JP2001190291A - 分析エレメントによる核酸の種特異的検出 - Google Patents

分析エレメントによる核酸の種特異的検出

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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 試料適用ゾーンと検出ゾーンとを含み、
該試料適用ゾーンから該検出ゾーンへの液体移送が可能
な分析エレメントにて核酸を検出する方法であって、検
出すべき核酸を含む試料を該試料適用ゾーンに適用する
工程、および該検出ゾーン内で検出プローブとのハイブ
リダイゼーションにより該核酸を検出する工程を含んで
なり、該検出すべき核酸を該分析エレメント上で変性さ
せる、上記方法。 【効果】 検出すべき核酸の前処理を省略でき、核酸を
分析エレメントに直接または増幅プロセス後に直接適用
できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、試料適用ゾーンと
検出ゾーンを含み、試料適用ゾーンから検出ゾーンへの
液体移送が可能な分析エレメントにて核酸を検出する方
法に関する。この方法は、試料を前記分析エレメントの
試料適用ゾーンに適用し、試料に含まれる核酸を検出ゾ
ーンにて検出プローブとのハイブリダイゼーションによ
り定性的に、また好ましくはマーカー基により定量的に
検出し得るものである。さらに、核酸を検出するための
新規分析エレメントおよび試薬キットも提供する。
【０００２】
【従来の技術】現在、診断用途において、PCRで得られ
た増幅産物などの核酸は、検出すべき核酸と検出プロー
ブ(通常、オリゴヌクレオチドである）との特異的ハイ
ブリダイゼーションならびに検出すべき核酸または／お
よび検出プローブに存在し得るマーカー基を利用した非
放射性検出反応により検出されている。この検出反応に
は様々な異なる方法を用いることができる。例えば、検
出すべき核酸は、マイクロタイタープレート(Amplicor
Detection Kit, Roche Diagnostics, 欧州特許出願公開
EP-A-0 420 260号)などの固相に固定した検出プローブ
と直接ハイブリダイズさせることができる。さらに、検
出すべき核酸を、標識した検出プローブと予めハイブリ
ダイズさせることができ、かかるプロセスで形成された
複合体を、マイクロタイタープレート(PCR-Detection K
it, Roche Diagnostics)などの固相上に捕獲することが
できる。
【０００３】診断手順での検査ストリップの使用は長き
にわたり知られている。例えば、検査ストリップを用い
たアナライトの検出は、主に免疫学的試験法に関する欧
州特許EP-B-0 186 799号、欧州特許EP-B-0 262 328号お
よび欧州特許出願公開EP-A-0926 498号に記載されてい
る。
【０００４】Jouら(Human Mutation 5(1995), 86-93)
は、クロマトグラフ検査ストリップでの核酸検出方法を
記載しており、この方法では、検出すべき核酸にハプテ
ン基を導入して検出すべき核酸の抗ハプテン抗体による
検査ストリップ上への免疫学的固定化を可能にしてい
る。検査ストリップ上の固定化検出プローブに特異的ハ
イブリダイゼーションさせることによる検出すべき核酸
の捕獲は、例えば、米国特許第5,310,650号、欧州特許E
P-B-0 612 354号、Reinhartzら(Gene 136(1993), 221-2
26)およびRuleら(Clin. Chem. 42(1996), 1206-1209)に
記載されている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、検査ス
トリップ上での核酸検出を記載する上記の方法にはいく
つかの欠点がある。例えば、核酸をサンドイッチ複合体
により固定化する場合、感度が低下する。例えば検査容
量を増大させることによる感度の増大は、検出すべき核
