatcg cagtggtgtg gccttccgcg 180
ctgatgccat caccggcgcc acagccggcg ccccggcggg tgagccgggg tcgcgcaccc 240
agaaatagca cccgctgccg aggcgcgaca ccagcacgtg ccgcgcctcg gcccgggtcc 300
gccgtcgacc actggctcgt ccacgcacac acggagaaca caccgtcatg gcatcaaaca 360
ataagaacac caacaacact caatcggaca atgacgactg gttcggcgat ctggtcatat 420
cactgttgac cgccgcggga tatctgctgt ggtgggccgt gctgttccca gcgatcagtg 480
tcccgatcat cgccagcctc actctcggca tcacccacgg accccgcgcc gggatcgtcg 540
gtgccatcgc gttcggcgcc ggatatatgg ggtgggcttg gctagaccca ggctcgtttt 600
gctcgtgggt gaccgaacct gtacggcgcc gctggttgac ctggtcgcgc tacacccgca 660
cctggggaat cgacgtgcac cctgcacggc ctgaccgcca aacttggtga gcgcaccctg 720
actccgaccc tgcgcaccgt cacgatcggt agaaccaccg atgtgttggc ggtgcggatc 780
gtcaccggcc aatccctaac taactggcac caacaatccg aggcgctggc cgcggcctgg 840
cgcgccgacc ggatcaccat caccgccacc acacccgggg aactacgcat cgcgct 896
<210>40
<211>744
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>40
acgatccgca ccgccaacac atcggtggtt ctaccgatcg tgacggtgcg cagggtcgga 60
gtcagggtgc gctcaccaag tttggcggtc aggccgtgca gggtgcacgt cgattcccag 120
gtgcgggtgt agcgcgacca ggtcaaccag cggcgccgta caggttcggt cacccacgag 180
caaaacgagc ctgggtctag ccaagcccac cccatatatc cggcgccgaa cgcgatggca 240
ccgacgatcc cggcgcgggg tccgtgggtg atgccgagag tgaggctggc gatgatcggg 300
acactgatcg ctgggaacag cacggcccac cacagcagat atcccgcggc ggtcaacagt 360
gatatgacca gatcgccgaa ccagtcgtca ttgtccgatt gagtgttgtt ggtgttctta 420
ttgtttgatg ccatgacggt gtgttctccg tgtgtgcgtg gacgagccag tggtcgacgg 480
cggacccggg ccgaggcgcg gcacgtgctg gtgtcgcgcc tcggcagcgg gtgctatttc 540
tgggtgcgcg accccggctc acccgccggg gcgccggctg tggcgccggt gatggcatca 600
gcgcggaagg ccacaccact gcgatcgcct tgcgcccacg ggatggccac caggctggtc 660
accgagaccg gttgggtgac cccgacgttc gggtcaccgg ccaccgtcac attgagcact 720
tcgccgccag tgtcatccaa cgcc 744
<210>41
<211>790
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>41
cgacaaccac ctcgttgtcg ttggcgcacc cgcatcgtga actaccgtga gcaagggcgt 60
accttcccga accagcgcgc caacgccggc tcttgatcag acctatgaca ttcagatcat 120
cctcgggaag gtgcgcccac tttcacgcca cctcgccaag gctcatccac aggttctgat 180
cattgctctt gtgctgtcgg ctatgtgccg tgactttgat cgagttgcca gacctcggat 240
cttggagcat ctcatcctca cggatctccg acagcggcac ccgctctact gcatgttccg 300
aaactcatgc ctctcggatc gtcgtggcag gtcggctgcg tcgacccttt ccggggatcg 360
tcccggcgat caccgaaccc aggcgcgatc gcaggtgctc tgagccatga gtagccgacc 420
ggccctctgg tagcagcggt acgctcgtca aatccctcga actaggaaag gtggagggat 480
gccaatgccg agacccccgg gcgcttccgc ggcggcccga atcgcgttcg gttaaatgtg 540
gcgatccacg agcagcttct cgccgccgtc gacggccggc gcgggataga agccaccgac 600
tgtctgtgcg acgcttgcgt ggccctcctc gaggttgacg cggcggcgat ttcgctcgtc 660
ttcgacggcg cgagcagcgg cacactggga tccagcagcc tggcggcgcg cctgtacgac 720
gaattgcagt tcacgctcgg cgagggaccg tgcctggact ctgtcacgcg gcggattcct 780
atagtattgg 790
<210>42
<211>569
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>42
gcgaacgtca agaacgcgaa ccagagtgct cgacgctttc cgagcactgg cacgagaaca 60
gtgatgcgat atgcgaccac tctctgcgcg ccgcgtcacg cggaacgggg ttgaaaggtg 120
gatcaggacg caaacgcgtt aaagaagtcc aatgtggatc cgcgactacg gttctgcgct 180
tcgttctttg gagacggcct taacccttat caaccgcgta cgcaaggcca gacggcgatt 240
ctccttgtct ttcaaaaacg ccagcatgcg cctgcaagtc tcccaccctg caacccagaa 300
gtacattggc agccgttttc tgaactcttt atcagtcccc tgcctcatgc tgaagccggt 360
catgtcgttg tattcggaaa tcacgacgtc catgtagcgg gtaatcagcg ccgggttgga 420
gaagcagcga atattgaagt cccagtccgc ccagactcgg tagcgcaggt tgtaagggcc 480
gatgccgtcg aaaagctcac ggcggtaaaa gatcgattgg tggcacaaat tcgtctcaaa 540
taggaggcgg tcgaggtcga aaggtccgg 569
<210>43
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>43
gcctcccaag aaacgaaac 19
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>44
acgacgaatc tgaggacacc 20
<210>45
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>45
cacacgagga tcggaagg 18
<210>46
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>46
caaacgccac ggctacat 18
<210>47
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>47
gaatgccgtg tcggtgag 18
<210>48
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>48
atctggtagg gcggttgc 18
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>49
acacgatcag caggatcagc 20
<210>50
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>50
attcgccaac acgtccac 18
<210>51
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>51
gcaaccgccc taccagat 18
<210>52
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>52
gtgatgtgcc ctcgtttca 19
<210>53
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>53
gatccatcca ccgatcacta a 21
<210>54
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>54
atcgaaccgg agatgctg 18
<210>55
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>55
cttcaccgat cccttcctc 19
<210>56
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>56
caccagcatc gacatcctc 19
<210>57
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>57
ccgaggccag gatgactc 18
<210>58
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>58
gaggaaggga tcggtgaag 19
<210>59
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>59
tcttgacatc cacgctcatc 20
<210>60
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>60
acggagacga cacggaaag 19
