JP5201573B2

JP5201573B2 - 試料中の被検物質の測定方法及び装置

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Publication number: JP5201573B2
Application number: JP2007555966A
Authority: JP
Inventors: 広司早出; 一典池袋; 浩樹山崎
Original assignee: TECHNOMEDICA CO.,LTD.; Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Current assignee: TECHNOMEDICA CO.,LTD.; Tokyo University of Agriculture and Technology NUC
Priority date: 2006-01-24
Filing date: 2007-01-24
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2027-01-24
Also published as: US20090305254A1; WO2007086403A1; US8492084B2; JPWO2007086403A1

Description

本発明は、試料中の被検物質の測定方法及びそのための装置に関する。

試料中のタンパク質等の被検物質の測定は、現在、主として免疫測定法により行なわれている。免疫測定法としては様々な方法が知られており、実用化されているが、いずれの方法においても、被検物質に対する特異抗体が用いられる。被検物質に対する特異抗体の作出は常法により行なうことができるが、手間がかかり、このため特異抗体は高価である。

一方、任意の分子と特異的に結合する核酸分子であるアプタマーが知られている。所望の標的分子と特異的に結合するアプタマーは、SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment)と呼ばれる方法により作出可能である(非特許文献１)。この方法では、標的分子を担体に固定化し、これに膨大な種類のランダムな塩基配列を有する核酸から成る核酸ライブラリを添加し、標的分子に結合する核酸を回収し、これをPCRにより増幅して再び標的分子を固定化した担体に添加する。この工程を１０回程度繰り返すことにより、標的分子に対して結合力の高いアプタマーを濃縮し、その塩基配列を決定して、標的分子を認識するアプタマーを取得する。なお、上記核酸ライブラリーは、核酸の自動化学合成装置により、ランダムにヌクレオチドを結合していくことにより容易に調製可能である。このように、ランダムな塩基配列を有する核酸ライブラリーを用いた、偶然を積極的に利用する方法により、任意の標的物質と特異的に結合するアプタマーを作出できる。また、アプタマーは、通常、一本鎖領域を有しており、標的物質と結合していない状態ではこの一本鎖領域に相補的なオリゴヌクレオチドが該一本鎖領域にハイブリダイズすることができ、標的物質に結合している状態では、ハイブリダイズすることができない構造スイッチングアプタマー(structure-switching aptamer)と呼ばれるアプタマーを、SELEXに修飾を加えた方法により作出することも知られている（非特許文献２)。

特開2003-294679号公報特開2003-294680号公報特開2003-294681号公報 Tuerk, C. and Gold L. (1990), Science, 249, 505-510 Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 1061-1065 Kazunori Ikebukuro et al., Nucleic Acids Research, 33(12), e108 Wiegand TW, Williams PB, Dreskin SC, Jouvin MH, Kinet JP, Tasset D, High-affinity oligonucleotide ligands to human IgE inhibit binding to Fc epsilon receptor I, JOURNAL OF IMMUNOLOGY 157 (1): 221-230 JUL 1 1996

本発明の目的は、被検物質に対する抗体を用いることなく、試料中の被検物質を特異的に測定することができる被検物質の測定方法を提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、被検物質と結合していない状態ではオリゴヌクレオチドとハイブリダイズできるが、被検物質と結合している状態では、オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることができない標識したアプタマーを利用し、該アプタマーを試料と接触させ、被検物質が結合しなかったアプタマーを、該アプタマーとハイブリダイズする固相化したオリゴヌクレオチドと接触させて固相に結合し、固相に結合しなかったアプタマーの標識を測定することにより試料中の被検物質を測定できることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明は、被検物質と結合する性質を有し、被検物質と結合していない状態ではオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするが、被検物質と結合している状態では前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることができない標識したアプタマーと、試料中の被検物質と、前記オリゴヌクレオチドを前記被検物質に対して過剰量固定化した固相とを同時又は逐次的に接触させ、次いで、固相に結合されなかったアプタマーの標識を測定することを含む、試料中の被検物質の測定方法を提供する。

本発明により、被検物質に対する抗体を用いることなく被検物質を特異的に測定することができる新規な測定方法が提供された。アプタマーは、自動化学合成装置を用いて作製できるので、特異抗体に比べてはるかに容易かつ安価に調製することができる。このため、本発明により、種々の被検物質の特異的な測定を従来よりも安価に行なうことが可能となる。従って、本発明は各種疾患の診断、飲食品の品質検査、環境中の有害物質による汚染度の測定等、様々な分野において大いに貢献するものと考えられる。

本発明の方法に用いるアプタマーの１具体例に含まれる、固相化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするループ状の一本鎖領域を含むヘアピン構造を模式的に示す図である。典型的な各基本構造を有するアプタマーに、図１に示すヘアピン構造を挿入する部位を模式的に示す図である。本発明の実施例１で作製したアプタマーの立体構造を模式的に示す図である。本発明の実施例１において測定した、試料中のトロンビン濃度と検出された電流値との関係を示す図である。図４に示す場合よりも高濃度域のトロンビン濃度を測定した結果を示す図である。本発明の実施例２で用いた、IgE結合性アプタマーの塩基配列及び二次構造並びに用いた固定化オリゴヌクレオチドの塩基配列とハイブリダイズ位置を示す図である。本発明の実施例２において測定した、試料中のIgE濃度と検出された電流値との関係を示す図である。

本発明の方法により測定される被検物質は、それと特異的に結合するアプタマーが作成可能なものであれば何ら限定されるものではなく、種々のタンパク質（糖タンパク質やリポタンパク質等のタンパク複合体を包含する）、糖類（多糖類、少糖類及び単糖類並びに糖脂質のような糖複合体を包含する）、脂質、核酸、低分子化合物等を例示することができる。上記の通り、アプタマーは、SELEXのような、偶然を積極的に利用する方法により作出されるので、ほとんど全ての標的分子に対して、これと特異的に結合するアプタマーを作出することが可能である。下記実施例１では、トロンビン、実施例２では免疫グロブリンＥ(IgE)を被検物質としているが、上記の通り被検物質はこれに限定されるものではなく、好ましい具体例として、疾病のマーカー分子となる、インシュリン、グルカゴンや、肝臓ガンマーカーとなるαフェトプロテイン、消化器ガンマーカーであるCEA、前立腺ガンマーカーのPSA、卵巣ガンマーカーのCA125、膵臓ガンマーカーのCA19-9、各種感染症のマーカーとなるHIVウイルス抗体、C型肝炎ウイルス抗体、A型肝炎ウイルス抗体、B型肝炎ウイルス抗体等を挙げることができる。なお、本発明において、「測定」には、定量、半定量及び検出が包含される。