酸へのマーカー基の組込みが限定されることにより制限
される。
【０００６】また、前記方法を用いて核酸を直接検出す
るのは不可能である。標的核酸とハイブリダイゼーショ
ンプローブとの複合体を、まず、前工程で形成させる。
この目的のために、標的核酸を変性させ(熱処理または
アルカリ溶液の添加により変性する)、必要に応じて中
和し、プローブを加え、ハイブリダイゼーション条件に
設定する。検査担体上での実際の検出は、この前処理後
にのみ行うことができる。この処理は、試薬を適量に分
けて添加することと装置(例えば加熱装置)を使用するこ
とを含むので、検査ストリップに基づく方法の本質的な
利点、例えば装置に対する要求事項が少ないこと、取り
扱いが簡単なこと、作業工程が少ないこと、訓練してい
ない人がこの方法を行うことが可能であることなどを利
用することができない。さらに、これらの追加の工程に
より汚染のリスクが生じるので、増幅核酸を検出する場
合に偽陽性の結果がもたらされる可能性がある。
【０００７】また、検出すべき核酸と分析エレメント上
のハイブリダイゼーションプローブとの直接ハイブリダ
イゼーションを可能にする方法の場合、従来技術では検
出すべき核酸の前処理を必要としない感度のよい検査手
順は知られていない。つまりこれらの従来技術の手順で
は核酸は直接検出できないか、増幅プロセス後に直接検
出されない。これらの手順では、標的核酸(これは通常2
本鎖の形態で存在する)は、ハイブリダイゼーションの
ために1本鎖コンホメーションに変換される。これにつ
いての方法がいくつか記載されている。例えば、よく知
られたハイブリダイゼーション法によれば、核酸を分析
エレメントに適用する前に、例えば熱処理またはアルカ
リ試薬の添加により完全に変性させている。また標的核
酸の一方の鎖を特異的消化することが可能な酵素的方法
も知られている(Ruleら, ClinicalChemistry 42, 1206-
1209頁(1996))。
【０００８】前処理は、標的核酸がすでに完全に1本鎖
として存在する場合のみ省略することができる。しか
し、このことは通常すでに困難である。なぜならば、リ
ボソーム標的核酸を検出する場合、これらの1本鎖核酸
の天然二次構造の大部分の領域が2本鎖形態(例えばrRN
A)にあるからである。机上の代案は、一方の核酸鎖のみ
の特異的合成を可能にする増幅方法である。例えば、非
対称PCRである。しかしながら、この方法は、線状(line
ar)増幅のために通常のPCR法よりも極めて効率が悪く、
感度がかなり制限され、低濃度でしか存在しないアナラ
イトの検出には不十分である。したがって、従来技術に
おいて知られた、分析エレメント上で検出すべき核酸の
直接ハイブリダイゼーションを可能にする方法も、間接
検出法で見られるのと同じ欠点をもつ。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明の主な利点は、上
述した検出すべき核酸の前処理を省略でき、核酸を分析
エレメントに直接または増幅プロセス後に直接適用でき
るということである。分析エレメントには試薬が含浸さ
れているのが好ましく、この試薬が分析エレメント上で
の標的核酸の完全または部分的変性を可能にし、2本鎖
コンホメーションで適用される核酸のハイブリダイゼー
ションも可能にする。本発明は、このことに対する可能
性をいくつか提供する。例えば、変性試薬は、好ましく
は核酸を完全に変性させるために予め検査担体上に適当
な濃度で乾燥形態にて置くことができる。標的核酸は、
例えばPCR反応溶液に含有させた液体形態にて分析エレ
メントに適用することができる。試薬の溶解後、標的核
酸は完全に変性する。プローブオリゴヌクレオチドへの
ハイブリダイゼーションはこれらの条件下では生じ得な
いので、この化学物質を適切に変更しなければならず、
それと同時にアナライトは、好ましくはクロマトグラフ
ィーにより検査担体を通って移送される。一方、これ
は、適当なクロマトグラフィーバッファーまたは下流に
配置されている試薬により行うことができる。これに