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>61
gcggatgttg tagttggtgt 20
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>62
aagatgtgcg ctgagacgat 20
<210>63
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列r
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>63
atacagggtc gcggtgaac 19
<210>64
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>64
tccaacacca actacaacat cc 22
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>65
ccgtgtcgtc tccgtgtatc 20
<210>66
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>66
cgtagccagg gacatctagc 20
<210>67
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>67
caccggccaa tccctaac 18
<210>68
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>68
agcgcgatgc gtagttcc 18
<210>69
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>69
cgaagtgctc aatgtgacg 19
<210>70
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>70
cagcgggtgc tatttctgg 19
<210>71
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>71
aggctcgttt tgctcgtg 18
<210>72
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>72
tgccagttag ttagggattg 21
<210>73
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>73
cactcaatcg gacaatgacg 20
<210>74
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>74
gtgggtgatg ccgagagt 18
<210>75
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>75
gtgggtgatg ccgagagt 18
<210>76
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>76
cggacaatga cgactggtt 19
<210>77
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>77
cacgtcgatt cccaggtg 18
<210>78
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>78
atcatcgcca gcctcactc 19
<210>79
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>79
gccgaaccag tcgtcatt 18
<210>80
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>80
cgcacccaga aatagcac 18
<210>81
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>81
agcgggtgct atttctgg 18
<210>82
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>82
cggcgaagtg ctcaatgt 18
<210>83
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>83
atcgtgaact accgtgagca 20
<210>84
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>84
gaacctgtgg atgagccttg 20
<210>85
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>85
aggctcatcc acaggttctg 20
<210>86
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>86
acgatccgag aggcatga 18
<210>87
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>87
ctaggaaagg tggagggatg 20
<210>88
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>88
acagtcggtg gcttctatcc 20
<210>89
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>89
gcggtacgct cgtcaaat 18
<210>90
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>90
ctcgtggatc gccacatt 18
<210>91
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>91
acccgctcta ctgcatgttc 20
<210>92
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>92
gtcggctact catggctca 19
<210>93
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>93
tttatcagtc ccctgcctca 20
<210>94
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>94
tattcgctgc ttctccaacc 20
<210>95
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>95
gcttcgttct ttggagacg 19
<210>96
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>96
tgaggcaggg gactgataaa 20
<210>97
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>97
gaacggggtt gaaaggtg 18
<210>98
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>98
gcagggtggg agacttgc 18
<210>99
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>99
cgtccatgta gcgggtaatc 20
<210>100
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>100
ctcgaccgcc tcctatttg 19
<210>101
<211>146
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>101
gcctcccaag aaacgaaact atcggtatcg ctacgatact aatagtccca cacgaggatc 60
ggaagggccg cgccgacctt tcgggccatg gttggggctg ggcgcggtgg gggtgaatta 120
acttgcggtg tcctcagatt cgtcgt 146
<210>102
<211>166
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>102
cacacgagga tcggaagggc cgcgccgacc tttcgggcca tggttggggc tgggcgcggt 60
gggggtgaat taacttgcgg tgtcctcaga ttcgtcgtcg ggcaggtcgt ggcgcaccac 120
ccgcacccgc ccgcggggca ggcatgccat gtagccgtgg cgtttg 166
<210>103
<211>200
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>103
gaatgccgtg tcggtgagat cgcgcacggc ttgcacggat tcggccgcgg tgggatcacc 60
gagcgtgccg gccaccccga ccggcagata ccaggccttg ccgtcaccgc tgaccgcctg 120
ggttctggtg accgggtcgg ccagcagatc ctggaccagc aggacatggt cgtgatcggc 180
gcgcaaccgc cctaccagat 200
<210>104
<211>140
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>104
acacgatcag caggatcagc gcgatcagcc cggcggtggc gatcgagatg aacaccaggt 60
cgtgctcggc tgaggcgatc tgatcggcga acgtggccgg tggccctgtc acataggccg 120
tggtggacgt gttggcgaat 140
<210>105
<211>150
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>105
gcaaccgccc taccagatcc tgatagcgca gctgattatc gggggtcaga ccggccgggt 60
cttgcatcgc gacgaacagc atcgtcttgg acccctgctc accgaacgcc tcactcatgc 120
ggtccacggt ctgaaacgag ggcacatcac 150
<210>106
<211>137
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>106
gatccatcca ccgatcacta atgccttgtg gcccaccgtg aacgccgcga gccgacccag 60
ccgggcgctg tattccgaag atccggacag atcgacgccg cgccggccac gggaaggccc 120