本発明に用いるアプタマーは、被検物質と結合する性質を有し、被検物質と結合していない状態ではオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするが、被検物質と結合している状態ではオリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることができない、標識したアプタマーである。本発明に用いるアプタマーのサイズは特に限定されないが、通常、30merないし100mer程度、好ましくは50merないし70mer程度である（merはヌクレオチド数を示す）。また、アプタマーは、DNAでもRNAでもよく、他の人工核酸でもよいが、化学的に安定で自動化学合成も容易なDNAが好ましい。

前記アプタマーは、ループ状の一本鎖領域を有することが好ましく、該一本鎖領域の両端にそれぞれ隣接する領域同士が二本鎖領域を形成していることが好ましい。該一本鎖領域のサイズは特に限定されないが、8merから25merが好ましい。また、該一本鎖領域の両端に隣接し、互いに二本鎖領域を形成する領域（以下、「隣接二本鎖形成領域」ということがある)のサイズは、特に限定されないが、2bpから10bpであることが好ましい。

本発明に用いるアプタマーは、標識されたものである。標識としては、免疫測定に常用されている周知の標識を採用することができ、例えば、酵素標識、蛍光標識、放射標識、金コロイド標識等を採用することができる。これらのうち、電気化学的に測定可能な反応を触媒する酵素は、電気化学的に測定可能であり、測定系が単純で、微小化、集積化、量産化が容易であり、また、自動化された装置を容易に構築できるので好ましい。このような酵素の例として、グルコースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ等を例示することができるがこれらに限定されるものではない。なお、標識酵素は、必ずしも電気化学的に測定可能な反応を触媒する酵素に限定されるものではなく、例えば、酵素免疫測定法(ELISA）等において常用されている、発色反応を触媒するアルカリフォスファターゼやセイヨウワサビペルオキシダーゼ等を採用することもできる。これらの標識は、アプタマーを作製後、常法によりアプタマーに結合してもよいし、後述するSELEXによるアプタマーの調製過程において行なわれるPCRのプライマーとして、末端（増幅されるポリヌクレオチドの末端になる側の末端）に標識が結合されたプライマーを用いることによっても標識化されたアプタマーを得ることができる。

上記アプタマーにハイブリダイズする、固相化オリゴヌクレオチドは、測定条件下（後述）において、該アプタマーとハイブリダイズすることによりアプタマーを固相に結合できるオリゴヌクレオチドであれば特に限定されないが、アプタマー中の少なくとも連続する一部分に相補的であり、そのサイズが4merから25mer、さらに好ましくは8merから25merである領域を含むものであることが好ましい。特に、アプタマーが上記したループ状の一本鎖領域を具備するものであり、固相化オリゴヌクレオチドが、該一本鎖領域の少なくとも連続する一部分に相補的であり、そのサイズが4merから25mer、さらに好ましくは8merから25merである領域を含むものであることが好ましく、さらには、前記一本鎖領域の相補鎖であり、かつ、前記一本鎖領域と同じサイズの領域を含むものであることが好ましい。もっとも、固相化オリゴヌクレオチドは、必ずしも、アプタマーの一本鎖領域のみにハイブリダイズするものに限定されるものではなく、その一部分が一本鎖領域とハイブリダイズし得るものであれば、アプタマーの二本鎖領域に割り込んでハイブリダイズすることも可能である。すなわち、固相化オリゴヌクレオチドは、アプタマーの一本鎖領域と二本鎖領域にまたがる領域にハイブリダイズするものであってもよい。この場合、固相化オリゴヌクレオチドは、そのサイズの２５％以上、さらに好ましくは４５％以上が一本鎖領域とハイブリダイズするものであることが好ましく、特に、アプタマーの該領域の相補鎖であることが好ましい。後述する実施例１では、前記一本鎖領域が、acgaattcatgatca（配列番号１)の塩基配列を有し、該一本鎖領域と前記隣接二本鎖領域形成領域が、ggacgacgaattcatgatcacgtcc（配列番号２)の塩基配列を有する。配列番号１と配列番号２の比較から明らかなように、配列番号２の両端の５塩基ずつが隣接二本鎖領域形成領域であり、これらが互いに対合して二本鎖領域が形成される。なお、一本鎖領域と隣接二本鎖形成領域の塩基配列は、配列番号２に示される塩基配列を有するものに限定されるものではなく、後述する方法により、任意の配列とすることができ、一方、配列番号２に示される塩基配列を有するヘアピン構造は、後述する実施例１に記載されるトロンビン特異的アプタマーに利用可能であるだけではなく、任意の被検物質と特異的に結合するアプタマー中にこの構造を含めることができる。なお、本発明において、「塩基配列を有する」とは、核酸の塩基がそのような順序で配列しているという意味である。従って、例えば、「acgaattcatgatcaで示される塩基配列を有する一本鎖領域」とは、acgaattcatgatcaの塩基配列を持つ１５塩基のサイズの一本鎖領域を意味する。