は、塩基、特にNaOHによる変性および酸による中和が好
ましい。あるいは、標的核酸の2本鎖コンホメーション
を不安定化させ(部分的に変性させ)、プローブオリゴヌ
クレオチドへのハイブリダイゼーションを可能にするか
促進するように化学物質を調節することができる。クロ
マトグラフィー中の化学物質の変更は、この変形法には
必要ない。この実施形態に好適な試薬は、カオトロピッ
ク塩であり、特にチオシアン酸グアニジニウム(GuSCN)
が好ましい。
【００１０】プローブオリゴヌクレオチドにハイブリダ
イズした標的核酸を検出するために、さらにその複合体
を標識する必要がある。マーカー基は、事前に実施する
任意の増幅プロセス中に酵素的組込みにより増幅標的核
酸に組み込んでもよく、または別の適切に標識されたプ
ローブオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせること
により標的核酸に結合させてもよい。
【００１１】驚くべきことに、上記の方法を用いると、
分析エレメントに適用される二本鎖形態の標的核酸は、
分析エレメント全体への該標的核酸のクロマトグラフ移
送の間に利用できる時間が非常に短いにもかかわらず、
非常に効率的にプローブオリゴヌクレオチドにハイブリ
ダイズし、高感度で検出できることが分かった。
【００１２】よって、本発明は、試料適用ゾーンと検出
ゾーンとを含み、該試料適用ゾーンから該検出ゾーンへ
の液体移送が可能な分析エレメントにて核酸を検出する
方法であって、検出すべき核酸を含む試料を該試料適用
ゾーンに適用する工程、および該検出ゾーン内で検出プ
ローブとのハイブリダイゼーションにより該核酸を検出
する工程を含んでなり、該検出すべき核酸を該分析エレ
メント上で変性させることを特徴とする方法を提供す
る。
【００１３】「変性」は、本明細書で用いる場合、古典
的な意味での完全な変性と解釈されるのみならず、核酸
の二本鎖がプローブとハイブリダイズし得るのに十分な
程度に不安定化されるプロセスにおける部分的変性も意
図するものである。したがって、二本鎖を完全に分離さ
せる必要はないが、もちろんそのような実施形態も本発
明に含まれる。
【００１４】本発明によれば、検出すべき核酸は、分析
エレメント上で変性され、すなわち、核酸は、分析エレ
メントに変性されていない好ましくは二本鎖の形態で適
用され、分析エレメントに適用された後にはじめて変性
試薬と接触することになる。変性試薬は、試料中の核酸
を変性させるのに十分な量の塩基または／およびカオト
ロピック物質を含み得る。好ましい塩基には、例えば、
アルカリ水酸化物、特にNaOHがある。好ましいカオトロ
ピック物質には、例えば、ヨウ化物、酢酸塩、過塩素酸
塩、チオシアン酸塩、トリフルオロ酢酸塩、トリクロロ
酢酸塩または／およびグアニジニウム化合物がある。特
に好ましいのはチオシアン酸グアニジニウムである。一
方、カオトロピック物質の使用は、二本鎖を不安定化さ
せ、検出すべき核酸と検出プローブとの間のハイブリダ
イゼーションを促進する。さらに重要な機能は、核酸の
特異的な融解点を低下させて室温での特異的ハイブリダ
イゼーションを可能にすることである。
【００１５】このようなカオトロピック物質の作用は、
溶液中でのハイブリダイゼーションに関して既に知られ
ているが(国際公開WO-A-87 06621号, ThompsonおよびGi
llespie, Anal. Biochem. 163(1987), 281-291; Van Ne
ssおよびChen, Nucleic AcidRes. 19(1991), 5143-515
1)、分析エレメントでのハイブリダイゼーションによる
核酸の検出のための本発明の範囲内では初めて利用され
る。この技術の分析エレメントへの応用は、当業者には
自明ではなかった。というのは、従来技術は、1時間程
度のオーダーのハイブリダイゼーション時間を推奨して
いるからである。しかしながら、本発明の分析エレメン
トを用いた場合、試料適用から検出までの検査は、10分
以内に既に完了している。検出プローブとのハイブリダ