agcatctccg gttcgat 137
<210>107
<211>173
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>107
cttcaccgat cccttcctcc acgccgcgca ggatcatggt ggcggtgtcg gggtcgccga 60
cgaggaatcg caccgccacg ccgcgggcgg cggcgtcgag cagggtgtcg aggaatccgt 120
cgagggtgtc gaacaggaac gtggcggcca gcacgaggat gtcgatgctg gtg 173
<210>108
<211>190
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>108
ccgaggccag gatgactcgg ccgatgctgg cggtggccgc gatgaccgcc tgctcggcgg 60
gcacctgggc gcggcgttgt tcgtggtagc ggctgatcag aaacacggtg tagtcggtgc 120
cggcgtgtgg ggcgagcagc tcgactgagg tgcggcagcg ggcgatgacg gcttcaccga 180
tcccttcctc 190
<210>109
<211>152
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>109
tcttgacatc cacgctcatc gcggtggcaa agcgctgcgg ggacagtccc ttggcctgca 60
gccgctgcat gaggcgattg ttggggatcg cggccgcctt gccgtcgtga tcgtccatcg 120
tctcagcgca catctttccg tgtcgtctcc gt 152
<210>110
<211>177
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>110
gcggatgttg tagttggtgt tggacagcca gcggcgcacc gtcttgacat ccacgctcat 60
cgcggtggca aagcgctgcg gggacagtcc cttggcctgc agccgctgca tgaggcgatt 120
gttggggatc gcggccgcct tgccgtcgtg atcgtccatc gtctcagcgc acatctt 177
<210>111
<211>159
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>111
atacagggtc gcggtgaacg ggccacttgg tgacatggtc gccaatgcgc tcgccatagt 60
aggcgagtac tgattgggcc acagatcgtg cggcgtgcag cccagcagcg tggctgcgcg 120
ccgcgcgttg tcctcgcgga tgttgtagtt ggtgttgga 159
<210>112
<211>162
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>112
ccgtgtcgtc tccgtgtatc gccagcgcgt ggcgtctagt ttgccatgcg cgtggtgcca 60
ccccgcggcg gtgatgccca cgtgatgtcc acgggtatgt cccggtggtg tccggaatgt 120
cgccggcgat gtcggcaatg ccgctagatg tccctggcta cg 162
<210>113
<211>114
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>113
caccggccaa tccctaacta actggcacca acaatccgag gcgctggccg cggcctggcg 60
cgccgaccgg atcaccatca ccgccaccac acccggggaa ctacgcatcg cgct 114
<210>114
<211>199
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>114
cgaagtgctc aatgtgacgg tggccggtga cccgaacgtc ggggtcaccc aaccggtctc 60
ggtgaccagc ctggtggcca tcccgtgggc gcaaggcgat cgcagtggtg tggccttccg 120
cgctgatgcc atcaccggcg ccacagccgg cgccccggcg ggtgagccgg ggtcgcgcac 180
ccagaaatag cacccgctg 199
<210>115
<211>220
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>115
aggctcgttt tgctcgtggg tgaccgaacc tgtacggcgc cgctggttga cctggtcgcg 60
ctacacccgc acctggggaa tcgacgtgca ccctgcacgg cctgaccgcc aaacttggtg 120
agcgcaccct gactccgacc ctgcgcaccg tcacgatcgg tagaaccacc gatgtgttgg 180
cggtgcggat cgtcaccggc caatccctaa ctaactggca 220
<210>116
<211>142
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>116
cactcaatcg gacaatgacg actggttcgg cgatctggtc atatcactgt tgaccgccgc 60
gggatatctg ctgtggtggg ccgtgctgtt cccagcgatc agtgtcccga tcatcgccag 120
cctcactctc ggcatcaccc ac 142
<210>117
<211>134
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>117
gtgggtgatg ccgagagtga ggctggcgat gatcgggaca ctgatcgctg ggaacagcac 60
ggcccaccac agcagatatc ccgcggcggt caacagtgat atgaccagat cgccgaacca 120
gtcgtcattg tccg 134
<210>118
<211>191
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>118
cacgtcgatt cccaggtgcg ggtgtagcgc gaccaggtca accagcggcg ccgtacaggt 60
tcggtcaccc acgagcaaaa cgagcctggg tctagccaag cccaccccat atatccggcg 120
ccgaacgcga tggcaccgac gatcccggcg cggggtccgt gggtgatgcc gagagtgagg 180
ctggcgatga t 191
<210>119
<211>174
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>119
gccgaaccag tcgtcattgt ccgattgagt gttgttggtg ttcttattgt ttgatgccat 60
gacggtgtgt tctccgtgtg tgcgtggacg agccagtggt cgacggcgga cccgggccga 120
ggcgcggcac gtgctggtgt cgcgcctcgg cagcgggtgc tatttctggg tgcg 174
<210>120
<211>201
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>120
agcgggtgct atttctgggt gcgcgacccc ggctcacccg ccggggcgcc ggctgtggcg 60
ccggtgatgg catcagcgcg gaaggccaca ccactgcgat cgccttgcgc ccacgggatg 120
gccaccaggc tggtcaccga gaccggttgg gtgaccccga cgttcgggtc accggccacc 180
gtcacattga gcacttcgcc g 201
<210>121
<211>143
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>121
atcgtgaact accgtgagca agggcgtacc ttcccgaacc agcgcgccaa cgccggctct 60
tgatcagacc tatgacattc agatcatcct cgggaaggtg cgcccacttt cacgccacct 120
cgccaaggct catccacagg ttc 143
<210>122
<211>164
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>122
aggctcatcc acaggttctg atcattgctc ttgtgctgtc ggctatgtgc cgtgactttg 60
atcgagttgc cagacctcgg atcttggagc atctcatcct cacggatctc cgacagcggc 120
acccgctctactgcatgttc cgaaactcat gcctctcgga tcgt 164
<210>123
<211>142
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>123
ctaggaaagg tggagggatg ccaatgccga gacccccggg cgcttccgcg gcggcccgaa 60
tcgcgttcgg ttaaatgtgg cgatccacga gcagcttctc gccgccgtcg acggccggcg 120
cgggatagaa gccaccgact gt 142
<210>124
<211>117
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>124
gcggtacgct cgtcaaatcc ctcgaactag gaaaggtgga gggatgccaa tgccgagacc 60
cccgggcgct tccgcggcgg cccgaatcgc gttcggttaa atgtggcgat ccacgag 117
<210>125
<211>141
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>125
acccgctcta ctgcatgttc cgaaactcat gcctctcgga tcgtcgtggc aggtcggctg 60
cgtcgaccct ttccggggat cgtcccggcg atcaccgaac ccaggcgcga tcgcaggtgc 120
tctgagccat gagtagccga c 141
