JP5626673B2 - ジンクフィンガーを用いた新規標識方法及び被検物質の測定方法 - Google Patents
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(1) アプタマーの構築
3つのジンクフィンガーを有し2本鎖DNAに対して塩基配列特異的に認識して結合する調節因子Sp1とルシフェラーゼとを融合したLuc-Sp1を用いてトロンビンをサンドイッチ形式で検出するためにトロンビンアプタマーを設計した。トロンビンをビーズに固定するためのアプタマーとして、トロンビンのフィブリノーゲン結合部位に結合する15 merのアプタマー(Bock L.C. et al., Nature, 1992, vol.355, pp.564-566、配列番号7)を用い、このアプタマーの5'末端側に3つのチミン残基を付加し、末端をビオチン修飾した(TA15(immobilize))。一方、トロンビンを検出するためのアプタマーとして、ヘパリン結合部位に結合する29 merのアプタマー(Diane M. Tasset et al., J.Mol.Bio., 1997, vol.272, pp.688-698、配列番号8)を用いた。5'末端、および3'末端から4塩基が相補鎖を形成しているので、この相補鎖に3塩基のスペーサーを介してSp1認識配列を付加し、末端に3塩基のスペーサーを加え、5'末端側にFITCを修飾した(TA29(detect))。また、コントロールとして、Sp1認識配列の代わりにランダム配列を付加したものを同様に作製した(TA29(control))。
Sp1のジンクフィンガーとルシフェラーゼとを融合したLuc-Sp1は、以下の方法により調製した。
Sp1構造遺伝子中のジンクフィンガー領域(配列番号2中のaa619-712、配列番号1中の1952〜2233nt)を増幅できるプライマー(配列番号12及び13、配列番号1中の1932〜2234ntを増幅)を用い、市販のヒトリンパ腺cDNAライブラリーからSp1のジンクフィンガーコード領域(303 bp)を増幅した。電気泳動によりPCR産物の大きさを確認し、目的の大きさの遺伝子断片を切り出し、精製した。そのサンプルを用いてpGEM-TベクターにTAクローニングし、DH5αを形質転換後、LBプレート(Amp 50μg/ml, IPTG 0.1 mM, X-gal 50μg/ml)上で培養した。得られた白色コロニーに対しコロニーPCRを行い、電気泳動によりinsertの確認を行った。Insertが確認できたサンプルについてシークエンス解析を行った。配列が確認できたpGEM-Sp1ベクターから、制限酵素サイト(SmaI、EcoRI)をデザインしたプライマー(配列番号14及び15)を用い、Sp1遺伝子断片(302 bp、配列番号1中の1952〜2233ntを含む)を増幅した。PCR産物を電気泳動により切り出し、pGEM-Tベクターに再度TAクローニングした。DH5αに形質転換し、LBプレート(Amp 100μM, IPTG 0.1 mM, X-gal 50μg/ml)上で培養した。得られた白色コロニーに対しコロニーPCRを行い、電気泳動によりinsertの確認を行った。Insertが確認できたサンプルについてシークエンスを確認した。制限酵素サイトが導入されたpGEM-Sp1(SmaI & EcoRI)及びpGEX-2TベクターをSmaI、EcoRIにより制限酵素処理した。それらを電気泳動後、Sp1遺伝子断片及びpGEX-2Tベクター断片をそれぞれ切り出し、精製した。これらを16℃で1 hライゲーション後、DH5αを形質転換し、プレート(50μg/ml Amp)上で培養した。得られたシングルコロニーからプラスミドを抽出後、SmaI、EcoRIにより制限酵素処理し、電気泳動によりinsertの確認を行った。Insertの確認が出来たサンプル(pGEX/Sp1)のシークエンスを確認した。
市販のOvernight Express(商標) Autoinduction System(メルク)を添付の説明書に従い使用した。上記で構築したpGEX/sp1-lucを用いて大腸菌BL21(DE3)を形質転換し、150 mlのLB培地(Amp 50μg/ml、90μM ZnCl2、所定濃度のOnEx sol.1〜3、pH 7.3)中でOvernight Express(商標) Autoinduction Systemで20℃、24 h培養することにより、GST融合ジンクフィンガールシフェラーゼを発現させた。
GST融合ジンクフィンガールシフェラーゼが発現していると思われる湿菌体をCell lysis buffer(1% Triton X-100, 4 mM Pefabloc, 90μM ZnCl2, 5 mM DTT in PBS, pH 7.3)で懸濁し、フレンチプレスにより破砕した。破砕液を遠心分離(20,000 g、4℃、30 min)し、上清を回収した。得られた上清をBinding buffer(5 mM DTT, 90μM ZnCl2 in PBS, pH 7.3)で平衡化したGSTrap HFカラム(1 ml)に添加した(流速0.5 ml/min)。次に、5倍量のWash buffer(1% Triton X-100, 5 mM DTT, 90μM ZnCl2 in PBS, pH 7.3)で洗浄し、その後、5倍量のBinding bufferでリンスした(流速0.5 ml/min)。最後に、Elution buffer(5 mM DTT, 1 mM Pefabloc, 90μM ZnCl2, 10 mM Reduced glutathione, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0)を添加し(流速1.5 ml/min)、溶出画分を回収した。得られた溶出画分の蛋白質濃度をDC protein assay kit(Bio-Rad)を用いてLowry法により測定した。また、ルシフェラーゼの基質溶液であるPicaGene(東洋インキ)を用い、活性測定を行った。SDS-PAGEでシングルバンドが見られ、かつ、最も活性の高い溶出画分を用いて以下の実験を行なった。