イゼーションは、試料の検出ゾーンへのクロマトグラフ
移送中に、プローブと試料が数秒間、場合によっては1
分以下接触しただけで既に生じている。
【００１６】本発明の分析エレメントの本質的な特徴
は、液体が分析エレメント内で試料適用ゾーンから検出
ゾーンに移動し得ることである。液体のそのような流れ
は、例えば、適切に構築された中空体における引力によ
り達成され得る。引力の１つのタイプである遠心力によ
る液体移送を可能にする装置が、例えば欧州特許EP-B-0
052 769に記載されている。しかしながら、本発明の分
析エレメントは、好ましくは、毛管力(capillary forc
e)により液体を移動させ得る吸着材料を含む。本発明の
分析エレメントの個々のゾーンの吸着材料は、この場
合、同一でも異なってもよい。異なるゾーンが最適に機
能するために異なる材料からなる場合が多い。
【００１７】吸着性の毛管力活性のある材料として可能
なものは、例えば、米国特許US-A-4,861,711号、米国特
許US-A-5,591,645号または欧州特許出願公開EP-A-0 291
194号に記載されているような、基本的に、いわゆる
「乾式検査」において液体の取込みに用いられ得るもの
全てである。膜、例えばニトロセルロース膜のような多
孔質材料がこれに都合がよいことが判明した。しかしな
がら、フリース、織物またはメリヤス生地のような繊維
状吸着マトリックス材料を用いることも可能である。特
に好ましいのはフリースである。繊維状マトリックス材
料は、ガラス、セルロース、セルロース誘導体、ポリエ
ステル、ポリアミドを含んでもよく、さらにビスコー
ス、セルウール(cell wool)または／およびポリビニル
アルコールを含んでもよい。例えば、セルロースに基づ
く繊維、ポリエステルおよび／またはポリアミドに基づ
くポリマー繊維ならびに欧州特許EP-B-0 326 135に記載
されているようなOH基および／またはエステル基を有す
る有機結合剤から製造されたフリースが、本発明に用い
られ得る。欧州特許出願0 571 941号に記載されたよう
な溶融コポリエステル繊維、セルロース繊維またはセル
ロース誘導体繊維を含むフリース材料も本発明の分析エ
レメントに用いることができる。ティーバッグ紙などの
紙も簡単に用いることができる。
【００１８】本発明の分析エレメントの取り扱いを改善
するために、吸着性の毛管力活性材料または種々の吸着
性の毛管力活性材料を、液体不透過性であるがマトリッ
クス材料内の液体の流れに悪影響を及ぼさず、分析エレ
メント内で生じる反応に関して不活性に挙動する剛性の
支持担体材料上に配置することができる。例えば、液体
移送を可能にするマトリックス材料が取り付けられたポ
リエステル箔が好ましい支持担体材料であり得る。
【００１９】本発明の分析エレメントにおける個々のゾ
ーンは、上下に重なるように、隣り合わせになるよう
に、一部が上下に重なるように、または一部が隣り合わ
せになるように支持担体材料上に配置することができ
る。本発明の分析エレメントは、試料適用ゾーンおよび
検出ゾーンが支持担体材料上に隣り合わせで位置してい
るのが特に好ましい。この場合、隣り合わせとは、これ
らのゾーンが互いに直接接触しているか、または本質的
に一つの平面内にその他のゾーンで分離された状態で配
置されていることを意味する。
【００２０】試料適用ゾーンは、本発明の分析エレメン
トにおける試料が適用される領域である。検出ゾーン
は、本発明の分析エレメントにおける領域であって、分
析エレメントに適用される試料中に検査すべきアナライ
トまたは該アナライトから誘導される物質もしくは該ア
ナライトを呈示する物質が存在するか否かを測定する領
域である。この測定は、定性的、半定量的または定量的
であり得る。これに関連して、半定量的とは、アナライ
トから誘導された物質またはアナライトを呈示する物質
についての具体的な濃度の値が測定されるのではなく、
アナライトの濃度が位置する濃度範囲を測定することを
意味する。
【００２１】本発明の第1の実施形態では、試料を適用