上記オリゴヌクレオチドは、固相に不動化して用いられる。すなわち、オリゴヌクレオチドは、固体の担体に結合された状態で用いられる。オリゴヌクレオチドを固相に不動化する方法自体は周知である。例えば、オリゴヌクレオチドの一端にビオチンを共有結合させ、一方、担体にアビジンを不動化しておき、アビジン−ビオチン結合を介してオリゴヌクレオチドを担体に結合することができるがこの方法に限定されるものではなく、グルタルアルデヒド架橋法等により直接担体に共有結合してもよい。さらに、DNAをよく吸着するナイロンやニトロセルロース等から成る膜等に物理吸着させることもできる。また、オリゴヌクレオチドは、直接担体に結合することも可能であるし、ビオチンのような低分子化合物を介して担体に結合することも可能である。さらには、オリゴヌクレオチドは、スペーサーを介して担体に結合することも可能である。例えば、固相化すべきオリゴヌクレオチドを一端に含む、より長いオリゴヌクレオチドを調製し、固相化すべきオリゴヌクレオチドと反対側の端部を上記したビオチン−アビジン結合等により担体に結合することもできる。この場合、担体に固定化した核酸のうち、上記固相化すべきオリゴヌクレオチド以外のポリヌクレオチド部分は、単なるスペーサーとして機能するので、その塩基配列やサイズは何ら限定されるものではない。なお、固相として用いられる担体は、核酸の固定化に常用されているものをそのまま用いることができる。例えば、アビジンを合成樹脂やアガロース等の高分子から成るビーズに固定化したアビジンビーズは市販されているので、市販品をそのまま利用することができる。あるいは、ガラス、シリコン、合成樹脂製等の、市販されているDNAチップ用の基板を用いることもできる。このような担体は、ビーズ状やプレート状のものの他に、クロマトグラフィーに用いられるようなカラム状のものやフィルター状のものを採用することもできる。

本発明に用いるアプタマーは、被検物質と結合していない状態では前記オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするが、被検物質と結合している状態では該アプタマーにオリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることができないものである。すなわち、被検物質と結合している状態と、結合していない状態とで上記アプタマーの三次元構造が変化し、その結果、被検物質と結合していない状態では前記アプタマーとオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするが、被検物質と結合している状態ではアプタマーにオリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることができなくなるものである。好ましくは、アプタマーとオリゴヌクレオチドとが先にハイブリダイズしても、被検物質が共存すれば、アプタマーと被検物質が結合してアプタマーの構造が変化し、その結果、ハイブリダイズしていたオリゴヌクレオチドが離脱する構造を有するものである。

任意の被検物質に結合することができる、このような構造スイッチングアプタマーは、例えば非特許文献２に記載される公知の方法により作製することができる。この方法では、先ず、上記した一本鎖領域と隣接二本鎖形成領域とを構成する一本鎖核酸を合成する。この一本鎖核酸は上記した通りのものであり、好ましい１例として上記した配列番号２に示す塩基配列を有するものを挙げることができるが、一本鎖領域の塩基配列はこれに限定されるものではなく、任意の塩基配列とすることができる。次に、合成した一本鎖核酸の両端にランダムな塩基配列を有する領域を付加する。これは、核酸自動合成機により、上記一本鎖核酸の両端にランダムにヌクレオチドを結合していくことにより容易に行なうことができる。この領域のサイズは特に限定されないが通常、10〜50mer程度である。この領域の塩基配列がランダムであるので、膨大な数の種類の核酸を含む核酸ライブラリーが生じる。次いで、所望により、さらにその両端に、PCR時のプライマーがハイブリダイズする領域を付加する。この領域は予めその塩基配列がわかっているものであれば、配列自体は何ら限定されるものではない。そのサイズも特に限定されないが、通常、10merから25mer程度でよい。なお、プライマーがハイブリダイズする領域は、付加しておけば、後述するPCRの前にアプタマーの塩基配列を決定する必要がなくなるのでアプタマーの作製過程が単純化されるが、アプタマーの配列の自由度がその分小さくなるので、付加しなくてもよい。

一方、上記した固相化オリゴヌクレオチドを準備する。次に、上記のようにして調製した核酸ライブラリーを固相化オリゴヌクレオチドと接触させる。これは、核酸ライブラリーを緩衝液に溶解した溶液を、固相化オリゴヌクレオチドに添加すること等により行うことができる。ここでの反応条件は、実際の被検物質の測定時と同じ条件を採用することが好ましいので、室温下で行なうことが簡便で好ましい。また、緩衝液は、周知のDNAプローブによる検出において用いられる結合バッファーと同様な、周知の組成のものを用いることができ、その一例は下記実施例にも記載されている。反応時間は、特に限定されないが、通常、１分間〜３０分間程度、好ましくは１０分間〜２０分間程度である。また、固相化オリゴヌクレオチドの分子数を核酸ライブラリー中の核酸の分子数よりも過剰になるようにすることが好ましい。反応後、固相を洗浄して未結合の核酸を除去する。核酸ライブラリーに含まれる核酸は、全て、上記一本鎖領域を有し、一方、固相化オリゴヌクレオチドは、該一本鎖領域にハイブリダイズするものであるので、理論的に、核酸ライブラリー中に含まれる全ての核酸分子が固相に結合される。

次に、被検物質を作用させる。ここでの反応条件も、実際の被検物質の測定時と同じ条件を採用することが好ましいので、室温下で行なうことが簡便で好ましい。反応時間は、特に限定されないが、通常、上記と同様、１分間〜３０分間程度、好ましくは１０分間〜２０分間程度である。被検物質を作用させると、被検物質と結合し、かつ、被検物質と結合することにより構造が変化して固相化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしなくなるアプタマーは固相から遊離する。一方、被検物質と結合しないアプタマー及び被検物質と結合しても固相化オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを維持できるアプタマーは遊離しない。従って、固相から遊離したアプタマーを回収することにより、被検物質と結合するアプタマーであって、被検物質と結合していない状態では前記一本鎖領域とオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするが、被検物質と結合している状態では前記一本鎖領域に前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることができないアプタマーのみを回収することができる。アプタマーの回収は、常法であるフェノール抽出とエタノール沈殿等により容易に行うことができる。次に、回収したアプタマーをPCRにより増幅する。核酸ライブラリーを作製する際に、PCR時のプライマーがハイブリダイズする領域を付加している場合には、該領域とハイブリダイズするプライマーを用いてPCRを行なう。該領域を付加していない場合には、回収した各アプタマーの塩基配列を決定し、その塩基配列に基づいてPCR用のプライマーを化学合成してPCRを行なう。非対称PCR（PCRに用いる一対のプライマーのうちの一方を過剰量用いる）を行なうことにより主として一本鎖の核酸を増幅することができる。あるいは、PCRに用いる一方のプライマーとして、ビオチン標識したプライマーを用い、増幅された二本鎖核酸をアビジンビーズに結合させ、この状態で核酸を変性させ、ビーズから分離した核酸を回収することにより、増幅された二本鎖核酸から一本鎖核酸（ビオチン標識されていない方の鎖）を回収することができる。