上記で設計したアプタマーを用いて、ビーズに固定化したアプタマーに先にトロンビンを結合させる方法(方法A)と、ジンクフィンガータンパク質を介してルシフェラーゼ標識したアプタマーに先にトロンビンを結合させる方法(方法B)の2通りの方法を検討した。
Buffer 1 (10 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM KCl, 90μM ZnCl2, pH 7.0)中でNeutrAvidinビーズ(PIERCE)とビオチン修飾TA15(immobilize) (f.c. 200 nM)をインキュベートし、TA15(immobilize)をビーズに固定した。このビーズを洗浄した後、Buffer 2 (4%(w/v)スキムミルク、1 mM d-biotin、0.05%(v/v)tween 20 in Buffer 1)でビーズをブロッキングした。その後、Buffer 2中でビーズとトロンビン(f.c. 0, 50, 又は100 nM)をインキュベートした(1)。
Buffer 1中でNeutrAvidinビーズ(PIERCE)とビオチン修飾TA15(immobilize) (f.c. 200 nM)をインキュベートし、TA15(immobilize)をビーズに固定した。このビーズを洗浄した後、Buffer 2 (4%(w/v)スキムミルク、1 mM d-biotin、0.05%(v/v)tween 20 in Buffer 1)でビーズをブロッキングした(1)。
方法A、Bどちらを用いた場合にも、トロンビンの濃度依存的にFITCの蛍光強度の増加が観察された。方法AとBではBの方が、蛍光強度が大きいことが示された(図2、Sample 1〜3)。このことから、方法Bの方がサンドイッチが形成される割合が高いことが考えられる。
Claims (9)
- ジンクフィンガー領域を有する標識物質と、該ジンクフィンガー領域の認識部位が導入され、所望の標的分子に特異的に結合するアプタマーとを接触させることにより、ジンクフィンガー領域とその認識部位との間の結合を介して前記アプタマーに標識物質を結合させることを含み、前記認識部位は、前記アプタマーの両末端のハイブリダイゼーションによる二本鎖部分に導入され、又は前記アプタマーのループ部分で該アプタマーを分断し、その分断部に付加することにより導入され、かつ、前記認識部位は、前記アプタマーの特異結合性を維持したまま該アプタマーに導入される、アプタマーの標識方法。
- 前記標識物質が標識タンパク質であり、前記ジンクフィンガー領域を有する標識物質がジンクフィンガータンパク質と標識タンパク質との融合タンパク質である請求項1記載の標識方法。
- 前記標識タンパク質が蛍光タンパク質又は酵素である請求項2記載の標識方法。
- 被検物質を含み得る試料と、ジンクフィンガー領域を有する標識物質を含む被検物質結合性アプタマーの標識試薬と、該標識試薬中に含まれる前記ジンクフィンガー領域の導入された認識部位を含み前記被検物質に特異的に結合するアプタマーであって、前記認識部位が、前記アプタマーの両末端のハイブリダイゼーションによる二本鎖部分に導入され、又は前記アプタマーのループ部分で該アプタマーを分断し、その分断部に付加することにより導入されたアプタマーとを同時又は逐次的に接触させ、次いで、標識物質とアプタマーと被検物質とを含む複合体を分離後、該複合体中の標識物質からのシグナルを測定し、該シグナルを指標として被検物質を測定することを含む、試料中の被検物質の測定方法。
- 固相上に固定化されたアプタマーであって、前記被検物質結合性アプタマーとは異なる部位において前記被検物質と特異的に結合する固相アプタマーを、前記試料、前記標識試薬及び前記被検物質結合性アプタマーと同時又は逐次的に接触させ、次いで、固相を洗浄することにより前記複合体を分離する請求項4記載の測定方法。
- 前記試料と前記標識試薬と前記被検物質結合性アプタマーとを同時又は逐次的に接触させ、次いで、前記固相アプタマーを接触させる請求項5記載の測定方法。
- ジンクフィンガー領域を有する標識物質を含む、被検物質結合性アプタマーの標識試薬と、該標識試薬中に含まれる前記ジンクフィンガー領域の認識部位を含む、測定すべき被検物質に特異的に結合する被検物質結合性アプタマーであって、該認識部位が、該アプタマーの両末端のハイブリダイゼーションによる二本鎖部分に導入され、又は該アプタマーのループ部分で該アプタマーを分断し、その分断部に付加することにより導入された被検物質結合性アプタマーとを含む、被検物質の測定キット。
- 前記被検物質結合性アプタマーとは異なる部位において前記被検物質に特異的に結合する第2のアプタマーをさらに含む、請求項7記載の測定キット。
- 前記第2のアプタマーが固相に固定化されている請求項8記載の測定キット。
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