する前に分析エレメントに変性試薬を含浸させる。変性
試薬は、分析エレメント上、好ましくは試料適用ゾーン
上に液体または乾燥形態で存在し得る。変性試薬は好ま
しくは乾燥形態で存在する。さらなる実施形態では、試
料を適用した後にはじめて分析エレメントに変性試薬を
含浸させる。検出すべき試料に存在する核酸と変性試薬
の接触により、核酸の二本鎖の変性が生じ、生じた核酸
の一本鎖と検出プローブとのハイブリダイゼーションが
可能になる。変性試薬が塩基を含む場合、分析エレメン
トは、試料適用ゾーンと検出ゾーンの間に中和試薬(例
えば、リン酸または硫酸のような液体と接触して酸性反
応する塩)を好ましくは乾燥形態で含んでいることが都
合がよい。
【００２２】試料中に存在する検出すべき核酸の結合に
用いられる検出プローブは、好ましくは、検査条件下で
ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分なほどに
検出すべき核酸と相補的である配列を含むオリゴヌクレ
オチドである。検出プローブは、好ましくはオリゴデオ
キシリボヌクレオチドであるが、検出プローブとして改
変型ヌクレオチド構築ブロックまたはペプチド核酸を含
む核酸類似体を用いることも可能である。検出プローブ
は、好ましくは検出ゾーンに固定された形態で存在す
る。すなわち、検出プローブは、検査条件下で本質的に
検出ゾーンから溶出しない。固定化は、検出プローブを
適用し、次いで、例えば昇温、放射線照射等の適当な方
法で該プローブを固定することにより行い得る。あるい
は、プローブは、検出ゾーンに高アフィニティー相互作
用、例えばビオチン／ストレプトアビジンもしくはアビ
ジンまたはハプテン／抗ハプテン抗体、糖／レクチンに
よって固定されてもよい。適当に改変された、例えばビ
オニチル化検出プローブの調製は、当業者にはよく知ら
れており、ここで詳細に説明する必要はない。あるい
は、検出すべき核酸と検出プローブとの間のハイブリダ
イゼーションは、検出ゾーンの上流側で生じてもよく、
そのハイブリダイゼーション複合体は分析エレメントを
移送中に例えば前記のような高アフィニティー相互作用
により検出ゾーンに選択的に固定化することができる。
【００２３】核酸は、好ましくはマーカー基によって検
出され、基本的に従来技術により知られたマーカー基は
全て適している。酵素標識のような視覚的に検出可能な
マーカー基が好ましいが、特に、金またはラテックス粒
子のような粒状の標識が好ましい。この場合、標識は、
検出すべき核酸に直接位置していてもよいが(直接標
識)、核酸に、例えば上記のような高アフィニティー相
互作用、例えばハプテン／抗ハプテン抗体により間接的
に結合していてもよい(間接標識)。検出すべき核酸への
間接マーカー基の結合は、ハイブリダイゼーション中、
または洗浄工程後に生じ得る。
【００２４】本発明は、検査ストリップ上で核酸を検出
する簡単な方法を提供する。検出すべき核酸は、好まし
くは増幅産物、例えばPCRで産生された増幅産物であ
る。この場合、増幅産物は、増幅反応を行ったバッファ
ー溶液をクロマトグラフィー溶媒として用いて直接検査
ストリップに適用することができる。
【００２５】本発明はさらに、試料適用ゾーンと検出ゾ
ーンとを含み、該試料適用ゾーンから該検出ゾーンへの
液体移送が可能な核酸検出用分析エレメントを提供する
ものであり、該エレメントは核酸の変性試薬で含浸さ
れ、変性試薬は好ましくは乾燥形態で存在する。分析エ
レメントは、クロマトグラフ移送を可能にする吸着材料
を含み得るものであり、好ましくは検査ストリップとし
て構築される。好ましくは、検出すべき核酸に相補的な
検出プローブが分析エレメントの検出ゾーンに固定され
た形態で存在する。
【００２６】最後に、本発明は、本発明の分析エレメン
ト、ならびに核酸を検出するのに必要な追加の試薬、例
えば標識試薬、バッファーなどを含む核酸検出用キット
に関する。
【００２７】本発明により提供される方法、分析エレメ
ントおよび試薬キットは、特に、核酸増幅産物の検出、