増幅したアプタマーを、上記固相化オリゴヌクレオチドと再度接触させ、以下、上記工程から成るサイクルを繰り返す。そうすることにより、被検物質と未結合の状態では固相化オリゴヌクレオチドとよくハイブリダイズし、被検物質の存在下では被検物質とよく結合して固相からよく遊離する、所望のアプタマーがより多くPCRの鋳型となるので所望のアプタマーを濃縮していくことが可能である。このあたりの原理は、アプタマーの調製方法として最初に発明されたSELEX（非特許文献１)と同様であり、上記方法は、SELEXの一変法と言える。

本願発明者らは、先に、コンピューター内でアプタマーを進化させる、SELEXの改良法を発明している（非特許文献３)。上記した非特許文献２に記載の方法に、非特許文献３記載のコンピューター内進化を適用することにより、所望のアプタマーの作出を効率化することが可能である。この方法では、上記SELEX変法の１サイクル目完了後、得られたアプタマーの塩基配列を決定すると共に、被検物質との結合能を測定し、結合能の順序をつける。アプタマーのこれまでの研究により、アプタマーの基本構造は４つのタイプ、すなわち、ヘアピン型、バルジ型、シュードノット型及びグアニンカルテット型の４種類に分類されることがわかっており、どのような塩基配列を有するアプタマーがどの構造をとるのか及びその基本構造の維持に必要なヌクレオチドがどれかということはコンピューターによる解析により容易にわかる。非特許文献３記載のコンピューター内進化を利用する方法では、各アプタマーの基本構造の維持に不可欠ではない、例えば３〜５mer程度の複数の領域を、得られた各アプタマーの対応する各領域どうしの間でランダムに交換する（シャフル)する。そして、さらにシャフル後の上記各領域に、ランダムな一塩基置換を導入する。これらのシャフル及び一塩基置換の導入はコンピューターで行なう。そして、コンピューターにより作出された新たな塩基配列を有するアプタマーを化学合成して第２の核酸ライブラリーとし、上記したサイクルに付す。第２の核酸ライブラリーを作製する際、結合能の順序の高かったアプタマーに由来する領域を有するアプタマーの量を最も多くし、以下、順序が下がるにつれてその比率を少なくする。以上のように、コンピューター内でのシャフル及び一塩基置換により人為的に変異を導入することにより、SELEXによる進化の効率を高めることができる。

上記した方法では、一本鎖領域と隣接二本鎖形成領域の両端に全くランダムな配列を付加した核酸ライブラリーを出発材料としてSELEX変法を行なうものであるが、既に、所望の被検物質と結合するアプタマーが知られている場合には、それを元にして、上記した構造スイッチングアプタマーを作出することも可能であり、こちらの方が効率が高くなる場合が多いと考えられる。すなわち、上記の通り、アプタマーの基本構造は、ヘアピン型、バルジ型、シュードノット型及びグアニンカルテット型の４種類に分類されることが知られている。公知のアプタマーの、被検物質との結合に関与していないと考えられる領域に、上記一本鎖領域と隣接二本鎖形成領域から成るヘアピン構造（例として、配列番号２に示す配列を有するヘアピン構造を図１に示す）を結合させて得られる一本鎖核酸は、本発明で用いる構造スイッチングアプタマーである可能性が高い。すなわち、各型のアプタマーに対して、図２に示す位置に、図１に示すようなヘアピン構造を付加したものは、所望の構造スイッチングアプタマーである可能性が高い。従って、このような構造を有する一本鎖核酸を作製して、その被検物質及び固相化オリゴヌクレオチドに対する結合性を調べることにより、所望の構造スイッチングアプタマーを取得できる可能性が高い。あるいは、被検物質と結合する性質を有するアプタマーにヘアピン構造を付加した一本鎖核酸を予め化学合成したものを核酸ライブラリーとして、上記SELEX変法を行なうことにより、上記方法をさらに効率化することができる。さらには、図２に示すヘアピン構造の付加によっては、所望の構造スイッチング特性を有するアプタマーが得られなかった場合でも、上記したコンピューター内進化を駆使する方法（非特許文献３)を適用して人為的に変異を作り出し、それを核酸ライブラリーとして用いて上記SELEX変法を行なうことにより、所望の構造スイッチングアプタマーを得ることができる。この場合、ヘアピン構造の部分にも変異を導入したもの（サイズを変更したものを含む）を核酸ライブラリーに含ませることもできる。なお、ヘアピン構造の付加は、元のアプタマーに自動核酸化学合成装置に所定のオリゴヌクレオチドを付加していくことにより作製することもできるし、ヘアピン構造を付加した一本鎖核酸を自動核酸化学合成装置により一から化学合成することによっても作製することができる。

図２に示すようにヘアピン構造を、アプタマーに付加する手法は、所望の被検物質と結合するアプタマーが既に公知の場合に特に有用であるが、所望の被検物質と結合するアプタマーが未知の場合にでも、通常のSELEXにより所望の被検物質と結合するアプタマーを作製し、それに上記のように所定のヘアピン構造を付加することによっても調製することができる。本願発明者らは、通常のSELEXにおいて、被検物質との結合能がより高いアプタマーを効率的に得ることができるSELEXの改良法を発明し、特許出願している（特願2005-200823)。このSELEX改良法により、所望の被検物質と結合するアプタマーを作出し、これに、図２に示すように上記ヘアピン構造を付加することによって、優れた性能を有する構造スイッチングアプタマーを効率的に得ることができる。通常のSELEX（非特許文献１)は、ランダムな塩基配列を有する核酸ライブラリーを、担体に固定化した標的物質と接触させ、標的物質と結合した核酸を回収してその塩基配列を決定し、PCRにより増幅し、これを核酸ライブラリーとして用いて上記サイクルを繰り返すものである。特願2005-200823に記載したSELEX改良法では、通常のSELEXにおいて、所望の標的物質（本発明における被検物質)と核酸ライブラリー中の核酸とを結合させる際に、非標的物質を固定化した担体を共存させ、所望の標的物質と結合した核酸のみを回収し、PCRにより増幅し、増幅物から一本鎖核酸を取得し、これを核酸ライブラリーとして、標的物質を固定化した領域に接触させ、固相に結合した核酸を回収し、同様にPCRで増幅し、一本鎖を取得し、これを核酸ライブラリーとして再度、標的物質と非標的物質をそれぞれ固定化した領域と接触させ、以下同様にサイクルを繰り返す方法である。この方法によれば、非標的物質や担体に結合するアプタマーは淘汰され、標的物質に特異的に結合するアプタマーが濃縮されていく。このようにして得られたアプタマーに対して、上記のようにヘアピン構造を付加することにより、所望の構造スイッチングアプタマーを得ることができる。