<210>126
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>126
tttatcagtc ccctgcctca tgctgaagcc ggtcatgtcg ttgtattcgg aaatcacgac 60
gtccatgtag cgggtaatca gcgccgggtt ggagaagcag cgaata 106
<210>127
<211>170
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>127
gcttcgttct ttggagacgg ccttaaccct tatcaaccgc gtacgcaagg ccagacggcg 60
attctccttg tctttcaaaa acgccagcat gcgcctgcaa gtctcccacc ctgcaaccca 120
gaagtacatt ggcagccgtt ttctgaactc tttatcagtc ccctgcctca 170
<210>128
<211>189
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>128
gaacggggtt gaaaggtgga tcaggacgca aacgcgttaa agaagtccaa tgtggatccg 60
cgactacggt tctgcgcttc gttctttgga gacggcctta acccttatca accgcgtacg 120
caaggccaga cggcgattct ccttgtcttt caaaaacgcc agcatgcgcc tgcaagtctc 180
ccaccctgc 189
<210>129
<211>169
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>129
cgtccatgta gcgggtaatc agcgccgggt tggagaagca gcgaatattg aagtcccagt 60
ccgcccagac tcggtagcgc aggttgtaag ggccgatgcc gtcgaaaagc tcacggcggt 120
aaaagatcga ttggtggcac aaattcgtct caaataggag gcggtcgag 169
<210>130
<211>833
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>130
tggcagcatc gccccgccgc gtaggagcag agacttcaca gacgcgcgac gccttgctcg 60
aggccgttgc gcagatgatg ctggaggagg gatatgcgag cgtcacgtat cgcgccttgg 120
ccgcgaaggc tggcgtgacg ccaagcctcg tgcagtacta cttcccctcg ctggatgaca 180
tcttcgtcgc cgccattcgc cgctactccg agcgcaacct gcaatggttg accgaggaac 240
ttcagcggcg agccgacgac ccacttcatg cgctgtggga gagcagctgg cacgagtcga 300
cgagtgcgct gatgacggag ttcatggcac ttggcaatca ccgcaaatcg attcgttccg 360
agatcgccgc cgtgacggat agcatgcgca gagtccaggt cgaggcgctg gtggcgaaat 420
tcgggaacga cgcccggctc ctcgctgatc tttcgttcga tgccgtggtg ctgttgatca 480
acggcgttcc gaagctcctt gggttggagg aaagcgtggg cgtcgatacc gcccacgccg 540
aattgatcgc cgcgtgcgag cgctttctgg acgccgtcga acctcgagcc aagcctcgcc 600
gtcgcagtaa gaaggctccg actcgccgac gctgactcgt cgcggcgggc gcttcacggg 660
aggccttgtg accgcgctgt acgtccgtat agactggacg atcgtatagc aggtgcacgg 720
cgggtggaag gcgagcattg tgagtcgcgt ggcggtagta accggcggtg ggtcgggaat 780
cgggcgggcc atcgtcgaac gactggccca cgacggccat cgcgtcgctg tgt 833
<210>131
<211>955
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>131
atcaacgtcg ggccgacggt gttgagcgtc accagaggga tgggtgcgct cacccggcgc 60
gcctcctcgg cgaagatgaa ctgctcgatg gccgaaaacc ctcgtccacc atattctttg 120
ggccatccga cacccagcag gttggccgcc gccagggcgc ggacgcattc gcgcaccgcg 180
ggaccgccgt ccatctgctc gctgaccgcg gcgacgcgtt cgggcgtcat cacggtctga 240
agcgtcgcac ggatctcggc gcgcagctgc tgttgctccg gcgtgtattc cagatccatc 300
ggctcaggcc cccattcgca ccggcatgcg tttcaccccg ggcaccatgg tggcccgcat 360
ccggtccacc tcgcccacca gctcgatgcg gggataccgg cgcagcagct cctcgaagaa 420
caccgtcgcc tccagtcgcg ccaattgtgc gcccacacaa gaatgttcac cgcagccgaa 480
ggcgatgtgc gggttcgggt ggcgggtcac atcgaattcc tcggagtccg ggccgaatac 540
gtcctcgtcc cggttggccg acccgtagag catcaccacc acctcgccgg cgcggatccg 600
ctgtccgcgg atttcgacgt cggcggtcgc ggtgcgggcc atgtgtacca cgggactgtt 660
ccaccgcaac atctcctcga ccgcaagcgg gatgcgggcg ggctcctcaa cgagcaggcg 720
gtattggtcg ggatgcgcga tcagggccag cgtccccagc gcgatcaggt tgcgggtggt 780
ttcgttgccg gccaccagca gcagaaaggc gaaattgagc aggtcttcgt cggtcaaccg 840
gtgctcgtcg atctcggcct cggccagcac cgagagcagg tcggcgcgcg gccgcgcgcg 900
gcgtgccgcg atcagccgct ggaagtactc gtagagtgcc ggccgccacc gccgg 955
<210>132
<211>810
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>132
ggctttcaca ggaagcgatc tggacaagct tgaaaggtac ttgctcaatc ccgaccacgt 60
aactggggga ccgaaggcga agtggttcga acgaaacggg tgtcacccag tacggcataa 120
aatacaacca agtgatctcg atcgccggag cgaacggaag ggtcatagat gtgacgttcg 180
cctggatacg cggaaacgac ggtgtagtgc gcttggtgac ggcgatccct acgagcaaat 240
gagagaacgt aaagcgttga gacctcgaga gtatgacgtg atcaggctgc tgcggccgct 300
gccggaacac aacctgcctg ccggttcacg cgggactatc gtcatggatt acacgaagga 360
ttcggatagc actctcccgt ccgcgtacga ggtggagttt tcagatgccg acggcgtaac 420
ccaggcgctg gtcacgcttt ccggagatga cctggaagtc gtctggcggc cggatccaga 480
tgcgtagcga ctgtagttgc ggcccgattc agggccacat ggccgtattg tgttgggcca 540
caccgtcata gttgcggtgc gccctctcca cattggtgcg caattcggtg agcgcttctc 600
gcatttgttt gtcggctgct acccatcttt ggtggtactc gcgctcggcg tctgcgccgc 660
gacccagcca ggaaccgtgg agttcggcga tgcattggtc gacggccgcg gcaatttgtt 720
ccgcgctggc agtgaatttc gccagtcggt cggcaaaatg cgacagtgcc tcagggtcga 780
ccgtgtaacg gcggctcatg attccggatc 810
<210>133
<211>872
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>133
accaacccga tgcgccgaca ccacccaacg acgccgccaa ggccctgcaa gtgctgaaat 60
ctctgccgtc gttcgaggac acccaagctc aggtccaggc cgccatgaac gaaatcactg 120
cggcagcagg caaagtggtc ccctcggtta cgtgggaaac accgcacgag ggatcaggct 180
taggctgcga aaaaccgtat gaacaaacgg acgggcgagg ctacttcctg ccggatcaag 240
ttgccgccaa cgtgtcggtc tccgagcagc agtgggcaac aatccaagag gccgccaaac 300
aggccgcggc caagatcgac gccactgaaa tccaggtgat gcagaacaac cccggaaacc 360
acgacgtcgg cttctacggc cccaccggca tcttcatcaa agtgggttac cggggaaacc 420
tcgttgtgtc gggctacacg ggctgccgac taccgcgcga caagaaatag atcgcgcacg 480
agcacgactc ccgagtaggg attcggcgag cgtctctcac cgcgatctga cgaaacacgt 540
tgtggcccaa ggctgagcgc cgaccaatcg ctatgaattc ctgaccctct cgacccttcg 600
gaacacacgt tgagctgacc acgaattgcg ttgcccccag cagatttaaa actcatcgcc 660