例えば試料中の選択された生物または生物の一部(例え
ば細胞)の存在または量を検出するのに適している。こ
の目的のために、例えば、試料中の生物または細胞由来
のリボソームRNAまたはそれをコードするDNA配列の増幅
などにより、試料中の核酸の属特異的および種特異的検
出を行うことができる。この方法を用いて、臨床試料、
食物、水試料等に含まれる微生物、例えば病原性微生物
またはウイルスを検出することができる。さらに、この
方法を法医学的分析に用いて特定の個体を探知すること
もできる。クラミジア・トラコーマ(Chlamydia trachom
atis)由来の核酸の本発明の方法による検出を、下記の
実施例に示す。
【００２８】
【実施例】実施例１ 概念 １．分析エレメントの準備 図１に示した分析エレメントの吸着フリース(1)に、含
浸バッファー(10mMのKPO4、pH7.5、100mMのNaCl、2また
は2.5Mのチオシアン酸グアニジニウム(GuSCN)、0.5%Tri
ton-X100、25mMのNaOH、2%RPLAタイプ4(Roche Diagnost
ics、カタログ番号1726544-106)および3mg/mlニシン精
子DNA)を含浸させた。この目的のために、吸着フリース
をペトリ皿中で含浸バッファーで完全に湿らせて、循環
空気中で45℃にて3時間乾燥した。
【００２９】15mmのニトロセルロース膜を液体移送ゾー
ン(2)として用いた。検出ゾーン(4)を、該膜に検出オリ
ゴヌクレオチドプローブ(40pmol/検査ストリップ)を適
用することにより調製した。このために、オリゴヌクレ
オチドの溶液(200μM)を検出ラインの形態で自動ディス
ペンサー(Hamilton Microlab N)を用いて適用し、オリ
ゴヌクレオチドを膜上に80℃で30分間固定化した。一
方、ビオチン標識オリゴヌクレオチドを、予めポリスト
レプトアビジンでコーティングした検出ゾーン(4)に適
用した。このために、オリゴヌクレオチド溶液(8pmol/
検査ストリップ)をニトロセルロース膜に適用し、10μl
の標準クロマトグラフィーバッファーを用いてポリスト
レプトアビジンで前コーティングした検出ゾーン上でク
ロマトグラフィーによる分離を行った。
【００３０】クラミジア・トラコーマプラスミドpCTT1
(C.トラコーマの塩基1〜7496)由来のpCTT1の354〜374位
に相当する配列(5'-GTC TCT CAT CGA GAC AAA GTG-3')
(配列番号１)を有するオリゴヌクレオチドを、検出プロ
ーブとして用いた(SriprakashおよびMacavoy, Plasmid
18(1987), 205-214)。
【００３１】２．PCRプロトコル オリゴヌクレオチドCP24(5'-GGGATTCCTGTAACAACAAGTCAG
G-3')(配列番号２)(pCTT1の195〜219位)およびCP27(5'-
CCTCTTCCCCAGAACAATAAGAACAC-3')(配列番号３)(pCTT1の
401〜376位)を任意に5'-ビオチニル化形態または5'-ジ
ゴキシゲニル化形態で増幅用のプライマーとして用い
た。
【００３２】反応容量は100μlであった(PCRバッファー
(Roche Diagnosticsカタログ番号1600753)中に、4mMのM
gCl2、それぞれ0.1mMのdNTP、それぞれ300nMのプライマ
ーCP24およびCP27、2.5UのTaqポリメラーゼ、2UのUNG
(ウラシルDNAグリコシラーゼ)ならびに鋳型を加えたも
の)。
【００３３】反応シーケンスは下記のとおりであった： ・37℃で10分間、95℃で5分間、60℃で1分間、 ・95℃、3秒および60℃、6秒を34サイクル、 ・72℃で10分間、 ・50℃に保持 PCR反応は、種々の量の鋳型を用いて行った(０〜100000
プラスミドコピー／混合物)。
【００３４】３．検出 50μlの増幅液(実施例２)を検査ストリップの吸着フリ
ースに適用し、4分間クロマトグラフィーによる分離を
行った。続いて、30μlの標準クロマトグラフィーバッ