また、所望の被検物質と結合するアプタマーが知られている場合には、固相化オリゴヌクレオチドの塩基配列を適切に選択することにより所望の構造スイッチング性が得られる場合もある（下記実施例２参照）。すなわち、アプタマーとしては、所望の被検物質と結合することが知られているアプタマーをそのまま用い、固相化オリゴヌクレオチドの塩基配列を適切に選択する。上記の通り、固相化オリゴヌクレオチドは、通常、アプタマーの一本鎖領域と少なくとも部分的にハイブリダイズする塩基配列を有するものであるが、固相化オリゴヌクレオチドのサイズや、それがハイブリダイズする領域（上記の通り、通常、アプタマーの一本鎖領域を少なくとも部分的に含む）を適切に選択する。この場合、固相化オリゴヌクレオチドは、アプタマーと相補的な塩基配列を有し、その少なくとも一部分がアプタマーの一本鎖領域と相補的であるものが好ましい。このような固相化オリゴヌクレオチドの候補は比較的数が少ないため、先ず、所望の被検物質と結合する固相化オリゴヌクレオチドをスクリーニングし、その中から所望の構造スイッチング性を発揮する固相化オリゴヌクレオチドをスクリーニングすることにより、比較的容易に得ることができる場合が多い。

上記した固相化オリゴヌクレオチド及び標識アプタマーを用いて、本発明の方法は次のようにして実施することができる。まず、試料中の被検物質と上記標識アプタマーとを接触させる。これは、試料と標識アプタマーの溶液とを混合し、インキュベートすることにより行なうことができる。この際、試料中の想定される被検物質量に対して過剰量の標識アプタマーを反応させ、全被検物質を標識アプタマーに結合させることが好ましい。インキュベーションの条件は特に限定されないが、室温下で行なうことが簡便で好ましい。反応時間は、特に限定されないが、通常、１分間〜３０分間程度、好ましくは１０分間〜２０分間程度である。

次に、試料と標識アプタマーとの混合溶液を、上記した固相化オリゴヌクレオチドと接触させる。これは、上記したオリゴヌクレオチドを固定化した担体と、試料と標識アプタマーとの混合溶液とを混合してインキュベートすることにより行なうことができる。あるいは、オリゴヌクレオチドを固定化している担体がカラム状やフィルター状のものである場合には、単にカラムやフィルターを通過させるだけでもよい。固相化オリゴヌクレオチドの量は、混合した標識アプタマーよりも過剰量であり、試料中に被検物質が存在しない場合でも、添加した未反応の標識アプタマーの全量が固相化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするようにする。インキュベーションの条件は、アプタマーの作出時のSELEX変法において採用したのと同様、室温下で行なうことが簡便で好ましく、また、反応時間は、特に限定されないが、通常、１分間〜３０分間程度、好ましくは１０分間〜２０分間程度である。

試料中に被検物質が含まれる場合、被検物質は標識アプタマーと結合する。被検物質と結合した標識アプタマーは、上記の通り，固相化オリゴヌクレオチドとはハイブリダイズすることができない。一方、被検物質と結合しなかった標識アプタマーは、固相化オリゴヌクレオチドとハイブリダイズするので、固相に結合されてしまい、遊離の状態では存在しなくなる。

次の工程において、固相に結合しなかった標識アプタマーの標識を測定する。上記の通り、固相に結合しなかった標識アプタマーは、被検物質と結合したアプタマーであるから、固相に結合しなかった標識アプタマーの標識を測定することにより、試料中の被検物質を測定することができる。固相と、固相とインキュベートした後の溶液とは容易に分離することができる。例えば、固相がビーズの場合には、遠心分離により上清を回収することで、インキュベーション後の溶液を回収することができる。また、固相としてカラム状の担体や、フィルター状の担体を採用した場合には、カラムやフィルターを通過してきた溶液を回収することで遊離の標識アプタマーを含む溶液を回収することができる。標識自体は、上記の通り、免疫測定において常用されているものを用いることができるので、標識の測定は、各標識に応じて、免疫測定の分野で常用されている常法により行なうことができる。例えば、標識が蛍光標識である場合には、回収した溶液の蛍光強度を測定する。標識が酵素である場合には、酵素反応に必要な基質を加え、その酵素反応により生じた生成物を測定する。電気化学反応を触媒する酵素の場合には、酵素の基質を添加した溶液に作用電極、対向電極及び参照電極を浸漬し、作用電極と対向電極間に生じる起電力を測定する。これは通常の酵素電極を用いた酵素反応の測定と同じであり、常法により容易に行なうことができる。

なお、上記した方法では、試料と標識アプタマーとを先ず混合し、この混合溶液を固相化オリゴヌクレオチドと反応させたが、上記の方法により作出することができる、被検物質の存在下ではオリゴヌクレオチドとハイブリダイズできないアプタマーの場合には、必ずしも試料と標識アプタマーを先に混合する必要はなく、試料、標識アプタマー及び固相化オリゴヌクレオチドの三者を同時に反応させてもよいし、先に試料と固相化オリゴヌクレオチドを反応させ、次に標識アプタマーを反応させることも可能である。

本発明の方法では、被検物質に結合したアプタマーと結合しなかったアプタマーの分離、すなわち、いわゆるB/F分離を、固相と溶液の分離により行なうことができるので、極めて簡便であり、何ら特殊な装置を必要とすることなく実施可能である。もっとも、本発明の方法を簡便に、例えば、単に試料液を滴下するだけで実施することができる装置を構築することも可能である。このような装置は、要するに、オリゴヌクレオチドが固定化された固相と、該固相と接触した後の前記アプタマーを捕集する捕集領域とを少なくとも具備するものである。このような装置では、測定系を単純化することが可能で、微小化、集積化、量産化が容易な、電気化学的測定を採用することが好ましい。すなわち、前記アプタマーの標識として、電気化学的に測定可能な反応を触媒する酵素を採用し、前記捕集領域が電極又は電極と直接接触する領域であるものを好ましく採用することができる。