gcaggttagg gacagtttcc atccggatca taacctcgcg ggcagtcggt agtttctccc 720
gataacgatc ttttccccgc cgtcgccatc cggttcaagc tcagactctt tggaatcgac 780
ccggctagcg tccagcctga atcagttgcg aaacgagtaa gtcataccgg aatggtgcca 840
ctcggatcgc atggctgagt accgaattcg ct 872
<210>134
<211>933
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>134
gcgatgttgc gttcccagcc gagctcggcg ctggccccga actccccgcc gtgcagcaac 60
accaccgggt cgccctcgcc cgcctcaagg tagctggtga ccaggccatc gaccgacatc 120
gttttgcgat gaatctccat cgcccgcctt ctctatttga tcgcgatcgg gttcaccggc 180
gaacccactg cccccacaaa cctcaacggc ggtgcgacaa gctggaattc gtagacgccg 240
tcggccgcgc aatcggccgc cagcgcgctg aggtcccagt actcgccgag catcagcccc 300
atgtcgcgca gggtcagcag gtggaagggc aaaaacaccc cgtcgacgcc ggacaccggg 360
tcttcgacct gcaggttgtc cgaggcgacc gcggcgacct cgtggtcatg cagccactgg 420
gcgcatcgcc agtccagccc ggaatacggt tcggtcttgt tccctgtttc caaatatctt 480
gtccaccaac cggtccggat gagcaggatg tcgccgcgct cgatcgtcac gccctgggcg 540
cgcacgacgt catccaattc ctctggggtg atcgggtttc cgtgctccaa gaagacctcc 600
gcgccgcgat ggcgcaccag atccagcagc accccgcgcg acgtgatgcc cttgccgtcc 660
accttctcga tgcccaagcg gcgggcgccc aggctggtca ccgagccggc ggggacgccg 720
ttgtagagca ggtcgtcgta gtagacgtgc gacagcgcat cccattgggt ggccgcctgc 780
agcggcatga tgatcatgtc gtcgttgaac cggaacaggt tgtcgacgaa gtaggggccc 840
atctgcgccg ccgtcgggtt gcggtcccag ccgggtccgt actgggccag cgtggcggcg 900
tcgccgccgt ccacggtcat cacgtggatc ggg 933
<210>135
<211>630
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>135
cggtcggcgt agccggccat cgcttcgtcg accgagttgt cgaccaccta gatgaggtgg 60
tgcagacctc gctcgccggt ggagccgatg tacatgccgg ggcgtttgcg gaccgcctcc 120
agcccttcca ggacggtgat cgctgaagca ccgtattcgt cttgcgcctt cttcttctgg 180
gcagccacgg tcgggaagct ctccttgggg tttcatgcgg gcggttcctg atcaccgcaa 240
caatcgcatc ctgccagtct accgtgacga ccggtccgca ccgattttct gggcgcgttt 300
ctacccagct aaccgcgccg tgcgcttatt ttcttcgttt gtgccgcgtc ccgacgtgcg 360
tcaaggagat acgcgtcgtc ctggcggctt tcagcgccct gttgaggaag gccccggtgg 420
ggatggggcc gggctaacga ccgggcctaa ccataggtgt cgcgcggccc gcgcccggcg 480
atgtgccgcg ggcctttgcg ccaggacggc gcagccggac cggtgatctt cagcgaggtc 540
actacgccgt tgccgaccgc ggcggcaatc ttggccaaca gttgcgcctg catcatccgc 600
aactgggtgg cccaggccgt cgactcggcg 630
<210>136
<211>1085
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌
<400>136
gagcggtccg ggtcagtgga catttttcag tcgagacgac aacggtcagc agcgaaccag 60
tacgttcgga gaaggcgaat tggtccgcag gtacgccaag gcgtcctgac gcccgggcgc 120
ttcaagccga tcagcgccgt tgatttgtgg atccgccggc gtcgggccga tcggaaaacg 180
tcgggtactc gacgggtttc gcggaggttt cccccgacgc gacatacttc ggctcctcgg 240
ggtgggaaaa caggttcgac tggtccatgg ttgtccttcc ggatgaagag ttcggccgat 300
acgcatcgct gcttggcgtc ggacgacgat cgaatcgcac ggcgctctga ttcgtggttc 360
gtcggcgatt cgcggtgacc gtaagaatgc ggttccactc cactctacag gcagcccgag 420
ccgcgcctgg cgcgtcgggt cagacggagc ccgggcgtgg ccgcagtcca ggtgcacagc 480
taatgaatcg gcaagtgagg caactatttt caatatatgg tcggtctcat gctaccctga 540
acccgcacgg atgtgattgg tacatccgca tttgatgaga gaagtaagta aatggcacag 600
ggaactgtga aatggttcaa cggtgaaaag ggcttcggct tcatcacccc tgacgacggc 660
acgaaggacc tcttcgtcca ctactccgag atccagggaa gcggctatcg ctcgctcgac 720
gagaaccagc gtgttcagtt cgacgttgag cagggagcca agggacccca ggcggtagga 780
gtcagcaccg tctgagaacg tcacaaacgt cacggtgggg ctggtgcgat tgacttcgca 840
ccagccccac tggtttttcc gacctctgaa cggtcggtgg cgacaacacc cggcggctga 900
ccccggcgcg gccgaccaac cgggataatg accgcatgcg tctcgcgtgg gtgctgcgac 960
tgacgattgc ggcgtcgttg gtcgcggcgg gcgggacgcg taccgccgag gccagcccgg 1020
atgtcccgcc ggtcagcgag gccgcgaaag cggccggctt cgtggacatc cgcagcgtca 1080
ttccc 1085
<210>137
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>137
agggatatgc gagcgtca 18
<210>138
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>138
agttcctcgg tcaaccatt 19
<210>139
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>139
tactacttcc cctcgctgga 20
<210>140
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>140
agtgccatga actccgtcat 20
<210>141
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>141
atgccgtggt gctgttgat 19
<210>142
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>142
agtcggagcc ttcttactgc 20
<210>143
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列1
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>143
gcagtaagaa ggctccgact 20
<210>144
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>144
tactaccgcc acgcgact 18
<210>145
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>145
gaaaaccctc gtccaccata 20
<210>146
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>146
acgcttcaga ccgtgatg 18
<210>147
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>147
ggcgtgtatt ccagatccat 20
<210>148
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>148
cggtgaacat tcttgtgtgg 20
<210>149
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>149
accgaaggcg aagtggtt 18
<210>150
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>150
ttctctcatt tgctcgtagg g 21
<210>151
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>151
ccagatgcgt agcgactgta 20
<210>152
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>152
cgacaaacaa atgcgagaag 20