ファー(0.15MのNaCl、9.6mMのKH2PO4、40.5mMのK2HP
O4、0.25%のTween 20、2%のRPLAタイプ4、0.09%のアジ
化ナトリウム)を適用し、4分間クロマトグラフィーによ
る分離を行った。その後、20μlの抗ジゴキシゲニン抗
体金コンジュゲート溶液(2.1pmol)を適用し、4分間クロ
マトグラフィーによる分離を行った。次いで、50μlの
標準クロマトグラフィーバッファーを2回適用し、4分間
クロマトグラフィーによる分離を行った。
【００３５】この実験の結果を図２に示す。図2Aは、サ
ンドイッチ様式を用いる免疫学的方法により核酸を検出
する欧州特許出願公開EP-A-0 926 489号の検査ストリッ
プを用いた結果を示す。図2Bには、実施例１の検査スト
リップを用いた本発明の検出方法の結果を示す。図2Aの
検査ストリップを用いた場合は感度が低いが(混合物当
たり1000コピー以上のプラスミドの検出のみ)、本発明
の方法を用いた場合はかなり低いプラスミドコピー数(5
0)の検出でも可能であった。一般に、検出シグナルは、
ΔRem-%が3以上である場合にポジティブであることがわ
かる。高感度であることに加えて、本発明の方法は、か
なり広いダイナミックレンジも有している。すなわち、
検出すべき核酸の濃度範囲が広い場合にもシグナルの有
意な変化をもたらす。
【００３６】実施例２ 図１の分析エレメントを、吸着フリースの含浸バッファ
ーがNaOHを含んでない以外は実施例1.1にしたがって調
製した。0.5M、1.5Mおよび2.5M(飽和限界付近)のグアニ
ジニウム濃度について試験した。
【００３７】50μlのPCR増幅液(100プラスミド／混合
物)を、実施例1.2にしたがって調製した各分析エレメン
トに適用した。検出は、実施例1.3にしたがって行っ
た。
【００３８】結果を図３に示す。チオシアン酸グアニジ
ニウムの添加により有意に検出感度が改善されるという
ことが分かる。
【図面の簡単な説明】
【図１】吸着フリースとして設計された試料適用ゾーン
(1)、液体移送ゾーン(2)、該液体移送ゾーン内に位置す
る検出ゾーン(4)、および吸着フリースとして設計され
た吸着ゾーン(3)を含んでなる、本発明の検査ストリッ
プの概略構造を示す図である。
【図２】本発明の方法(B)と欧州特許出願公開EP-A-0 92
6 498号に記載された方法(A)の感度の比較を示す図であ
る。
【図３】分析エレメントの感度とチオシアン酸グアニジ
ニウム(GuSCN)の濃度との関係を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/543 ５２１ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/566 Ｆ (72)発明者 アンドレアス ローシェール ドイツ連邦共和国 67071 ルドヴィッグ シャッフェン，サミュエル−ハーネマン− ヴェッグ 11 (72)発明者 ヨアチム スタインビス ドイツ連邦共和国 64653 ロルシュ，ア レクサンデールシュトラーセ 21エー (72)発明者 ライネール シュリッフェンバッハール ドイツ連邦共和国 67098 バッド ダー クハイム，シェンケンボールシュトラーセ ９ (72)発明者 ユルゲン クレップ ドイツ連邦共和国 76131 カールスルー, ルドヴィック−ウィルヘルム−シュトラー セ 11

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 試料適用ゾーンと検出ゾーンとを含み、
    該試料適用ゾーンから該検出ゾーンへの液体移送が可能
    な分析エレメントにて核酸を検出する方法であって、 検出すべき核酸を含む試料を該試料適用ゾーンに適用す
    る工程、および該検出ゾーン内で検出プローブとのハイ
    ブリダイゼーションにより該核酸を検出する工程を含ん
    でなり、該検出すべき核酸を該分析エレメント上で変性
    させる、上記方法。
  2. 【請求項２】 前記核酸の変性が、塩基または／および