このような測定装置としては、免疫測定のイムノクロマト法に用いられている装置を応用することができる。本願共同出願人は、先に、電気化学的に標識酵素を簡便に測定できる免疫測定用のバイオセンサーを発明しており（特許文献１〜３)、これらの原理を応用して本発明の方法を簡便に実施することができる測定装置を構築することができる。すなわち、例えば、基板上に電極板（作用電極及び対向電極）を載せ、その上に標識酵素の基質を含む電気化学反応層を積層し、その上にオリゴヌクレオチドを固定化した層を積層し、その上に、標識アプタマーを含む層を積層して成るものである。ここで、各層は、メンブレンやフィルター等の、液体が通過することが可能な多孔質層から成る。また、標識アプタマーは、多孔質層中に含浸したもののように、液体の添加によって容易に標識アプタマーが層から離脱できるものである。同様に、電気化学反応層に含まれる基質も、液体によって層から容易に離脱できるように保持されていることが好ましい。

このような装置では、試料溶液を標識アプタマー層に滴下すると、標識アプタマー層中で試料溶液と標識アプタマーが接触して被検物質と標識アプタマーが結合し、被検物質と結合した標識アプタマー及び被検物質と結合しなかった標識アプタマーの両者ともその下の固相化オリゴヌクレオチド層に溶出する。固相化オリゴヌクレオチド層では、被検物質と未結合の標識アプタマーのみがオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして固相にトラップされ、被検物質と結合した標識アプタマーは、その下の電気化学反応層に進む。この装置では、この電気化学反応層が、固相化オリゴヌクレオチドと接触した後の前記アプタマーを捕集する捕集領域となる。電気化学反応層には、標識酵素の基質が含まれているので、ここで標識酵素がその基質と反応し、電極間に起電力が生じる。この起電力を測定することにより、試料中の被検物質を測定することができる。このように、上記の測定装置を用いることにより、単に試料溶液を装置に滴下し、電極間の電圧を測定するだけで試料中の被検物質を測定することができるので、極めて簡便である。

上記の装置は、重力を利用して試料溶液を上から下へ流すタイプ、すなわち、いわゆるフロースルータイプの装置であるが、免疫測定においてフロースルータイプと共に常用されているラテラルフロータイプの装置とすることもできる。ラテラルフロータイプの装置は、毛管現象を利用して、液を水平方向に移動させるものであり、原理はフロースルータイプの装置と同様である。すなわち、１枚の多孔性層の端部に、標識アプタマーを含む標識アプタマー領域、その次に、オリゴヌクレオチドを固相化した固相化オリゴヌクレオチド領域、その次に、標識酵素の基質を含む電気化学反応領域、その次に該電気化学反応領域と接触して作用電極及び対向電極を設けておく。動作原理は上記したフロースルータイプの場合と同様である。すなわち、試料溶液を装置端部の標識アプタマー層に滴下すると、被検物質と標識アプタマーとが結合し、結合した標識アプタマー及び未反応の標識アプタマーが毛管現象により次のオリゴヌクレオチド固相化領域に流され、ここで被検物質と結合しなかった標識アプタマーがトラップされ、被検物質と結合した標識アプタマーのみが次の電気化学反応領域に流されてここで基質と反応して電気化学反応を起こし、その起電力を該領域に接触して配置される電極を介して測定する。なお、試料溶液のみでは、毛管現象により電気化学反応領域まで標識アプタマーを流せるだけの液量がない場合には、別途、展開液を標識アプタマー領域にさらに添加してもよい。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

１．トロンビン結合性アプタマーの作製
トロンビンに特異的に結合することが知られているアプタマー（配列番号３)は、グアニンカルテット構造を有するアプタマーである。このグアニンカルテット構造の、末端から数えて２段目のグアニンカルテットを構成するグアニン同士を連結するttから成るループのtとtの間に、上記配列番号２に示す塩基配列を有するヘアピン構造を連結した、配列番号４に示す塩基配列を有する一本鎖DNAを化学合成した。配列番号４に示す塩基配列中、22nt（5'末端から２２番目のヌクレオチド、以下同様）〜46ntが、本発明で用いるアプタマーを得るために挿入したヘアピン構造であり、27nt〜41ntの15merがヘアピン構造中のループを構成する一本鎖領域、22nt〜26ntと42nt〜46ntが隣接二本鎖形成領域であり、22ntと46nt、23ntと45nt、24ntと44nt、25ntと43nt、26ntと42ntとがそれぞれ対合して、5merの二本鎖領域を形成する。このアプタマーの立体構造を図３に模式的に示す。

２．構造スイッチング特性の確認
上記１で作製したアプタマーが、トロンビンと結合し、かつ、トロンビンの非存在下では配列番号４の27nt〜41ntの領域の相補鎖(15mer)であるオリゴヌクレオチド（以下、便宜的に「15mer相補鎖」という)とハイブリダイズし、トロンビンと15mer相補鎖の共存下ではトロンビンに結合して15mer相補鎖とは結合しない、構造スイッチング特性を有することを次のようにして確認した。6μMアプタマー、54nMトロンビンを検出バッファー（10 mM MOPSバッファー(pH7.4))中で混合し室温で15分間インキュベートした後、6μMの FITC修飾した15mer相補鎖を加えさらに室温で15分間インキュベートしたものを、15%ポリアクリルアミドゲルを用い電気泳動を行った。さらに、比較のため、FITC修飾した15mer相補鎖単独のもの、FITC修飾した15mer相補鎖とアプタマーを上記と同様にインキュベートしたものについても同様に電気泳動を行なった。また、4μMアプタマー、0.5〜4μMトロンビン、4μMのFITC修飾した15mer相補鎖を用い、同様に電気泳動を行った。電気泳動後、イメージアナライザー（アマーシャム・バイオサイエンス社製、商品名「タイフーン」)によりFITC修飾した15mer相補鎖のバンドを確認した後、エチジウムブロミドによりDNAのバンドを検出した。