<210>153
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>153
gggccacacc gtcatagtt 19
<210>154
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>154
ccaccaaaga tgggtagcag 20
<210>155
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>155
gtgcgccct ctccacatt 18
<210>156
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>156
ccgaactcca cggttcct 18
<210>157
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>157
gctgccggaa cacaacct 18
<210>158
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>158
ggcatctgaa aactccacct 20
<210>159
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>159
agtgggcaac aatccaagag 20
<210>160
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>160
cccgacacaa cgaggttt 18
<210>161
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>161
acacacgttg agctgaccac 20
<210>162
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>162
tctgagcttg aaccggatg 19
<210>163
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>163
aatctctgcc gtcgttcg 18
<210>164
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>164
gcccgtccgt ttgttcata 19
<210>165
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>165
atcgaccgac atcgttttg 19
<210>166
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>166
gacatggggc tgatgctc 18
<210>167
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>167
gtggaagggc aaaaacacc 19
<210>168
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>168
tggaaacagg gaacaagacc 20
<210>169
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>169
gtttccgtgc tccaagaaga 20
<210>170
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>170
acgacgacct gctctacaac 20
<210>171
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>171
caccgcaaca atcgcatc 18
<210>172
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>172
cggcacaaac gaagaaaata a 21
<210>173
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>173
cgggcctaac cataggtgt 19
<210>174
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>174
cgtagtgacc tcgctgaaga 20
<210>175
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>175
cactggtttt tccgacctct 20
<210>176
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>176
caatcgtcag tcgcagca 18
<210>177
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>177
cgccgttgat ttgtggat 18
<210>178
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>178
ccgaggagcc gaagtatgt 19
<210>179
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>179
cgcacggatg tgattggta 19
<210>180
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>180
cggagtagtg gacgaagagg 20
<210>181
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>181
ggctatcgct cgctcgac 18
<210>182
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸引物
<400>182
tgacgtttgt gacgttctca g 21
<210>183
<211>154
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>183
agggatatgc gagcgtcacg tatcgcgcct tggccgcgaa ggctggcgtg acgccaagcc 60
tcgtgcagta ctacttcccc tcgctggatg acatcttcgt cgccgccatt cgccgctact 120
ccgagcgcaa cctgcaatgg ttgaccgagg aact 154
<210>184
<211>176
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>184
tactacttcc cctcgctgga tgacatcttc gtcgccgcca ttcgccgcta ctccgagcgc 60
aacctgcaat ggttgaccga ggaacttcag cggcgagccg acgacccact tcatgcgctg 120
tgggagagca gctggcacga gtcgacgagt gcgctgatga cggagttcat ggcact 176
<210>185
<211>164
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>185
atgccgtggt gctgttgatc aacggcgttc cgaagctcct tgggttggag gaaagcgtgg 60
gcgtcgatac cgcccacgcc gaattgatcg ccgcgtgcga gcgctttctg gacgccgtcg 120
aacctcgagc caagcctcgc cgtcgcagta agaaggctcc gact 164
<210>186
<211>157
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>186
gcagtaagaa ggctccgact cgccgacgct gactcgtcgc ggcgggcgct tcacgggagg 60
ccttgtgacc gcgctgtacg tccgtataga ctggacgatc gtatagcagg tgcacggcgg 120
gtggaaggcg agcattgtga gtcgcgtggc ggtagta 157
<210>187
<211>152
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>187
gaaaaccctc gtccaccata ttctttgggc catccgacac ccagcaggtt ggccgccgcc 60
agggcgcgga cgcattcgcg caccgcggga ccgccgtcca tctgctcgct gaccgcggcg 120
acgcgttcgg gcgtcatcac ggtctgaagc gt 152
<210>188
<211>193
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>188
ggcgtgtatt ccagatccat cggctcaggc ccccattcgc accggcatgc gtttcacccc 60
gggcaccatg gtggcccgca tccggtccac ctcgcccacc agctcgatgc ggggataccg 120
gcgcagcagc tcctcgaaga acaccgtcgc ctccagtcgc gccaattgtg cgcccacaca 180
agaatgttca ccg 193
<210>189
<211>178
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>189
accgaaggcg aagtggttcg aacgaaacgg gtgtcaccca gtacggcata aaatacaacc 60
aagtgatctc gatcgccgga gcgaacggaa gggtcataga tgtgacgttc gcctggatac 120
gcggaaacga cggtgtagtg cgcttggtga cggcgatccc tacgagcaaa tgagagaa 178
<210>190
<211>139
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>190
ccagatgcgt agcgactgta gttgcggccc gattcagggc cacatggccg tattgtgttg 60
ggccacaccg tcatagttgc ggtgcgccct ctccacattg gtgcgcaatt cggtgagcgc 120
ttctcgcatt tgtttgtcg 139
<210>191
<211>101
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>191
gggccacacc gtcatagttg cggtgcgccc tctccacatt ggtgcgcaat tcggtgagcg 60
cttctcgcat ttgtttgtcg gctgctaccc atctttggtg g 101
<210>192
<211>131