    カオトロピック物質を含む変性試薬との接触により行わ
    れる、請求項１に記載の方法。
  3. 【請求項３】 前記塩基がアルカリ水酸化物から選択さ
    れ、特にNaOHである、請求項２に記載の方法。
  4. 【請求項４】 前記カオトロピック物質が、ヨウ化物、
    酢酸塩、過塩素酸塩、チオシアン酸塩、トリフルオロ酢
    酸塩、トリクロロ酢酸塩または／およびグアニジニウム
    化合物から選択される、請求項２に記載の方法。
  5. 【請求項５】 カオトロピック物質がチオシアン酸グア
    ニジニウムである、請求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】 前記分析エレメントがクロマトグラフ移
    送を可能にする吸着材料を含む、請求項１〜５のいずれ
    か１項に記載の方法。
  7. 【請求項７】 試料を適用する前に、前記分析エレメン
    トに変性試薬を含浸させる、請求項１〜６のいずれか１
    項に記載の方法。
  8. 【請求項８】 前記変性試薬が分析エレメント上に乾燥
    形態で存在する、請求項７に記載の方法。
  9. 【請求項９】 前記試料適用ゾーンに前記変性試薬を予
    め含浸させる、請求項７または８に記載の方法。
  10. 【請求項１０】 試料を適用した後に、前記分析エレメ
    ントに変性試薬を含浸させる、請求項１〜６のいずれか
    １項に記載の方法。
  11. 【請求項１１】 前記分析エレメントが、前記試料適用
    ゾーンと前記検出ゾーンとの間に中和試薬を含む、請求
    項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 【請求項１２】 前記検出すべき核酸が増幅産物であ
    る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 【請求項１３】 前記検出プローブが前記検出ゾーン内
    に固定された形態で存在する、請求項１〜１２のいずれ
    か１項に記載の方法。
  14. 【請求項１４】 前記核酸がマーカー基により検出され
    る、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 間接マーカー基が用いられる、請求項
    １４に記載の方法。
  16. 【請求項１６】 試料適用ゾーンと検出ゾーンとを含
    み、該試料適用ゾーンから該検出ゾーンへの液体移送が
    可能な核酸検出用分析エレメントであって、核酸の変性
    試薬が含浸されている、上記分析エレメント。
  17. 【請求項１７】 前記変性試薬が乾燥形態で存在する、
    請求項１６に記載の分析エレメント。
  18. 【請求項１８】 クロマトグラフ移送を可能にする吸着
    材料を含む、請求項１６または１７に記載の分析エレメ
    ント。
  19. 【請求項１９】 検査ストリップとして設計されてい
    る、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の分析エレ
    メント。
  20. 【請求項２０】 前記検出ゾーン内に検出すべき核酸に
    相補的な検出プローブを固定化形態で含む、請求項１７
    〜１９のいずれか１項に記載の分析エレメント。
  21. 【請求項２１】 (a) 請求項１６〜２０のいずれか１項
    に記載の分析エレメント、および(b) 核酸を検出するの
    に必要な追加の試薬を含む、核酸検出用キット。
  22. 【請求項２２】 核酸増幅産物を検出するための請求項
    １６〜２０のいずれか１項に記載の分析エレメントまた
    は請求項２１に記載のキットの使用。
  23. 【請求項２３】 試料中の選択された微生物または微生
    物の一部の存在もしくは量を検出するための請求項２２
    に記載の使用。
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