トロンビンの濃度を固定した電気泳動実験の結果、FITC標識15mer相補鎖とアプタマーを混合したものは、FITC標識15mer相補鎖単独の場合よりも高分子側に電気泳動バンドが移動した。このことから、アプタマーは、FITC標識15merとハイブリダイズすることが確認された。一方、アプタマー、FITC標識15mer及びトロンビンの三者を逐次的にインキュベートしたものでは、FITC標識15mer相補鎖のバンドは移動せず、アプタマーとトロンビンの結合物に相当する位置にバンドが形成された。アプタマーとトロンビンが先に結合したものは、後からFITC標識15mer相補鎖を共存させてもアプタマーにハイブリダイズしないことが確認された。さらに、トロンビンの濃度を変化させた電気泳動実験の結果、トロンビンの量が少ないほどアプタマーと15mer相補鎖のハイブリダイズを示すバンドは濃くなり、また15mer相補鎖の一本鎖を示すバンドは薄くなった。トロンビン濃度が低いほど15mer相補鎖とアプタマーのハイブリダイゼーションが高い割合で起こっていることが示され、トロンビンを認識していないフリーのアプタマーが15mer相補鎖とハイブリダイズしていることが確認された。

３．試料中のトロンビン濃度の測定
上記２により、上記１で作製したアプタマーが、トロンビンに結合し、トロンビン未結合の状態では15mer相補鎖に結合し、トロンビンと結合した状態では15mer相補鎖と結合しないという、所望の構造スイッチング特性を有することが確認されたので、該15merを担体に結合し、試料中のトロンビンを定量した。この操作は以下のようにして行った。

(1) DNA固定化担体の作製
NeutrAvidinビーズ(商品名、PIERCE社製、グリコシル基を除去したアビジンをアガロースビーズに結合したもの)10μLに、ビオチン修飾した15 mer相補鎖0.5 nmolを添加し、結合バッファー (100 mMリン酸、150 mM NaCl(pH 7.2))で全量500μLになるよう調製し、室温で1時間撹拌することで15mer相補鎖DNAをアビジンビーズに固定化した。なお、15mer相補鎖は合成の際に５‘端をビオチン標識した。その後、遠心分離によりアビジンビーズを回収し4 mM ビオチンで15分間、1%ブロッキングバッファー（ハイブリダイゼーション用、Roche社製)で30分間ブロッキングを行い洗浄したものをDNA固定化担体として用いた。

(2) アプタマーの標識
上記１で作製したアプタマーをグルタルアルデヒド架橋法によりピロロキノリンキノングルコースデヒドロゲナーゼ（以下、「PQQGDH」」）で標識した。これは具体的に次のようにして行なった。1 mM CaCl₂, 1μM PQQ(pyrroquinoline quinone)存在下で活性化したPQQGDHとアビジンを、それぞれ0.48 mg、0.52 mgずつ10 mM MOPS緩衝液中で混合し、その後グルタルアルデヒドを終濃度0.1%となる様に加え、室温にて30分間攪拌した。その後反応を停止させるために、10 mM Tris-HCl緩衝液(pH7.5)で１から３時間透析し、更に10 mM MOPS緩衝液で６時間以上透析した。なお、PQQGDHは、グルコースを基質としてグルコースを脱水素化する反応を触媒する酵素であり、その濃度を電気化学的に測定できるものである。

(3) トロンビン濃度の測定
0〜10μg/ml（0〜27μM）のトロンビンと、上記(2)で作製したPQQGDH標識アプタマー(以下ap-GDH) 0.1 U(約10 pmol分)を含むサンプル溶液100 μLを上記(1)で調製した10μLのDNA固定化担体に添加し、室温で15分間撹拌し、遠心分離によって得られた上清20μLと6mＭ mPMS（1-methoxyphenazine methosulphate）、1μM PQQ、1 mM CaCl₂を含む全量4 mlの10mM MOPS(pH 7.0)を反応溶液、金電極を作用極、白金電極を対極とし、印加電位＋100 mV vs Ag/AgClで終濃度60 mMのグルコースを添加し、応答電流値を測定した。測定は25℃で行った。また、50〜1000μg/ml（54〜2700μM）のトロンビンを含むサンプル溶液ついては、用いるDNA固定化担体とap-GDHの量を2倍にし、同様に検出を行った。

結果を図４及び図５に示す。10μg/mlの範囲までトロンビン濃度依存的な電流値の上昇が見られた。また、コントロールとしてトロンビンの代わりにBSAを用いた場合、得られた電流値は低く、BSA濃度依存的な電流値の上昇は見られず（図４ (b))、検出限界は100 ng/ml(2.7 nM)であった（図４ (a)）。またトロンビン濃度10μg/ml以上においては、用いる固定化担体とap-GDHの量を2倍にすることで1 mg/ml(27 mM)の範囲まで、トロンビン濃度依存的な電流値の増加が見られた(図５)。サンプル溶液中にトロンビンが多く存在する場合、ap-GDHはサンプル溶液中のトロンビンと結合しており、固定化担体の15 mer相補鎖とはハイブリダイズせず上清に残るため、グルコース添加時に高い応答電流を示したと考えられ、この原理でトロンビン検出ができることが示された。

１． IgE結合性アプタマー
IgE結合性アプタマーとしては、IgEと結合することが知られているアプタマー（非特許文献４）（以下、「CaAp-1」）を用いた。このCaAp-1の塩基配列を配列番号５に、塩基配列と二次元構造を図６に示す。図６に示すように、CaAp-1は、一本鎖領域を有する単一のヘアピン構造から成る。なお、CaAp-1は、核酸自動合成機により化学合成した。

２． SPRによるIgEとの結合性の確認
ビオチン修飾したCaAp-1をSPR用チップ（SAチップ）に固定し、種々の濃度のIgE溶液 100μLを送液した時のSPRシグナルの変化を観察した。相互作用測定の際はMg²⁺を含むPBS buffer(138 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM NaHPO₄, 1.1 mM KHPO₄, 1 mM MgCl₂, pH 7.4)を用い、流速は20μL/minとした。対照として、種々の濃度のウシ血清アルブミン(BSA)溶液を送液した時のSPRシグナルの変化を観察した。