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>192
gtgcgccctc tccacattgg tgcgcaattc ggtgagcgct tctcgcattt gtttgtcggc 60
tgctacccat ctttggtggt actcgcgctc ggcgtctgcg ccgcgaccca gccaggaacc 120
gtggagttcg g 131
<210>193
<211>112
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>193
gctgccggaa cacaacctgc ctgccggttc acgcgggact atcgtcatgg attacacgaa 60
ggattcggat agcactctcc cgtccgcgta cgaggtggag ttttcagatg cc 112
<210>194
<211>163
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>194
agtgggcaac aatccaagag gccgccaaac aggccgcggc caagatcgac gccactgaaa 60
tccaggtgat gcagaacaac cccggaaacc acgacgtcgg cttctacggc cccaccggca 120
tcttcatcaa agtgggttac cggggaaacc tcgttgtgtc ggg 163
<210>195
<211>163
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>195
acacacgttg agctgaccac gaattgcgtt gcccccagca gatttaaaac tcatcgccgc 60
aggttaggga cagtttccat ccggatcata acctcgcggg cagtcggtag tttctcccga 120
taacgatctt ttccccgccg tcgccatccg gttcaagctc aga 163
<210>196
<211>159
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>196
aatctctgcc gtcgttcgag gacacccaag ctcaggtcca ggccgccatg aacgaaatca 60
ctgcggcag caggcaaagtg gtcccctcgg ttacgtggga aacaccgcac gagggatcag 120
gcttaggctg cgaaaaaccg tatgaacaaa cggacgggc 159
<210>197
<211>198
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>197
atcgaccgac atcgttttgc gatgaatctc catcgcccgc cttctctatt tgatcgcgat 60
cgggttcacc ggcgaaccca ctgcccccac aaacctcaac ggcggtgcga caagctggaa 120
ttcgtagacg ccgtcggccg cgcaatcggc cgccagcgcg ctgaggtccc agtactcgcc 180
gagcatcagc cccatgtc 198
<210>198
<211>152
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>198
gtggaagggc aaaaacaccc cgtcgacgcc ggacaccggg tcttcgacct gcaggttgtc 60
cgaggcgacc gcggcgacct cgtggtcatg cagccactgg gcgcatcgcc agtccagccc 120
ggaatacggt tcggtcttgt tccctgtttc ca 152
<210>199
<211>164
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>199
gtttccgtgc tccaagaaga cctccgcgcc gcgatggcgc accagatcca gcagcacccc 60
gcgcgacgtg atgcccttgc cgtccacctt ctcgatgccc aagcggcggg cgcccaggct 120
ggtcaccgag ccggcgggga cgccgttgta gagcaggtcg tcgt 164
<210>200
<211>114
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>200
caccgcaaca atcgcatcct gccagtctac cgtgacgacc ggtccgcacc gattttctgg 60
gcgcgtttct acccagctaa ccgcgccgtg cgcttatttt cttcgtttgt gccg 114
<210>201
<211>105
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>201
cgggcctaac cataggtgtc gcgcggcccg cgcccggcga tgtgccgcgg gcctttgcgc 60
caggacggcg cagccggacc ggtgatcttc agcgaggtca ctacg 105
<210>202
<211>122
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>202
cactggtttt tccgacctct gaacggtcgg tggcgacaac acccggcggc tgaccccggc 60
gcggccgacc aaccgggata atgaccgcat gcgtctcgcg tgggtgctgc gactgacgat 120
tg 122
<210>203
<211>106
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>203
cgccgttgat ttgtggatcc gccggcgtcg ggccgatcgg aaaacgtcgg gtactcgacg 60
ggtttcgcgg aggtttcccc cgacgcgaca tacttcggct cctcgg 106
<210>204
<211>145
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>204
cgcacggatg tgattggtac atccgcattt gatgagagaa gtaagtaaat ggcacaggga 60
actgtgaaat ggttcaacgg tgaaaagggc ttcggcttca tcacccctga cgacggcacg 120
aaggacctct tcgtccacta ctccg 145
<210>205
<211>110
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸探针
<400>205
ggctatcgct cgctcgacga gaaccagcgt gttcagttcg acgttgagca gggagccaag 60
ggaccccagg cggtaggagt cagcaccgtc tgagaacgtc acaaacgtca 110
Claims (21)
1、寡核苷酸，其含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列(其中，A表示腺嘌呤、C表示胞嘧啶、G表示鸟嘌呤、T表示胸腺嘧啶；另外，任意位置的T还可以被替换成尿嘧啶(U)；下同)的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)基因的碱基序列杂交。
2、权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分的寡核苷酸为含有选自序列号6～32、序列号43～129和序列号137～205的碱基序列的一部分或全部的寡核苷酸，所述含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号6～32、序列号43～129和序列号137～205的碱基序列的互补序列的一部分或全部的寡核苷酸。
3、权利要求1所述的寡核苷酸，其中所述含有序列号1所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号6～9和序列号24～25的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号2所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号10～11和序列号26的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号3所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号12～13和序列号27的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号4所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号14～21和序列号28～31的碱基序列的寡核苷酸，含有序列号5所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号22～23和序列号32的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号37所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号43～54和序列号101～106的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号38所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号55～66和序列号107～112的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号39所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号67～74和序列号113～116的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号40所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号75～82和序列号117～120的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号41所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号83～92和序列号120～125的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号42所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号93～100和序列号126～129的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号130所