その結果、BSAを送液した場合にはシグナルの変化は観察されなかったが、IgEを送液した場合には、濃度依存的にシグナルが変化した。このことから、非特許文献４に記載された通り、CaAp-1はIgEに特異的に結合することが確認された。

２．固定化オリゴヌクレオチドの選択
CaAp-1の5'末端から8mer、10mer、12merの領域に相補的なオリゴヌクレオチドを調製し、後述の14merオリゴヌクレオチドの場合と同様にしてCaAp-1とインキュベーション後、電気泳動にかけることによりCaAp-1との結合性（ハイブリダイズするか否か）を調べた。その結果、いずれのオリゴヌクレオチドも室温下でCaAp-1とはハイブリダイズしなかった。

そこで、CaAp-1の5'末端から14merの領域に相補的なオリゴヌクレオチド（以下、「14mer捕捉オリゴヌクレオチド」と言う）を調製し、CaAp-1との結合性を電気泳動により調べた。すなわち、1μMアプタマー、0〜1μM IgEをPBS(pH 7.0)中で混合し室温で15分間インキュベートした後、1μMの FITC修飾した14mer捕捉オリゴヌクレオチドを加えさらに室温で15分間インキュベートしたものを、15 %ポリアクリルアミドゲルを用い電気泳動を行った。電気泳動後、イメージングアラナイザー（商品名タイフーン）によりFITC修飾した14mer捕捉オリゴヌクレオチドのバンドを確認した。

その結果、14mer捕捉オリゴヌクレオチドは、IgEの非存在下では上記条件下でCaAp-1とハイブリダイズし、IgEの存在下では、IgEの濃度が高くなるほどCaAp-1と結合する14mer捕捉オリゴヌクレオチドの量が減少するとともにIgEと結合する14mer捕捉オリゴヌクレオチドの量が増大した。これにより、CaAp-1は、被検物質（IgE）の非存在下では14mer捕捉オリゴヌクレオチドと結合し、被検物質の存在下では14mer捕捉オリゴヌクレオチドと結合せずに被検物質と結合する、所望の構造スイッチング性を有することが確認された。

図６には、この14mer捕捉オリゴヌクレオチドの塩基配列（配列番号６）と、これがCaAp-1とハイブリダイズする様子も示されている。図６から明らかなように、14mer捕捉オリゴヌクレオチドは、CaAp-1の一本鎖領域と4mer（14mer中の約29%)がハイブリダイズするものである。

３． 14mer捕捉オリゴヌクレオチド固定化ビーズを用いた電気化学的IgE検出
ビオチン結合性物質であるNeutrAvidin（商品名）を固定化したビーズ20μL（固形量10μL）に、ビオチン修飾した14mer捕捉オリゴヌクレオチド0.5 nmolを添加し100 mM リン酸緩衝液, 150 mM NaCl₂(pH7.2)で全量500μLになるよう調整し、4℃で一晩撹拌し14mer捕捉オリゴヌクレオチドをビーズに固定化した。その後4 mM ビオチンで15分間、1 % ブロッキング緩衝液で1時間ブロッキングを行い洗浄したものをDNA固定化担体として用いた。0〜1μMのIgEとPQQGDH標識CaAp-10.1 U分(GA架橋法により調製・約10 pmol分)を混合し全量100μLに調整し、室温で15分間インキュベートしたサンプル溶液をDNA固定化ビーズに添加し、更に15分間室温で撹拌し、遠心分離により上清を回収した。この上清20μLと、1mM CaCl₂、1μM PQQを含む10 mM MOPS (pH 7.0)を反応溶液とし（全量4ml）、金電極を作用極、白金電極を対極とし、印加電位＋100 mV vs Ag/AgClをかけて60 mM グルコース添加時の応答電流値を測定した。対照として、IgEに代えてBSAを用いて同様な操作を行った。

結果を図７に示す。図７に示されるように、IgEが1000nM(1μM)の時に応答電流が検出された。一方、同濃度のBSAでは応答電流は検出されなかった。このことから、CaAp-1をアプタマーとして用い、14mer捕捉オリゴヌクレオチドを固定化オリゴヌクレオチドとして用いる本発明の方法によりIgEを測定できることが明らかになった。

Claims

被検物質と結合する性質を有し、被検物質と結合していない状態ではオリゴヌクレオチドがハイブリダイズするが、被検物質と結合している状態では前記オリゴヌクレオチドがハイブリダイズすることができない標識したアプタマーと、試料中の被検物質と、前記オリゴヌクレオチドを前記被検物質に対して過剰量固定化した固相とを同時又は逐次的に接触させ、次いで、固相に結合されなかったアプタマーの標識を測定することを含む、試料中の被検物質の測定方法。
前記アプタマーが、ループ状の一本鎖領域を有し、該一本鎖領域の両端にそれぞれ隣接する領域同士が二本鎖領域を形成している請求項１記載の方法。
前記一本鎖領域のサイズが8merから25merである請求項２記載の方法。
前記二本鎖領域のサイズが2bpから10bpである請求項２又は３記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドは、前記一本鎖領域の少なくとも連続する一部分に相補的な領域であってそのサイズが4merから25merである領域を含む請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドは、前記一本鎖領域の少なくとも連続する一部分に相補的な領域であってそのサイズが8merから25merである領域を含む請求項５のいずれか１項に記載の方法。
前記オリゴヌクレオチドは、前記一本鎖領域の相補鎖であり、かつ、前記一本鎖領域と同じサイズの領域を含む請求項６記載の方法。
前記一本鎖領域が、acgaattcatgatcaの塩基配列を有する請求項３ないし７のいずれか１項に記載の方法。
前記一本鎖領域とその両端にそれぞれ隣接する領域が、ggacgacgaattcatgatcacgtccの塩基配列を有する請求項８記載の方法。
前記アプタマーと前記被検物質とを混合した後、該混合物を前記固相に接触させることを含み、該混合物中には前記アプタマーが前記被検物質に対して過剰量含まれる請求項１ないし９のいずれか１項に記載の方法。
前記標識が酵素である請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の方法。
前記酵素が、電気化学的に測定可能な反応を触媒する酵素であり、前記固相に結合しなかったアプタマーに結合している酵素を電気化学的に測定することを含む請求項１１記載の方法。
前記酵素がグルコースデヒドロゲナーゼである請求項１２記載の方法。