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号137～144和序列号183～186的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号131所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号145～148和序列号187～188的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号132所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号149～158和序列号189～193的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号133所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号159～164和序列号194～196的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号134所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号165～170和序列号197～199的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号135所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号171～174和序列号200～201的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号136所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号175～182和序列号202～205的碱基序列的寡核苷酸，所述含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号6～32、序列号43～129和序列号137～205的碱基序列的互补序列的寡核苷酸。
4、鸟分枝杆菌检测用引物，其含有下述寡核苷酸，所述寡核苷酸含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41和序列号42的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交。
5、权利要求4所述的引物，其中所述含有序列号1所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号6～9和序列号24～25的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号2所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号10～11和序列号26～27的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号3所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号12～13和序列号27的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号4所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号14～21和序列号28～31的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号5所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号22～23和序列号32的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号37所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号43～54和序列号101～106的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号38所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号55～66和序列号107～112的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号39所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号67～74和序列号113～116的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号40所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号75～82和序列号117～120的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号41所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号83～92和序列号120～125的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号42所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号93～100和序列号126～129的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号130所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号137～144和序列号183～186的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号131所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号145～148和序列号187～188的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号132所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号149～158和序列号189～193的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号133所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号159～164和序列号194～196的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号134所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号165～170和序列号197～199的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号135所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号171～174和序列号200～201的碱基序列的寡核苷酸，所述含有序列号136所示碱基序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号175～182和序列号202～205的碱基序列的寡核苷酸，所述含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分的寡核苷酸是含有选自序列号6～32、序列号43～129和序列号137～205的碱基序列的互补序列的寡核苷酸。
6、权利要求4所述的引物，其中构成引物的核苷酸的数量为10～50个。
7、权利要求4所述的引物，其用标记物质进行了标记。
8、权利要求7所述的引物，其中标记物质选自放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质或生物素。
9、鸟分枝杆菌检测用探针，其含有下述寡核苷酸，所述寡核苷酸含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交。
10、权利要求9所述的探针，其用标记物质进行了标记。
11、权利要求9所述的探针，其中标记物质选自放射性同位素、酶、荧光物质、发光物质或生物素。
12、权利要求9所述的探针，其5’末端经报告荧光色素标记，3’末端经猝灭色素标记。
13、鸟分枝杆菌的检测方法，其特征在于，使用下述寡核苷酸作为引物或/和探针，所述寡核苷酸含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交。
14、权利要求13所述的检测方法，其特征在于，使用含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸作为引物，以样品中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，检测所获得的引物延伸产物。
15、权利要求14所述的检测方法，所述方法还使用了经标记物质标记的标记探针。
16、权利要求13所述的检测方法，其特征在于，包括下述工序：
(1)使用含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交的寡核苷酸作为引物，以样品中的核酸作为模板进行核酸扩增反应，
(2)对(1)中获得的引物延伸产物进行电泳，基于其结果判断有无鸟分枝杆菌。
17、权利要求16所述的检测方法，在下述任一种情况下，判断被检样品为鸟分枝杆菌阳性：
(1)在进行电泳之后，对于得到的电泳组分，确认目的碱基对数的引物延伸产物的组分，确认了目的碱基对数的引物延伸产物的情况，
(2)在进行电泳之后，对于得到的电泳组分，使用将下述寡核苷酸用标记物质进行了标记的标记探针进行杂交，通过检测该标记探针的标记而确认了与该标记探针杂交的组分的情况，所述寡核苷酸含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交。
18、权利要求13所述的鸟分枝杆菌的检测方法，其中引物用标记物质进行了标记，使用该标记引物以样品中的核酸作为模板来进行聚合酶链反应，然后测定得到的引物延伸产物的标记。
19、权利要求18所述的检测方法，其中在进行核酸扩增链式反应之后，除去游离的标记引物，然后测定引物延伸产物的标记。
20、权利要求13所述的鸟分枝杆菌的检测方法，其特征在于，使用将下述寡核苷酸用标记物质进行了标记的寡核苷酸作为标记探针，使该标记探针与样品中的核酸杂交，除去游离的标记探针，然后检测杂交了的复合体的标记，所述寡核苷酸含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交。
21、鸟分枝杆菌检测用试剂盒，其含有下述寡核苷酸作为引物或/和探针，所述寡核苷酸含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的一部分或全部，或含有选自序列号1、序列号2、序列号3、序列号4、序列号5、序列号37、序列号38、序列号39、序列号40、序列号41、序列号42、序列号130、序列号131、序列号132、序列号133、序列号134、序列号135和序列号136的碱基序列的互补序列的一部分或全部，且与鸟分枝杆菌基因的碱基序列杂交。
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